本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種新的功能基因，尤其涉及一種來(lái)源于食木天牛的功能基因及其表達(dá)產(chǎn)物和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

木質(zhì)纖維素是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的聚合物。木材及大量的農(nóng)業(yè)廢棄物，如小麥和水稻秸稈，其主要成分是木質(zhì)纖維素，他們是地球上最豐富的可生產(chǎn)乙醇的可再生資源。除了生產(chǎn)生物燃料和生物乙醇外，來(lái)源于木質(zhì)纖維素的半纖維素、低聚糖是生產(chǎn)化學(xué)膠片、保護(hù)膠體和動(dòng)物飼料的主要原料；木糖可轉(zhuǎn)化為木糖醇、有機(jī)酸；木質(zhì)素衍生品可以轉(zhuǎn)化為塑料、呋喃、尼龍等。其他可再生能源在未來(lái)可能面臨衰竭，因此，木質(zhì)纖維素是寶貴的可再生資源。

盡管自然界存在著大量的天然植物纖維素，但目前人類所利用的能量中，只有2％是從纖維素轉(zhuǎn)換而來(lái)。提高纖維素的生物能源利用效率的瓶頸是纖維素的降解和糖基化。雖然可以用物理或化學(xué)的方法分解纖維素，但是存在著能量消耗和環(huán)境污染兩大問(wèn)題。因此，人類必須找到一個(gè)既可提高生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率又可減少污染和能源需求的新方案。

在自然界中，可協(xié)同降解纖維素(聚合物β-1,4-glucan)的水解酶是糖苷水解酶家族(glycoside hydrolase families，GHFs)。昆蟲源纖維素酶基因?qū)儆谌齻€(gè)不同的蛋白質(zhì)家族：內(nèi)切葡聚糖酶[(endo-β-1,4-D-glucanase)，EC 3.2.1.4]、外切葡聚糖酶[(exo-1,4-β-D-glucanase)，EC 3.2.1.91]、β-葡聚糖苷酶[(β-1,4-glucosidase)，EC 3.2.1.21,BG]，這三種酶協(xié)同作用可以將纖維素降解成寡糖或單糖。

到目前為止，雖然從真菌、細(xì)菌和原生動(dòng)物中克隆和鑒定出大量的纖維素酶基因，但是從動(dòng)物體內(nèi)克隆出的內(nèi)源性纖維素酶極少。1998年，首次報(bào)道在無(wú)共生菌的動(dòng)物分泌腺體中存在纖維素酶，Watanabe等從白蟻唾液腺中克隆到纖維素酶，Smant等在植物寄生孢囊線蟲中發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性纖維素酶。在無(wú)脊椎動(dòng)物中，一些能消化纖維素的內(nèi)源性纖維素酶(endo-b-1,4-glucanase)基因已被分離和鑒定，如節(jié)肢動(dòng)物(昆蟲、小龍蝦)和線蟲。

植食性昆蟲的內(nèi)源性纖維素酶基因也被克隆與分析，例如：辣根猿葉蟲(Phaedon cochleariae)、白蟻、三化螟甲蟲(Oncideres albomarginata chamela)、馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)、山楊葉甲(Chrysomela tremμLa)、米象(Sitophilus oryzae)、松大小蠹(Dendroctonus ponderosae)的內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶等。

天?？苾?nèi)源性纖維素酶的研究是新的熱點(diǎn)。天牛是木材的主要害蟲，其克隆的纖維素酶家族成員與白蟻的纖維素水解酶不同。天牛幼蟲的消化道的結(jié)構(gòu)不同于白蟻，其相對(duì)較小的后腸表明這類昆蟲在降解纖維素時(shí)，可能是自主的或不依賴共生。大多數(shù)的微生物、白蟻消化死亡或腐爛的植物組織。然而，天牛幼蟲鉆入堅(jiān)硬的活樹(shù)木質(zhì)部，降解尚未分解的纖維素。人類利用新鮮的植物或秸稈合成生物能源，因此對(duì)天?？煞纸鈭?jiān)硬新鮮組織的獨(dú)特的纖維素酶的未來(lái)應(yīng)用特別感興趣。

目前，已報(bào)道了多個(gè)天牛源內(nèi)源性纖維素酶基因，例如：云斑天牛；桑天牛；黃星天牛(Psacothea hilaris beetle)；星天牛等等。

已知昆蟲纖維素酶分為3個(gè)糖基水解酶家族(Glycosyl hydrolase families，GHFs)。分別為GHF 9、GHF 5、GHF 45。已報(bào)道的來(lái)源于GHF 9的endo-1,4-β-glucanases有白蟻，吃木材的蟑螂和蟋蟀；屬于GHF 45有Phaedon cochleariae、Apriona germari.；屬于GHF 5有Psacothea hilaris。GHF 45有1個(gè)非常保守的催化結(jié)構(gòu)域；而GHF 5有2個(gè)非常保守的催化結(jié)構(gòu)域，1個(gè)是質(zhì)子供體區(qū)域，1個(gè)是親核區(qū)域；GHF 9與GHF 5相似，也有2個(gè)非常保守的催化結(jié)構(gòu)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問(wèn)題：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種新的功能基因及其表達(dá)產(chǎn)物，且該表達(dá)產(chǎn)物能夠利用新鮮的植物或秸稈最終合成生物能源，本發(fā)明提供了一種來(lái)源于食木天牛的功能基因及其表達(dá)產(chǎn)物和應(yīng)用。

技術(shù)方案：一種來(lái)源于食木天牛的功能基因，所述基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:1。

優(yōu)選的，所述基因包括3'UTR和一個(gè)978bp編碼325個(gè)氨基酸殘基的完整的開(kāi)放閱讀框。

一種多功能纖維素酶，是由上述功能基因編碼的蛋白，氨基酸序列為SEQ ID NO:2。

優(yōu)選的，所述氨基酸序列中含有1個(gè)假定的N-糖基化位點(diǎn)300-302；其蛋白質(zhì)分子量為37.1kDa，等電點(diǎn)為4.28。

優(yōu)選的，所述多功能纖維素酶含有1個(gè)GHF 5非常保守的潛在質(zhì)子供體156-165和1個(gè)親核試劑246-254。

優(yōu)選的，所述多功能纖維素酶的最適pH為5.0，在pH4.0-8.0的范圍內(nèi)，酶的活性為60％以上；最適pH條件下，其最適反應(yīng)溫度為40℃，在30℃-80℃的范圍內(nèi)，其酶活力為60％以上。

優(yōu)選的，所述多功能纖維素酶具有內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶的活性。

所述的多功能纖維素酶的制備方法，包含以下步驟：

本發(fā)明采用的材料為：云斑天牛(鞘翅目：天?？?在桑園中收集，采用人工飼料飼養(yǎng)；家蠶(商業(yè)名稱：54A)是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所培育、保存；蠶幼蟲在25℃，相對(duì)濕度65％±5％和光周期12光亮:12黑暗的條件下，用鮮桑葉飼養(yǎng)，當(dāng)幼蟲生長(zhǎng)到第五齡起蠶時(shí)，分成幾組注入重組病毒DNA。家蠶BmN細(xì)胞及野生型家蠶核型多角體病毒(BmNPV)為江蘇大學(xué)生命科學(xué)院保存。

(1)獲取目的基因

將云斑天牛中腸經(jīng)冰上解剖后-80℃凍存，采用RNeasy試劑盒(Qiagen公司)提取中腸組織的總RNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度與純度，并將總RNA濃度稀釋到1μg/μL，-80℃保存?zhèn)溆?。以RNA為模板用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、oligo-dT(TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的cDNA。

該基因是來(lái)源于云斑天牛(Batocera horsfieldi)中腸中的屬于糖苷水解酶家族5(glycoside hydrolase families 5，GHF5)的纖維素酶(cellulase)，故命名為Bh-CGHF5。

與已知昆蟲源纖維素酶基因(GenBank登錄號(hào)：AY771358、AB080266、KJ186853)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)保守核苷酸序列設(shè)計(jì)合成目的基因引物，SEQ ID NO:3～5，如表1所示。采用Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit進(jìn)行Bh-CGHF5基因5’、3’-RACE。

根據(jù)5'-RACE、3'-RACE的測(cè)序結(jié)果，對(duì)Bh-CGHF5的全長(zhǎng)核苷酸序列進(jìn)行電子拼接。根據(jù)拼接結(jié)果設(shè)計(jì)合成引物對(duì)，SEQ ID NO:6～7，如表1所示，以云斑天牛Genomic DNA為模板，進(jìn)行目的片段PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)回收、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的快速抽提鑒定按Sambrook方法進(jìn)行。陽(yáng)性克隆菌液送到上海生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如SEQ ID NO:1所示。

表1克隆目的基因的引物

(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒及重組BmNPV病毒

以云斑天牛中腸cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的基因，雙酶切目的片段及pFastBac^TM1質(zhì)粒，回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒篩選、鑒定后，獲得重組質(zhì)粒pFast-BhCGHF5；利用BmNPV/Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建重組Bacmid，陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BmDH10Bac，獲得重組Bacmid DNA；用M13通用引物及特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，確定重組Bacmid構(gòu)建結(jié)果。

(3)重組Bacmid轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞

家蠶卵巢細(xì)胞培養(yǎng)BmN，在含12％胎牛血清(FBS、Gibco，Invitrogen公司)的昆蟲TC-100(Gibco，Invitrogen公司)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染方法參考Invitrogen Cellfectin使用說(shuō)明，在離心管中準(zhǔn)備兩種溶液，A：將Bacmid DNA(1ug)加入100μL無(wú)胎牛血清的TC 100培養(yǎng)基中，B：8μL cellfection試劑溶于100μL無(wú)胎牛血清的TC-100培養(yǎng)基中，混勻后將A、B溶液混合均勻，室溫放置45-60min。加入800μL無(wú)胎牛血清的TC-100培養(yǎng)基，使終體積為1mL。緩慢加入到BmN細(xì)胞(1.0-1.5×10⁶細(xì)胞/35毫米細(xì)胞培養(yǎng)皿)中，27℃培養(yǎng)5h后棄混合液，加入含12％FBS的TC-100培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。4-5天左右后，觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞漲大變圓、有成串融合的趨勢(shì)時(shí)收獲細(xì)胞，離心取上清進(jìn)行次代感染培養(yǎng)，次代(P2)上清液用于注射。

(4)重組桿狀病毒感染家蠶

重組桿狀病毒感染家蠶54A五齡期起蠶，將蠶擱置冰上10min進(jìn)行麻醉，直至其靜止不動(dòng)，將10⁷的重組病毒注入到蠶幼蟲皮下組織，注入30分鐘后用桑葉喂食，在溫度25℃、濕度70％的環(huán)境中飼養(yǎng)，在感染后5-6天內(nèi)收集家蠶血淋巴并存儲(chǔ)在-80℃。

(5)Western blot分析

將在蠶血中表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，采用濕法轉(zhuǎn)膜(100V，60min)將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，TTBS洗滌1次，然后用5％的脫脂奶粉室溫下封閉3h，TTBS洗滌三次，加入帶有His標(biāo)簽的羊抗鼠多克隆抗體[1:10000(v/v)；GenScript,USA]，4℃過(guò)夜，TTBS洗滌3次。再用HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗[1:20000(v/v)；GenScript，USA]室溫孵育1h，TTBS洗三次，TBS洗滌一次，用HRP-DAB顯色試劑盒(Qiagen公司)進(jìn)行顯色。

(6)重組纖維素酶的純化

將His Trap^TM HP親和層析柱接到AKTApurifier 10蛋白層析儀上。首先用10倍柱床體積的EqμLibrium buffer(10mMTris buffer,pH 7.5,250mMNaCl,10％Glycerol)平衡柱子。從-80℃超低溫冰箱中取出蠶血樣品，放室溫融化后超速離心(30×1000g,1h,4℃)取上清加入4倍體積的binding buffer(50mM NaH₂PO₄,300mMNaCl,pH7.5)稀釋后上樣；收集流出液，繼續(xù)用平衡緩沖液洗柱以徹底去除雜蛋白，直至洗滌到基線。使用洗脫緩沖液(終濃度1M咪唑)進(jìn)行線性洗脫(V＝1mL/min，T＝60min，Target＝100％)，2mL一管收集洗脫峰，將僅有一條蛋白條帶的收集管，分裝凍存于-80℃?zhèn)溆?。并通過(guò)SDS-PAGE鑒定純化后的蛋白純度。純化后的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定按Bradford方法進(jìn)行，以牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

所述的多功能纖維素酶在降解CMC-Na、纖維二糖或纖維三糖中的應(yīng)用。

所述的多功能纖維素酶在利用新鮮植物或秸稈為原料合成生物能源中的應(yīng)用。

所述的多功能纖維素酶在合成生物乙醇中的應(yīng)用；其中多功能纖維素酶首先分解木質(zhì)生物質(zhì)生產(chǎn)葡萄糖，進(jìn)而為生物乙醇的合成提供原料。

有益效果：(1)本發(fā)明利用RACE放方法從云斑天牛中克隆出編碼多功能纖維素酶的基因，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析表明，由昆蟲內(nèi)源性的GHF5纖維素酶組成的真核生物組區(qū)別于原核的GHF5纖維素酶組或線蟲GH5纖維素酶組，且相對(duì)于其他家族，該酶能夠消化堅(jiān)韌的新鮮的木質(zhì)纖維素；(2)本發(fā)明所述多功能纖維素酶同時(shí)具有內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶的活性；(3)本發(fā)明所述多功能纖維素酶的單位酶活力為816U/mg；(4)本發(fā)明所述多功能纖維素酶能夠利用新鮮的植物或秸稈為原料合成生物能源，即能夠高效分解木質(zhì)生物質(zhì)生產(chǎn)葡萄糖，進(jìn)而為生物乙醇的合成提供原料。

附圖說(shuō)明

圖1為重組纖維素酶的表達(dá)與純化結(jié)果圖；

其中，A為重組纖維素酶的Western blot結(jié)果圖；B為重組纖維素酶純化后的SDS-PAGE電泳圖；

圖2為Bh-CGHF5在最適溫度條件下，酶活性隨pH值變化圖；

圖3為Bh-CGHF5在最適pH值條件下，酶活性隨溫度變化圖；

圖4為陰陽(yáng)離子對(duì)Bh-CGHF5的影響結(jié)果圖；

圖5為多功能纖維素酶降解糖原的薄層色譜分析檢測(cè)結(jié)果圖；

圖6為纖維素酶三維結(jié)構(gòu)圖；

其中A為Bh-CGHF5酶三維結(jié)構(gòu)圖；B為Ag-EGaseⅢ酶三維結(jié)構(gòu)圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1克隆、測(cè)序、基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育分析

本實(shí)施例采用的材料為：云斑天牛(鞘翅目：天?？?在桑園中收集，采用人工飼料飼養(yǎng)；家蠶(商業(yè)名稱：54A)是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所培育、保存；蠶幼蟲在25℃，相對(duì)濕度65％±5％和光周期12光亮:12黑暗的條件下，用鮮桑葉飼養(yǎng)，當(dāng)幼蟲生長(zhǎng)到第五齡起蠶時(shí)，分成幾組注入重組病毒DNA。家蠶BmN細(xì)胞及野生型家蠶核型多角體病毒(BmNPV)為江蘇大學(xué)生命科學(xué)院保存。

將云斑天牛中腸經(jīng)冰上解剖后-80℃凍存，采用RNeasy試劑盒(Qiagen公司)提取中腸組織的總RNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度與純度，并將總RNA濃度稀釋到1μg/μL，-80℃保存?zhèn)溆?。以RNA為模板用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、oligo-dT(TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄合成相應(yīng)的cDNA。

與已知昆蟲源纖維素酶基因(GenBank登錄號(hào)：AY771358、AB080266、KJ186853)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)保守核苷酸序列設(shè)計(jì)合成目的基因引物，SEQ ID NO:3～5，如表1所示。采用Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit進(jìn)行Bh-CGHF5基因5’、3’-RACE。

根據(jù)5'-RACE、3'-RACE的測(cè)序結(jié)果，對(duì)Bh-CGHF5的全長(zhǎng)核苷酸序列進(jìn)行電子拼接。根據(jù)拼接結(jié)果設(shè)計(jì)合成引物對(duì)，SEQ ID NO:6～7，如表1所示，以云斑天牛Genomic DNA為模板，進(jìn)行目的片段PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)回收、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的快速抽提鑒定按Sambrook方法進(jìn)行。陽(yáng)性克隆菌液送到上海生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如SEQ ID NO:1所示。

表1克隆目的基因的引物

將克隆的Bh-CGHF5基因測(cè)序后，用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似基因或蛋白搜尋。

采用軟件MEGA 4內(nèi)置的Clustal W程序?qū)h-CGHF5的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。經(jīng)比對(duì)的序列采用Gene-Doc顯示序列中的保守位點(diǎn)。

采用MEGA 4程序，用最小進(jìn)化(minimum evolution,ME)算法對(duì)Bh-CGHF5氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，1000個(gè)復(fù)制完成自舉檢驗(yàn)，其它參數(shù)均取默認(rèn)值。

結(jié)果顯示：完整Bh-CGHF5基因是由1015bp組成，包括3'UTR和一個(gè)978bp編碼325個(gè)氨基酸殘基的完整的開(kāi)放閱讀框；Bh-CGHF5的cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列中含有1個(gè)假定的N-糖基化位點(diǎn)300-302(N-T-T)，如圖1所示；預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)分子量為37.1kDa(包含6×His的分子量0.84kDa)，等電點(diǎn)為4.28；具有1個(gè)GHF 5非常保守的潛在質(zhì)子供體156-165(IIYETFNEPT)和1個(gè)親核試劑246-254(PIFVTEYGT)。該基因是來(lái)源于云斑天牛(Batocera horsfieldi)中腸中的屬于糖苷水解酶家族5(glycoside hydrolase families 5，GHF5)的纖維素酶(cellulase)，故命名為Bh-CGHF5。

實(shí)施例2多功能纖維素酶的制備

(1)獲取實(shí)施例1中的Bh-CGHF5基因

(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒及重組BmNPV病毒

以云斑天牛中腸cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的基因，雙酶切目的片段及pFastBac^TM1質(zhì)粒，回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒篩選、鑒定后，獲得重組質(zhì)粒pFast-BhCGHF5；利用BmNPV/Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建重組Bacmid，陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BmDH10Bac，獲得重組Bacmid DNA；用M13通用引物及特異性引物進(jìn)行PCR鑒定，確定重組Bacmid構(gòu)建結(jié)果。

(3)重組Bacmid轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞

家蠶卵巢細(xì)胞培養(yǎng)BmN，在含12％胎牛血清(FBS、Gibco，Invitrogen公司)的昆蟲TC-100(Gibco，Invitrogen公司)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染方法參考Invitrogen Cellfectin使用說(shuō)明，在離心管中準(zhǔn)備兩種溶液，A：將Bacmid DNA(1ug)加入100μL無(wú)胎牛血清的TC 100培養(yǎng)基中，B：8μL cellfection試劑溶于100μL無(wú)胎牛血清的TC-100培養(yǎng)基中，混勻后將A、B溶液混合均勻，室溫放置45-60min。加入800μL無(wú)胎牛血清的TC-100培養(yǎng)基，使終體積為1mL。緩慢加入到BmN細(xì)胞(1.0-1.5×10⁶細(xì)胞/35毫米細(xì)胞培養(yǎng)皿)中，27℃培養(yǎng)5h后棄混合液，加入含12％FBS的TC-100培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。4-5天左右后，觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞漲大變圓、有成串融合的趨勢(shì)時(shí)收獲細(xì)胞，離心取上清進(jìn)行次代感染培養(yǎng)，次代(P2)上清液用于注射。

(4)重組桿狀病毒感染家蠶

重組桿狀病毒感染家蠶54A五齡期起蠶，將蠶擱置冰上10min進(jìn)行麻醉，直至其靜止不動(dòng)，將10⁷的重組病毒注入到蠶幼蟲皮下組織，注入30分鐘后用桑葉喂食，在溫度25℃、濕度70％的環(huán)境中飼養(yǎng)，在感染后5-6天內(nèi)收集家蠶血淋巴并存儲(chǔ)在-80℃。

(5)Western blot分析

將在蠶血中表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后，采用濕法轉(zhuǎn)膜(100V，60min)將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，TTBS洗滌1次，然后用5％的脫脂奶粉室溫下封閉3h，TTBS洗滌三次，加入帶有His標(biāo)簽的羊抗鼠多克隆抗體[1:10000(v/v)；GenScript,USA]，4℃過(guò)夜，TTBS洗滌3次。再用HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗[1:20000(v/v)；GenScript，USA]室溫孵育1h，TTBS洗三次，TBS洗滌一次，用HRP-DAB顯色試劑盒(Qiagen公司)進(jìn)行顯色。

(6)重組纖維素酶的純化

將His Trap^TM HP親和層析柱接到AKTApurifier 10蛋白層析儀上。首先用10倍柱床體積的EqμLibrium buffer(10mMTris buffer,pH 7.5,250mMNaCl,10％Glycerol)平衡柱子。從-80℃超低溫冰箱中取出蠶血樣品，放室溫融化后超速離心(30×1000g,1h,4℃)取上清加入4倍體積的binding buffer(50mM NaH₂PO₄,300mMNaCl,pH7.5)稀釋后上樣；收集流出液，繼續(xù)用平衡緩沖液洗柱以徹底去除雜蛋白，直至洗滌到基線。使用洗脫緩沖液(終濃度1M咪唑)進(jìn)行線性洗脫(V＝1mL/min，T＝60min，Target＝100％)，2mL一管收集洗脫峰，將僅有一條蛋白條帶的收集管，分裝凍存于-80℃?zhèn)溆?。并通過(guò)SDS-PAGE鑒定純化后的蛋白純度。純化后的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定按Bradford方法進(jìn)行，以牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

如圖2中A所示，家蠶血淋巴中表達(dá)的重組Bh-CGHF5蛋白大小為40.0kDa，大于預(yù)測(cè)的分子量。這是因?yàn)橹亟M蛋白都帶有信號(hào)肽，分泌到細(xì)胞外的蛋白經(jīng)翻譯后折疊、糖基化修飾后蛋白質(zhì)分子量增大。如圖2中B所示，采用親和層析方法特異性分離重組蛋白，特異性分離的蛋白質(zhì)分子量大小與純化前的Western blot的結(jié)果相符，表明目標(biāo)蛋白得到純化。用Bradford方法測(cè)定純化后的蛋白質(zhì)濃度，Bh-CGHF5的濃度為0.22mg/mL。

對(duì)制備獲得的多功能纖維素酶的生化特性進(jìn)行檢測(cè)：

(1)最佳pH和最佳溫度

將重組酶加入到2％(W/V)用0.1M乙酸鈉(pH 6.0)溶解的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，Sigma)溶液中，分別在pH2.0-pH12.0的反應(yīng)條件下50℃溫育1h，加入DNS溶液，用分光光度計(jì)檢測(cè)OD540nm，測(cè)得酶活力。

在最適pH條件下，分別在30℃-80℃溫度條件下測(cè)定重組Bh-EGaseⅡ酶的活力。一個(gè)單位酶活性被定義為活動(dòng)產(chǎn)生的每分鐘1還原糖μmol以葡萄糖當(dāng)量。

如圖2和3所示，結(jié)果表明：酶的活性普遍受到pH值、溫度和化學(xué)物質(zhì)的影響，重組Bh-CGHF5酶的最適pH為5.0，在pH4.0-8.0的范圍內(nèi)，酶的活性都在60％以上；在最適pH條件下，該酶最適反應(yīng)溫度為40℃，在30℃-80℃的范圍內(nèi)，其酶活力能維持在60％以上。測(cè)定的重組酶Bh-CGHF5的單位酶活力為816U/mg。

(2)陰陽(yáng)離子對(duì)重組酶的影響

將100μL粗酶稀釋液(1μL蠶血+99μL ddH₂O)加入到200μL溶解了2％CMC的最適pH值緩沖液中，然后，分別加入質(zhì)量濃度為0、3、6、9、12、15、18mg/mL的各種離子緩沖液(Na⁺，K⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Cl^-，SO₄^2-，PO₄^3-)，50℃預(yù)熱5min，反應(yīng)60min，540nm測(cè)吸光值。

如圖4所示：結(jié)果表明：Na⁺對(duì)Bh-CGHF5的酶活性幾乎沒(méi)有影響，而3mg/mL的K⁺是Bh-CGHF5的一個(gè)抑制點(diǎn)，相對(duì)酶活僅為84.4％。

二價(jià)金屬陽(yáng)離子(Co²⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Cu²⁺)對(duì)酶的活性影響呈現(xiàn)鐘罩型，低濃度促進(jìn)酶活性，高濃度抑制酶活性，其中高濃度的Cu²⁺的抑制作用最強(qiáng)。

為了避開(kāi)陽(yáng)離子的影響，選用對(duì)酶活性影響最小的Na⁺與Cl-、SO₄^2-、PO₄^3-組成的鹽進(jìn)行測(cè)試，從圖中可知SO₄^2-對(duì)纖維素酶活性的影響程度大于PO₄^3-，對(duì)Bh-EGase III均有抑制作用。Cl^-對(duì)其基本沒(méi)有影響。

實(shí)施例3多功能纖維素酶降解糖原

采用實(shí)施例2制備獲得的多功能纖維素酶降解纖維二糖、纖維三糖、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)。水解溶液和標(biāo)準(zhǔn)品(葡萄糖G1、纖維二糖G2、纖維三糖G3)經(jīng)展開(kāi)劑展開(kāi)后，用5％硫酸乙醇顯色，結(jié)果如圖5所示，Bh-EGase III可以降解CMC-Na、纖維二糖、纖維三糖生成相應(yīng)的低聚糖及葡萄糖，說(shuō)明Bh-EGase III具有內(nèi)切、外切葡聚糖酶以及β-葡聚糖苷酶活性。

實(shí)施例4多功能纖維素酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)

將Bh-CGHF5和Ag-EGaseⅢ進(jìn)行蛋白質(zhì)同源比對(duì)及三維結(jié)構(gòu)建模參照纖維弧菌屬的甘露糖苷酶。從圖6中可知：在上述兩個(gè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖中，無(wú)論是α螺旋還是β折疊，其形狀、位置都非常相近。酶的潛在的質(zhì)子供體和親核試劑組成催化核心區(qū)，3個(gè)核心區(qū)口徑大小不同，其中，Ag-EGaseⅢ口徑大，而Bh-CGHF5口徑小，這可能是影響酶活性的主要因素，也與測(cè)定的各個(gè)酶的單位酶活力大小相一致，Ag-EGaseⅢ的單位酶活力為1037U/mg。

SEQUENCE LISTING

<110> 江蘇科技大學(xué)

<120> 一種來(lái)源于食木天牛的功能基因及其表達(dá)產(chǎn)物和應(yīng)用

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1040

<212> DNA

<213> 云斑天牛

<400> 1

atgaagttcg tacttgctct tatcggtctg gtgctagcct gctcagtcga cgtttctgta 60

tccaaagatg cggctcttga gaccgtcagt aaacacggtc aattgtctct gcaaggtgtc 120

gacctcgtcg atgaaaacgg agagaggatt caattgaaag gtatgtccct gttctgggat 180

gtttggatgc ctcagtacta caacaaggag tctgtcgatg gaatccacaa attgtgccac 240

tccaacgtcg tccgagcagc tatatctgtg gaaaccgaat acgacggagg atacattgaa 300

acccctgagg atagcttgga aagactgtac gctgttgtcg atgccgcaat tgaagacgat 360

atctacgtaa tcattgactg gcacgatcat gaagccgaca agcatctcaa ttactctctt 420

gaattctttg acattgtgtc taagaagtac agtggtgtac caaacatcat ctacgaaacc 480

tttaacgaac ccacttcaca atcatggaat gatgttctta aaccctacca cgaagctgtg 540

atcgacgcca tccgcgccaa cgatcctgac aacatcatcg tcgtaggtac accaacctgg 600

tctcaatccg tcgaccaagc tgcttccaac cccatcaccg gccagaagaa cattatgtac 660

accctccact tctacgctgg tacccacaaa caatggctca gagacaccgc caccaacgcc 720

ttgaacaacg gaattcccat cttcgtaact gaatatggta ctgtgaacgc tgacgctacc 780

gatcccatcg acgaagacga atctcgcttg tggtgggcct ggttagatga acactatatc 840

tcttatgcca actgggccat ttccgacaaa ctggaaggcg cttctgtgtt ggtagctaac 900

actaccgctg ctgaggtatg ccaagaagaa ttccttactg attctggaaa actcgtagtt 960

gctcagaaca aagcttaaat ttctgtatat cctaaataaa gtttgttaag atttaaaaaa 1020

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1040

<210> 2

<211> 325

<212> PRT

<213> 云斑天牛

<400> 2

Met Lys Phe Val Leu Ala Leu Ile Gly Leu Val Leu Ala Cys Ser Val

1 5 10 15

Asp Val Ser Val Ser Lys Asp Ala Ala Leu Glu Thr Val Ser Lys His

20 25 30

Gly Gln Leu Ser Leu Gln Gly Val Asp Leu Val Asp Glu Asn Gly Glu

35 40 45

Arg Ile Gln Leu Lys Gly Met Ser Leu Phe Trp Asp Val Trp Met Pro

50 55 60

Gln Tyr Tyr Asn Lys Glu Ser Val Asp Gly Ile His Lys Leu Cys His

65 70 75 80

Ser Asn Val Val Arg Ala Ala Ile Ser Val Glu Thr Glu Tyr Asp Gly

85 90 95

Gly Tyr Ile Glu Thr Pro Glu Asp Ser Leu Glu Arg Leu Tyr Ala Val

100 105 110

Val Asp Ala Ala Ile Glu Asp Asp Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His

115 120 125

Asp His Glu Ala Asp Lys His Leu Asn Tyr Ser Leu Glu Phe Phe Asp

130 135 140

Ile Val Ser Lys Lys Tyr Ser Gly Val Pro Asn Ile Ile Tyr Glu Thr

145 150 155 160

Phe Asn Glu Pro Thr Ser Gln Ser Trp Asn Asp Val Leu Lys Pro Tyr

165 170 175

His Glu Ala Val Ile Asp Ala Ile Arg Ala Asn Asp Pro Asp Asn Ile

180 185 190

Ile Val Val Gly Thr Pro Thr Trp Ser Gln Ser Val Asp Gln Ala Ala

195 200 205

Ser Asn Pro Ile Thr Gly Gln Lys Asn Ile Met Tyr Thr Leu His Phe

210 215 220

Tyr Ala Gly Thr His Lys Gln Trp Leu Arg Asp Thr Ala Thr Asn Ala

225 230 235 240

Leu Asn Asn Gly Ile Pro Ile Phe Val Thr Glu Tyr Gly Thr Val Asn

245 250 255

Ala Asp Ala Thr Asp Pro Ile Asp Glu Asp Glu Ser Arg Leu Trp Trp

260 265 270

Ala Trp Leu Asp Glu His Tyr Ile Ser Tyr Ala Asn Trp Ala Ile Ser

275 280 285

Asp Lys Leu Glu Gly Ala Ser Val Leu Val Ala Asn Thr Thr Ala Ala

290 295 300

Glu Val Cys Gln Glu Glu Phe Leu Thr Asp Ser Gly Lys Leu Val Val

305 310 315 320

Ala Gln Asn Lys Ala

325

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acgaaacctt taacgaaccc act 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtcaggatcg ttggcgcgga t 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atcacagctt cgtggtaggg tt 22

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcgggatcca tgaagttcgt acttgctctt at 32

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtctctagat tagtgatggt gatggtgatg agctttgttc tgagcaacta c 51