本發(fā)明提供了一種用于快速檢測(cè)耐藥結(jié)核分枝桿菌EmbB基因A233G突變的特異性引物組，屬于耐藥結(jié)核分支桿菌突變技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，主要是結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染導(dǎo)致。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，結(jié)核分枝桿菌感染是傳染病界的頭號(hào)殺手，全球現(xiàn)有結(jié)核病患者約2000萬(wàn)，其中90%左右為肺結(jié)核患者。2014年，兒童約有100萬(wàn)結(jié)核病患者，約14萬(wàn)死亡病例。由此可見，結(jié)核病的發(fā)生和傳染對(duì)全球社會(huì)和經(jīng)濟(jì)造成了嚴(yán)重的影響。

近年來(lái)由于抗結(jié)核藥物的長(zhǎng)期使用及濫用，導(dǎo)致耐藥結(jié)核菌的產(chǎn)生。分為單耐藥結(jié)核、多耐藥結(jié)核（MDR-TB，Multidrug-resistant TB）和泛耐藥結(jié)核（XDR-TB，Extensively drug-resistant TB），單耐藥結(jié)核菌指針對(duì)單一藥物耐受，多耐藥結(jié)核為至少對(duì)異煙肼（Isonicotinic acid hydrazide，INH）、利福平（Rifampicin，RFP）耐藥，泛耐藥結(jié)核為至少對(duì)兩種主要一線抗結(jié)核藥物異煙肼、利福平耐藥外，還對(duì)任何氟喹諾酮類（Quinolones）抗生素產(chǎn)生耐藥，以及三種二線抗結(jié)核注射藥物中的至少一種耐藥。目前研究表明，結(jié)核分枝桿菌基因突變是其產(chǎn)生耐藥性的主要原因。

乙胺丁醇（Ethambutol，EMB）與異煙肼、利福平、吡嗪酰胺（Pyrazinamide， PZA）等屬于一線抗結(jié)核藥物，常聯(lián)用治療結(jié)核病。該藥物可干擾細(xì)胞壁阿拉伯半乳聚糖的合成，抑制細(xì)胞壁阿拉伯聚糖層阿拉伯半乳聚糖和脂質(zhì)阿拉伯甘露聚糖的聚合作用，誘導(dǎo)D-阿拉伯呋喃糖殘基的積累。已經(jīng)證實(shí)結(jié)核分枝桿菌EmbB基因突變可導(dǎo)致乙胺丁醇耐藥，該基因全長(zhǎng)3285 bp，編碼阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶主要成分（阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因Emb 操縱子由EmbA、EmbB、EmbC三部分組成）。Brossier等發(fā)現(xiàn)EmbB基因的306（A916G、A916T、G918S和G918C）和406（G1217C）位氨基酸突變，改變了所編碼酶的結(jié)構(gòu)，由此產(chǎn)生耐藥。EmbB基因第78位密碼子（A233G）突變是我們新發(fā)現(xiàn)的耐乙胺丁醇的突變，之前沒有相關(guān)報(bào)道。

目前市場(chǎng)上已有的結(jié)核分枝桿菌耐乙胺丁醇藥物突變檢測(cè)試劑盒所用方法與本發(fā)明不同，這些試劑盒均以熒光定量PCR技術(shù)或一代測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)，無(wú)論儀器還是試劑，均比普通PCR使用成本高出很多，不適合在常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室及醫(yī)院中推廣使用。等位基因特異PCR（Allele-specific PCR，AS-PCR）方法操作簡(jiǎn)便、快速，所需實(shí)驗(yàn)器材簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)試劑經(jīng)濟(jì)，因此該方法被廣泛的應(yīng)用于DNA突變或單核苷酸多態(tài)性（SNP）的檢測(cè)。本發(fā)明不僅提供了簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的突變檢查方法，還增加了突變的檢查范圍。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速、簡(jiǎn)易、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)耐藥結(jié)核分枝桿菌EmbB基因A233G突變的AS-PCR特異性引物，其中EmbB 233-F EmbB 233G-R是檢測(cè)EmbB基因A233G突變的特異性引物，EmbB 233-F和EmbB 233A-R是檢測(cè)野生型菌株EmbB基因的特異性引物，16S 915-F和16S 1018-R為內(nèi)參引物，引物序列如下：

；

該方法基于AS-PCR的原理，將檢測(cè)突變型引物中的反向引物的3′端設(shè)計(jì)為C，并且在引物3′端第二位引入一個(gè)錯(cuò)配堿基（將堿基G突變成堿基A，形成A/C錯(cuò)配），以增強(qiáng)引物對(duì)突變DNA模板擴(kuò)增的特異性，為確定突變是純合突變或雜合突變，同時(shí)用一對(duì)檢測(cè)野生型樣本的引物進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)野生型引物中的反向引物的3′端第四位引入一個(gè)錯(cuò)配堿基（將堿基A突變成堿基G，形成G/T錯(cuò)配）；同時(shí)，在結(jié)核分枝桿菌16S rRNA的相對(duì)保守的區(qū)域中的915-1018區(qū)段還設(shè)計(jì)了一對(duì)內(nèi)參引物（見上表，16S 915-F/1018-R），用于監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系是否合適及反應(yīng)是否正常進(jìn)行擴(kuò)增。采用上述2對(duì)AS-PCR引物（EmbB 233-F/233G-R和EmbB233-F/233A-R）及一對(duì)內(nèi)參引物對(duì)待測(cè)標(biāo)本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)檢測(cè)突變的引物只能擴(kuò)增出含有突變的樣本，不能擴(kuò)增出野生型的樣本；而設(shè)計(jì)檢測(cè)野生型的引物，只能擴(kuò)增出野生型的樣本，不能擴(kuò)增出含有突變的樣本，并且無(wú)論樣品中是否包含突變，均加入內(nèi)參引物16S 915-F/1018-R，這樣就避免了由于PCR失敗而造成的假陰性的檢測(cè)結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，依據(jù)能否擴(kuò)增出目的片段來(lái)實(shí)現(xiàn)基因突變簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)。

為確定AS-PCR方法檢測(cè)耐乙胺丁醇突變的特異性和靈敏度，選取14個(gè)野生型樣本及所有突變型樣本進(jìn)行引物特異性檢測(cè)，同時(shí)對(duì)所有突變位點(diǎn)構(gòu)建了陽(yáng)性質(zhì)粒，對(duì)不同拷貝數(shù)的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，以確定其靈敏度，并提供本技術(shù)檢測(cè)到的最低水平的突變DNA的技術(shù)參數(shù)。

本發(fā)明利用等位基因特異PCR（Allele-specific PCR，AS-PCR）方法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌在EmbB233位突變位點(diǎn)，具體步驟如下：

（1）DNA提?。菏褂迷噭┖蟹◤慕Y(jié)核分枝桿菌臨床分離株中提取基因組DNA；

（2）以步驟（1）提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)；

PCR反應(yīng)引物：擴(kuò)增引物序列及產(chǎn)物大小見上表；

PCR反應(yīng)體系：總體系為20 μL，包含30 ng基因組DNA，10 μL 2×TSINGKE^TM Master Mix，AS-PCR引物和內(nèi)參引物中的正反向引物各0.5 μM，余下用dd H₂O補(bǔ)齊；

PCR反應(yīng)程序：95℃，預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

（3） PCR產(chǎn)物檢測(cè)：取PCR產(chǎn)物2.5 μL在2 %的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為1×TAE，120 V恒壓電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

（4）靈敏度檢測(cè)

使用構(gòu)建成功的陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板，設(shè)置三個(gè)梯度（即3000、10⁴和10⁵個(gè)拷貝）用以檢測(cè)出本技術(shù)所能檢測(cè)到的最低水平的突變DNA的技術(shù)參數(shù)，并且使用10⁶個(gè)拷貝作為陽(yáng)性對(duì)照；按照與步驟（2）和（3）相同的PCR反應(yīng)體系和程序擴(kuò)增并檢測(cè)。

（5）特異性實(shí)驗(yàn)

本發(fā)明為了驗(yàn)證AS-PCR引物的特異性，隨機(jī)的選擇了14個(gè)野生型樣本對(duì)突變型AS-PCR引物進(jìn)行測(cè)試，并用野生型AS-PCR引物對(duì)所有突變型樣本進(jìn)行檢測(cè)；并且在進(jìn)行每一個(gè)特異性試驗(yàn)中我們都加入了內(nèi)參；將模板按照與步驟（2）和（3）相同的PCR反應(yīng)體系和程序擴(kuò)增并檢測(cè)。

本發(fā)明與其它現(xiàn)有技術(shù)相比，具有快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，儀器設(shè)備要求不高，適合于在大規(guī)模的臨床樣本檢測(cè)中推廣應(yīng)用；本發(fā)明對(duì)于結(jié)核分枝桿菌耐藥性研究中具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明方法的靈敏度檢測(cè)電泳圖譜；

圖2為本發(fā)明方法的特異性實(shí)驗(yàn)電泳圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，實(shí)施例中方法如無(wú)特殊說(shuō)明的采用常規(guī)方法，使用的試劑如無(wú)特殊說(shuō)明的使用常規(guī)市售試劑或按常規(guī)方法配制的試劑。

1、引物設(shè)計(jì)

基于AS-PCR的原理，將檢測(cè)突變型引物中的反向引物的3′端設(shè)計(jì)為C，并且在引物3′端第二位引入一個(gè)錯(cuò)配堿基（將堿基G突變成堿基A，形成A/C錯(cuò)配），以增強(qiáng)引物對(duì)突變DNA模板擴(kuò)增的特異性，為確定突變是純合突變或雜合突變，同時(shí)用一對(duì)檢測(cè)野生型樣本的引物進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)野生型引物中的反向引物的3′端第四位引入一個(gè)錯(cuò)配堿基（將堿基A突變成堿基G，形成G/T錯(cuò)配），擴(kuò)增出大小為151bp的片段；同時(shí)，在結(jié)核分枝桿菌16S rRNA的相對(duì)保守的區(qū)域中的915-1018區(qū)段還設(shè)計(jì)了一對(duì)內(nèi)參引物（16S 915-F/1018-R），并且無(wú)論樣品中是否包含突變，內(nèi)參引物16S 915-F/1018-R都會(huì)擴(kuò)增出一條104 bp的片段。

2、樣本采集

采集經(jīng)測(cè)序證實(shí)攜帶有EmbB233位突變位點(diǎn)的DNA樣本和野生型樣本。

3、樣品基因組DNA提取

使用試劑盒法提取結(jié)核桿菌臨床分離株基因組DNA。

4、PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系：總體系為20 μL，包含30 ng基因組DNA，10 μL 2×TSINGKE^TM Master Mix，AS-PCR引物和內(nèi)參引物中的正反向引物各0.5 μM，余下用dd H₂O補(bǔ)齊；

PCR反應(yīng)程序：95℃，預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；

5、PCR產(chǎn)物檢測(cè)

PCR產(chǎn)物檢測(cè)：取PCR產(chǎn)物2.5 μL在2 %的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為1×TAE，120 V恒壓電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

6、靈敏度檢測(cè)

使用構(gòu)建成功的陽(yáng)性質(zhì)粒作為模板，設(shè)置三個(gè)梯度（即3000、10⁴和10⁵個(gè)拷貝）用以檢測(cè)出本技術(shù)所能檢測(cè)到的最低水平的突變DNA的技術(shù)參數(shù)，并且使用10⁶個(gè)拷貝作為陽(yáng)性對(duì)照。按照與步驟4和5相同的PCR反應(yīng)體系和程序擴(kuò)增并檢測(cè)。

發(fā)明方法進(jìn)行等位基因特異PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌EmbB233位突變位點(diǎn)的靈敏度實(shí)驗(yàn)的電泳結(jié)果（見圖1）。

圖1中，泳道1、3、5、7、9、11、13和15使用含有突變的質(zhì)粒作為模板，泳道2、4、6、8、10、12、14和16使用不含突變的質(zhì)粒作為模板；泳道1、2、5、6、9、10、13和14使用檢測(cè)野生型引物（即EmbB 233-F/ EmbB 233A-R），泳道3、4、7、8、11、12、15和16使用檢測(cè)突變型引物（即EmbB 233-F/ EmbB 233G-R）；泳道1-4的陽(yáng)性質(zhì)?？截悢?shù)為3000，泳道5-8的陽(yáng)性質(zhì)?？截悢?shù)為10⁴，泳道9-12的陽(yáng)性質(zhì)粒拷貝數(shù)為10⁵，泳道13-16的陽(yáng)性質(zhì)?？截悢?shù)為10⁶（即陽(yáng)性對(duì)照）。泳道M為2000 bp的核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道17為陰性對(duì)照（用不含結(jié)核分枝桿菌DNA的dd H₂O作為模板）。

圖1中檢測(cè)野生型的引物只能同野生型樣本共同擴(kuò)增出大小為151bp的條帶，同樣檢測(cè)突變型引物只能同含有相應(yīng)突變型的樣本共同擴(kuò)增出大小為151bp的條帶，與預(yù)期效果相同。模板拷貝數(shù)由低到高時(shí)，可以明顯的看出條帶由微弱到明亮的變化。在3000拷貝數(shù)的質(zhì)粒作為模板時(shí)，條帶同Marker相比，泳道2可以看到稍弱的條帶，而泳道3幾乎看不見條帶，說(shuō)明在3000拷貝數(shù)的質(zhì)粒作為模板時(shí)，檢測(cè)突變的引物進(jìn)行PCR后用瓊脂糖凝膠電泳不能有效檢測(cè)突變，表明檢測(cè)突變型引物在模板量較少的情況下不能有效工作；在10⁴拷貝數(shù)的質(zhì)粒作為模板時(shí)，條帶同Marker相比，泳道6可以看到明顯的條帶，而泳道7可以看到微弱的條帶，說(shuō)明在10⁴拷貝數(shù)的質(zhì)粒作為模板時(shí)，此引物進(jìn)行PCR后用瓊脂糖凝膠電泳可以檢測(cè)突變，但條帶微弱；在10⁵拷貝數(shù)的質(zhì)粒作為模板時(shí)，條帶同Marker相比，泳道10和泳道11均可看到明顯的條帶，說(shuō)明在10⁵拷貝數(shù)的質(zhì)粒作為模板時(shí)，此引物進(jìn)行PCR后用瓊脂糖凝膠電泳可以檢測(cè)突變且條帶明亮。綜上，用于檢測(cè)EmbB A233G的兩對(duì)AS-PCR引物檢測(cè)下線在10⁴個(gè)拷貝數(shù)。

7、特異性實(shí)驗(yàn)

本發(fā)明為了驗(yàn)證AS-PCR引物的特異性，隨機(jī)的選擇了14個(gè)野生型樣本對(duì)AS-PCR引物進(jìn)行測(cè)試，并用野生型AS-PCR引物對(duì)所有突變型樣本進(jìn)行檢測(cè)，并且在進(jìn)行每一個(gè)特異性試驗(yàn)中我們都加入了內(nèi)參；將模板按照與步驟4和5相同的PCR反應(yīng)體系和程序擴(kuò)增并檢測(cè)。

用本發(fā)明方法進(jìn)行等位基因特異PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌EmbB233位突變位點(diǎn)的特異性實(shí)驗(yàn)的電泳結(jié)果（見圖2）。圖2表示用野生型樣本對(duì)檢測(cè)EmbB A233G突變的AS-PCR引物進(jìn)行測(cè)試。

圖2中，泳道1-14使用的均為野生型樣本；A圖使用的是檢測(cè)野生型的AS-PCR引物（即EmbB 233-F/233A-R），而B圖使用的是檢測(cè)突變型的引物（即EmbB 233-F/233G-R）；泳道M為2000bp的核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道15為陰性對(duì)照（用不含結(jié)核分枝桿菌DNA的dd H₂O作為模板）。

圖2-A中，用檢測(cè)野生型AS-PCR引物EmbB 233-F/233A-R對(duì)隨機(jī)挑選的14個(gè)野生型樣本進(jìn)行擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出明亮且大小為151bp的條帶，且內(nèi)參引物均能擴(kuò)增出明亮且大小為104bp的條帶；圖2-B中，用檢測(cè)突變型AS-PCR引物EmbB 233-F/233G-R對(duì)隨機(jī)挑選的14個(gè)野生型樣本進(jìn)行擴(kuò)增，僅有內(nèi)參引物所擴(kuò)增出的條帶；由此，可以得出用于檢測(cè)EmbB A233G的兩對(duì)AS-PCR引物具有良好的特異性。

序列表

<110>昆明理工大學(xué)

<120>用于檢測(cè)耐藥結(jié)核分枝桿菌EmbB基因A233G突變的特異性引物

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 1

gggctgattg gctttgtg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 2

gcacggtggc ggtaaaac 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213>人工合成

<400> 3

gcacggtggc ggtagagt 18

<210>4

<211> 18

<212> DNA

<213>人工合成

<400>4

cgcacaagcg gcggagca 18

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

gccacaaggg aacgcctatc t 21