本發(fā)明屬于生物醫(yī)用高分子材料領(lǐng)域，涉及新型仿抗菌肽聚合物的設(shè)計合成方法，具體涉及一種陽離子手性氨基酸甲基丙烯酸酯聚合物的制備及其抗菌應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，抗生素耐藥菌的出現(xiàn)已經(jīng)給公共健康衛(wèi)生帶來了極大的威脅，細菌的粘附、增殖和形成的生物膜會導(dǎo)致患者感染并引發(fā)一系列并發(fā)癥甚至危及患者生命。盡管可替代的新型抗菌聚合物的研究已經(jīng)取得一定進展，但是其在生物醫(yī)用和臨床應(yīng)用上仍然存在極大的挑戰(zhàn)。可替代的新型抗菌聚合物不僅要具有高效的抗菌性能，同時不能影響到機體組織正常的生理作用，簡單來說即能夠選擇性的殺滅細菌而對正常的哺乳動物細胞無毒性。因此，兼具高效抗菌活性與選擇性的抗菌聚合物仍然有待研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是制備一種基于手性氨基酸的陽離子型聚甲基丙烯酸酯聚合物，并研究其在抗菌方面的應(yīng)用，以克服現(xiàn)有抗菌聚合物抗菌活性較弱、生物相容性較差的缺點。

本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

l-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物，即p(l-leu-hema)，以單體d-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，分子式示意結(jié)構(gòu)如下：

n為聚合度，聚合物的數(shù)均分子量為10-23kda，分子量分布系數(shù)為1.10-1.25。

上述均聚物的制備方法，將單體l-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，以二硫代苯甲酸-4-氰基戊酸為鏈轉(zhuǎn)移劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑進行raft聚合，單體l-亮氨酸甲基丙烯酸酯、鏈轉(zhuǎn)移劑和引發(fā)劑的投料摩爾比為(45—60)：1：0.2，優(yōu)選(50—60)：1：0.2。

在上述技術(shù)方案中，在惰性氣體(氮氣、氦氣或者氬氣)保護下進行，反應(yīng)溫度為60—80攝氏度，反應(yīng)時間為6-10小時，溶劑n，n-二甲基甲酰胺提供反應(yīng)氛圍和環(huán)境。

在上述技術(shù)方案中，單體l-亮氨酸甲基丙烯酸酯按照下述步驟進行制備：將l-亮氨酸和甲基丙烯酸羥乙酯以4-二甲氨基吡啶為催化劑，n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺為脫水縮合劑，以二氯甲烷為溶劑在冰水浴中反應(yīng)30-60分鐘，再于室溫20—25攝氏度下攪拌反應(yīng)24-48小時，其中l(wèi)-亮氨酸、4-二甲氨基吡啶、n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺和甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為5：(0.2—0.25)：(4—5)：(2—3)，l-亮氨酸為叔丁氧羰基保護的l-亮氨酸。

在上述技術(shù)方案中，制備的均聚物在三氟乙酸作用下進行脫保護，優(yōu)選將均聚物溶于二氯甲烷中，在三氟乙酸作用下，于20—25攝氏度下進行脫保護反應(yīng)2—4小時，純化后溶解透析，冷凍干燥即可。

由于采用三氟乙酸作用，脫保護反應(yīng)后的聚合物中帶有三氟乙酸集團，由于leu的等電點為ph6.01，lys的等電點為ph9.60，調(diào)節(jié)ph為7.2時，leu的-nh3⁺發(fā)生去質(zhì)子化，生成-nh2，如下化學(xué)式所示：

d-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物，即p(d-leu-hema)，以單體d-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，分子式示意結(jié)構(gòu)如下，n為聚合度，聚合物的數(shù)均分子量為10-23kda，分子量分布系數(shù)為1.10-1.25。

上述均聚物的制備方法，將單體d-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，以二硫代苯甲酸-4-氰基戊酸為鏈轉(zhuǎn)移劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑進行raft聚合，單體d-亮氨酸甲基丙烯酸酯、鏈轉(zhuǎn)移劑和引發(fā)劑的投料摩爾比為(45—60)：1：0.2，優(yōu)選(50—60)：1：0.2。

在上述技術(shù)方案中，在惰性氣體(氮氣、氦氣或者氬氣)保護下進行，反應(yīng)溫度為60—80攝氏度，反應(yīng)時間為6-10小時，溶劑n，n-二甲基甲酰胺提供反應(yīng)氛圍和環(huán)境。

在上述技術(shù)方案中，單體d-亮氨酸甲基丙烯酸酯按照下述步驟進行制備：將d-亮氨酸和甲基丙烯酸羥乙酯以4-二甲氨基吡啶為催化劑，n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺為脫水縮合劑，以二氯甲烷為溶劑在冰水浴中反應(yīng)30-60分鐘，再于室溫20—25攝氏度下攪拌反應(yīng)24-48小時，其中d-亮氨酸、4-二甲氨基吡啶、n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺和甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為5：(0.2—0.25)：(4—5)：(2—3)，d-亮氨酸為叔丁氧羰基保護的d-亮氨酸。

在上述技術(shù)方案中，制備的均聚物在三氟乙酸作用下進行脫保護，優(yōu)選將均聚物溶于二氯甲烷中，在三氟乙酸作用下，于20—25攝氏度下進行脫保護反應(yīng)2—4小時，純化后溶解透析，冷凍干燥即可。

由于采用三氟乙酸作用，脫保護反應(yīng)后的聚合物中帶有三氟乙酸集團，由于leu的等電點為ph6.01，lys的等電點為ph9.60，調(diào)節(jié)ph為7.2時，leu的-nh3⁺發(fā)生去質(zhì)子化，生成-nh2，如下化學(xué)式所示：

l-賴氨酸甲基丙烯酸酯均聚物，即p(l-lys-hema)，以單體l-賴氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，分子式示意結(jié)構(gòu)如下，n為聚合度，聚合物的數(shù)均分子量為10-23kda，分子量分布系數(shù)為1.10-1.25。

上述均聚物的制備方法，將單體l-賴氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，以二硫代苯甲酸-4-氰基戊酸為鏈轉(zhuǎn)移劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑進行raft聚合，單體l-賴氨酸甲基丙烯酸酯、鏈轉(zhuǎn)移劑和引發(fā)劑的投料摩爾比為(45—60)：1：0.2，優(yōu)選(50—60)：1：0.2。

在上述技術(shù)方案中，在惰性氣體(氮氣、氦氣或者氬氣)保護下進行，反應(yīng)溫度為60—80攝氏度，反應(yīng)時間為6-10小時，溶劑n，n-二甲基甲酰胺提供反應(yīng)氛圍和環(huán)境。

在上述技術(shù)方案中，單體l-賴氨酸甲基丙烯酸酯按照下述步驟進行制備：將l-賴氨酸和甲基丙烯酸羥乙酯以4-二甲氨基吡啶為催化劑，n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺為脫水縮合劑，以二氯甲烷為溶劑在冰水浴中反應(yīng)30-60分鐘，再于室溫20—25攝氏度下攪拌反應(yīng)24-48小時，其中l(wèi)-賴氨酸、4-二甲氨基吡啶、n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺和甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為5：(0.2—0.25)：(4—5)：(2—3)，l-賴氨酸為叔丁氧羰基保護的l-賴氨酸。

在上述技術(shù)方案中，制備的均聚物在三氟乙酸作用下進行脫保護，優(yōu)選將均聚物溶于二氯甲烷中，在三氟乙酸作用下，于20—25攝氏度下進行脫保護反應(yīng)2—4小時，純化后溶解透析，冷凍干燥即可。

由于采用三氟乙酸作用，脫保護反應(yīng)后的聚合物中帶有三氟乙酸集團，調(diào)節(jié)ph為7.2，lys不受影響，如下化學(xué)式所示：

d-賴氨酸甲基丙烯酸酯均聚物，即p(d-leu-hema)，以單體d-賴氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，分子式示意結(jié)構(gòu)如下，n為聚合度，聚合物的數(shù)均分子量為10-23kda，分子量分布系數(shù)為1.10-1.25。

上述均聚物的制備方法，將單體d-賴氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，以二硫代苯甲酸-4-氰基戊酸為鏈轉(zhuǎn)移劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑進行raft聚合，單體d-賴氨酸甲基丙烯酸酯、鏈轉(zhuǎn)移劑和引發(fā)劑的投料摩爾比為(45—60)：1：0.2，優(yōu)選(50—60)：1：0.2。

在上述技術(shù)方案中，在惰性氣體(氮氣、氦氣或者氬氣)保護下進行，反應(yīng)溫度為60—80攝氏度，反應(yīng)時間為6-10小時，溶劑n，n-二甲基甲酰胺提供反應(yīng)氛圍和環(huán)境。

在上述技術(shù)方案中，單體d-賴氨酸甲基丙烯酸酯按照下述步驟進行制備：將d-賴氨酸和甲基丙烯酸羥乙酯以4-二甲氨基吡啶為催化劑，n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺為脫水縮合劑，以二氯甲烷為溶劑在冰水浴中反應(yīng)30-60分鐘，再于室溫20—25攝氏度下攪拌反應(yīng)24-48小時，其中d-賴氨酸、4-二甲氨基吡啶、n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺和甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為5：(0.2—0.25)：(4—5)：(2—3)，d-賴氨酸為叔丁氧羰基保護的d-賴氨酸。

在上述技術(shù)方案中，制備的均聚物在三氟乙酸作用下進行脫保護，優(yōu)選將均聚物溶于二氯甲烷中，在三氟乙酸作用下，于20—25攝氏度下進行脫保護反應(yīng)2—4小時，純化后溶解透析，冷凍干燥即可。

由于采用三氟乙酸作用，脫保護反應(yīng)后的聚合物中帶有三氟乙酸集團，調(diào)節(jié)ph為7.2，lys不受影響，如下化學(xué)式所示：

d-陽離子手性氨基酸甲基丙烯酸酯共聚物，以單體d-賴氨酸甲基丙烯酸酯和d-亮氨酸甲基丙烯酸酯進行嵌段共聚制備，分子式示意結(jié)構(gòu)如下，n，m為各自單體的聚合度，m/n為(0.8—1.2)，優(yōu)選兩種單體的聚合度一致m＝n，聚合物的數(shù)均分子量為10-23kda，分子量分布系數(shù)為1.10-1.25。

上述共聚物的制備方法，按照下述步驟進行制備：

步驟1.將第一d型氨基酸單體進行均聚，以二硫代苯甲酸-4-氰基戊酸為鏈轉(zhuǎn)移劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑進行raft聚合以得到d構(gòu)型氨基酸單體聚合物，所述第一d型氨基酸單體、鏈轉(zhuǎn)移劑和引發(fā)劑的投料摩爾比為(45—60)：1：0.2，優(yōu)選(50—60)：1：0.2；

步驟2，步驟1制備的d構(gòu)型氨基酸單體聚合物大分子鏈轉(zhuǎn)移劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，加入第二d型氨基酸單體進行raft聚合以得到d-賴氨酸甲基丙烯酸酯和d-亮氨酸甲基丙烯酸酯嵌段共聚物，第二d型氨基酸單體、大分子鏈轉(zhuǎn)移劑和引發(fā)劑的投料摩爾比為(80—100)：1：0.2，優(yōu)選(85—90)：1：0.2。

在上述技術(shù)方案中，在步驟1中，在惰性氣體(氮氣、氦氣或者氬氣)保護下進行，反應(yīng)溫度為60—80攝氏度，反應(yīng)時間為6-10小時，溶劑n，n-二甲基甲酰胺提供反應(yīng)氛圍和環(huán)境。

在上述技術(shù)方案中，在步驟2中，在惰性氣體(氮氣、氦氣或者氬氣)保護下進行，反應(yīng)溫度為60—80攝氏度，反應(yīng)時間為6-10小時，溶劑n，n-二甲基甲酰胺提供反應(yīng)氛圍和環(huán)境。

在上述技術(shù)方案中，單體d-賴氨酸甲基丙烯酸酯按照下述步驟進行制備：將d-賴氨酸和甲基丙烯酸羥乙酯以4-二甲氨基吡啶為催化劑，n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺為脫水縮合劑，以二氯甲烷為溶劑在冰水浴中反應(yīng)30-60分鐘，再于室溫20—25攝氏度下攪拌反應(yīng)24-48小時，其中d-賴氨酸、4-二甲氨基吡啶、n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺和甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為5：(0.2—0.25)：(4—5)：(2—3)，d-賴氨酸為叔丁氧羰基保護的d-賴氨酸。

在上述技術(shù)方案中，單體d-亮氨酸甲基丙烯酸酯按照下述步驟進行制備：將d-亮氨酸和甲基丙烯酸羥乙酯以4-二甲氨基吡啶為催化劑，n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺為脫水縮合劑，以二氯甲烷為溶劑在冰水浴中反應(yīng)30-60分鐘，再于室溫20—25攝氏度下攪拌反應(yīng)24-48小時，其中d-亮氨酸、4-二甲氨基吡啶、n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺和甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為5：(0.2—0.25)：(4—5)：(2—3)，d-亮氨酸為叔丁氧羰基保護的d-亮氨酸。

在上述技術(shù)方案中，制備的共聚物在三氟乙酸作用下進行脫保護，優(yōu)選將共聚物溶于二氯甲烷中，在三氟乙酸作用下，于20—25攝氏度下進行脫保護反應(yīng)2—4小時，純化后溶解透析，冷凍干燥即可。

由于采用三氟乙酸作用，脫保護反應(yīng)后的聚合物中帶有三氟乙酸集團，由于leu的等電點為ph6.01，lys的等電點為ph9.60，調(diào)節(jié)ph為7.2時，leu的-nh3⁺發(fā)生去質(zhì)子化，生成-nh2，調(diào)節(jié)ph為7.2，lys不受影響，如下化學(xué)式所示：

l-陽離子手性氨基酸甲基丙烯酸酯共聚物，以單體l-賴氨酸甲基丙烯酸酯和l-亮氨酸甲基丙烯酸酯進行嵌段共聚制備，分子式示意結(jié)構(gòu)如下，n，m為各自單體的聚合度，m/n為(0.8—1.2)，優(yōu)選兩種單體的聚合度一致m＝n，聚合物的數(shù)均分子量為10-23kda，分子量分布系數(shù)為1.10-1.25。

上述共聚物的制備方法，按照下述步驟進行制備：

步驟1.將第一l型氨基酸單體進行均聚，以二硫代苯甲酸-4-氰基戊酸為鏈轉(zhuǎn)移劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑進行raft聚合以得到d構(gòu)型氨基酸單體聚合物，所述第一l型氨基酸單體、鏈轉(zhuǎn)移劑和引發(fā)劑的投料摩爾比為(45—60)：1：0.2，優(yōu)選(50—60)：1：0.2；

步驟2，步驟1制備的l構(gòu)型氨基酸單體聚合物大分子鏈轉(zhuǎn)移劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，加入第二l型氨基酸單體進行raft聚合以得到l-賴氨酸甲基丙烯酸酯和l-亮氨酸甲基丙烯酸酯嵌段共聚物，第二l型氨基酸單體、大分子鏈轉(zhuǎn)移劑和引發(fā)劑的投料摩爾比為(80—100)：1：0.2，優(yōu)選(85—90)：1：0.2。

在上述技術(shù)方案中，在步驟1中，在惰性氣體(氮氣、氦氣或者氬氣)保護下進行，反應(yīng)溫度為60—80攝氏度，反應(yīng)時間為6-10小時，溶劑n，n-二甲基甲酰胺提供反應(yīng)氛圍和環(huán)境。

在上述技術(shù)方案中，在步驟2中，在惰性氣體(氮氣、氦氣或者氬氣)保護下進行，反應(yīng)溫度為60—80攝氏度，反應(yīng)時間為6-10小時，溶劑n，n-二甲基甲酰胺提供反應(yīng)氛圍和環(huán)境。

在上述技術(shù)方案中，單體l-賴氨酸甲基丙烯酸酯按照下述步驟進行制備：將l-賴氨酸和甲基丙烯酸羥乙酯以4-二甲氨基吡啶為催化劑，n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺為脫水縮合劑，以二氯甲烷為溶劑在冰水浴中反應(yīng)30-60分鐘，再于室溫20—25攝氏度下攪拌反應(yīng)24-48小時，其中l(wèi)-賴氨酸、4-二甲氨基吡啶、n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺和甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為5：(0.2—0.25)：(4—5)：(2—3)，l-賴氨酸為叔丁氧羰基保護的l-賴氨酸。

在上述技術(shù)方案中，單體l-亮氨酸甲基丙烯酸酯按照下述步驟進行制備：將l-亮氨酸和甲基丙烯酸羥乙酯以4-二甲氨基吡啶為催化劑，n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺為脫水縮合劑，以二氯甲烷為溶劑在冰水浴中反應(yīng)30-60分鐘，再于室溫20—25攝氏度下攪拌反應(yīng)24-48小時，其中l(wèi)-亮氨酸、4-二甲氨基吡啶、n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺和甲基丙烯酸羥乙酯的質(zhì)量比為5：(0.2—0.25)：(4—5)：(2—3)，l-亮氨酸為叔丁氧羰基保護的l-亮氨酸。

在上述技術(shù)方案中，制備的共聚物在三氟乙酸作用下進行脫保護，優(yōu)選將共聚物溶于二氯甲烷中，在三氟乙酸作用下，于20—25攝氏度下進行脫保護反應(yīng)2—4小時，純化后溶解透析，冷凍干燥即可。

由于采用三氟乙酸作用，脫保護反應(yīng)后的聚合物中帶有三氟乙酸集團，由于leu的等電點為ph6.01，lys的等電點為ph9.60，調(diào)節(jié)ph為7.2時，leu的-nh3⁺發(fā)生去質(zhì)子化，生成-nh2，調(diào)節(jié)ph為7.2，lys不受影響，如下化學(xué)式所示：

本發(fā)明提供一種調(diào)控共聚物整體構(gòu)型的方法，即采用d構(gòu)型和l構(gòu)型的單體進行共聚，通過d型/l型單體的投料比例，變更兩者之間的摩爾比，以使共聚物表現(xiàn)為d型或者l型，即可控活性聚合在調(diào)控亮氨酸—賴氨酸甲基丙烯酸酯共聚物手性中的應(yīng)用。

利用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合方法通過d型/l型單體的投料比例，變更兩者之間的摩爾比，以使共聚物表現(xiàn)為d型或者l型，即通過d型和l型單體的投料比例，變更共聚物中d型單體和l型單體之間的摩爾比，以使共聚物整體表現(xiàn)為d型或者l型。

就上述四種單體而言，均聚得到的聚合物表現(xiàn)出與相應(yīng)單體一致的d和l構(gòu)型，兩個l型單體共聚得到的共聚物表現(xiàn)為l型，兩個d型單體共聚得到的共聚物表現(xiàn)為d型，共聚物采用d型和l型單體進行共聚，調(diào)整d型單體和l型單體的相對數(shù)量，即可實現(xiàn)共聚物整體構(gòu)型表現(xiàn)的可調(diào)控。

在本發(fā)明技術(shù)方案中，采用活性聚合可實現(xiàn)添加物料(即單體摩爾比例)的控制，反應(yīng)條件溫和，合成單體產(chǎn)率為70％-85％，聚合反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為50％-90％，均聚物和共聚物的分子量可控且分布系數(shù)較窄。

本發(fā)明公布了基于手性氨基酸甲基丙烯酸酯聚合物及其制備方法和抗菌應(yīng)用。圓二色光譜表征結(jié)果證明上述制得l構(gòu)型和d構(gòu)型聚合物具有相反的二級螺旋結(jié)構(gòu)。微稀釋法抗菌實驗研究表明，上述所得透析凍干后基于手性氨基酸的甲基丙烯酸酯聚合物的最低抑菌濃度(mic)為100～1000μg·ml^-1，表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌性能，場發(fā)射掃描電鏡結(jié)果圖直觀的展現(xiàn)出本發(fā)明制得的抗菌聚合物能夠明顯的破壞細菌膜結(jié)構(gòu)引起細菌的死亡；溶血實驗和體外平滑肌細胞相容性實驗表明，本發(fā)明制備的陽離子手性氨基酸甲基丙烯酸酯抗菌聚合物在抗菌所需濃度下仍可以保持顯著的生物相容性，其中溶血率低于10％，平滑肌細胞活性可達到80％以上。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(raft)的聚合機理示意圖。

圖2是本發(fā)明中單體d-leu(boc)-hema在cdcl3中的¹h-nmr譜圖。

圖3是本發(fā)明中單體d-lys(boc)-hema在cdcl3中的¹h-nmr譜圖。

圖4是本發(fā)明中未脫保護的p(d-leu(boc)-hema)均聚物(1)，p(d-lys(boc)-hema)均聚物(2)和p(d-leu(boc)-hema)-b-p(d-lys(boc)-hema)嵌段共聚物(3)在cdcl3中的¹h-nmr譜圖。

圖5是本發(fā)明中脫保護后p(d-leu-hema)均聚物(1)，p(d-lys-hema)均聚物均聚物(2)和p(d-leu-hema)-b-p(d-lys-hema)嵌段共聚物均聚物(3)在d2o中的¹h-nmr譜圖。

圖6是本發(fā)明中均聚物和共聚物的圓二色譜表征結(jié)果圖。

圖7是本發(fā)明中聚合物抗菌實驗的掃描電鏡照片。

圖8是本發(fā)明中聚合物針對大腸桿菌的抗菌實驗效果曲線圖(1)。

圖9是本發(fā)明中聚合物針對金黃色葡萄球菌的抗菌實驗效果曲線圖(1)。

圖10是本發(fā)明聚合物p(l-leu-hema)的體外生物相容性表征圖。

圖11是本發(fā)明聚合物p(d-leu-hema)的體外生物相容性表征圖。

圖12是本發(fā)明聚合物p(d-leu-hema-b-d-lys-hema)的體外生物相容性表征圖。

圖13是本發(fā)明聚合物p(l-leu-hema-b-l-lys-hema)的體外生物相容性表征圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。實施例使用的實驗原料和儀器分別如下表所示：

(1)實驗原料

(2)實驗儀器

在本發(fā)明實施例中使用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合，raft聚合是一種活性/可控自由基聚合，適用含有雙鍵官能團的單體。raft聚合中，傳統(tǒng)引發(fā)劑受熱分解成初級自由基i^·，并引發(fā)單體聚合成增長自由基pn^·，增長自由基與鏈轉(zhuǎn)移劑中的c＝s鍵進行可逆加成形成中間體休眠種，休眠種中s-r鍵斷裂，形成新的活性種自由基rn^·，再引發(fā)單體聚合，反應(yīng)機理如下圖1所示。與傳統(tǒng)自由基聚合不同，raft聚合鏈轉(zhuǎn)移為可逆過程，中間體休眠種和生長鏈自由基之間進行可逆加成和可逆斷裂的平衡反應(yīng)，從而確保所有的鏈以同等幾率生長，形成窄分布的聚合物，體系中自由基濃度維持在一個相對恒定的較低水平，抑制體系中自由基的雙基終止反應(yīng)，使得聚合活性可控。在本發(fā)明中使用引發(fā)劑引發(fā)第一單體，在以第一單體和鏈轉(zhuǎn)移劑進行活性聚合，在加入第二單體時，補充引發(fā)劑以引發(fā)第二單體，以活性聚合得到的第一單體均聚物為大分子鏈轉(zhuǎn)移劑進行第二單體的活性聚合。

實施例1—制備單體d-亮氨酸甲基丙烯酸羥乙酯、l-亮氨酸甲基丙烯酸羥乙酯、d-賴氨酸甲基丙烯酸羥乙酯和l-賴氨酸甲基丙烯酸羥乙酯

首先向干燥的雙頸圓底燒瓶中加入溶于22ml干燥二氯甲烷的手性氨基酸單體5g(分別為d-亮氨酸、l-亮氨酸、d-賴氨酸和l-賴氨酸，為確保反應(yīng)中官能團的活性，選擇叔丁氧羰基boc保護的上述四種氨基酸，在反應(yīng)之后利用三氟乙酸脫去boc保護基)，在磁力攪拌下通氮氣凈化，隨后加入溶于1.5ml干燥二氯甲烷的催化劑dmap0.24g,將反應(yīng)瓶置于冰水浴中，逐滴緩慢加入溶于20ml干燥二氯甲烷的脫水縮合劑dcc4.53g,并在氮氣保護下在20min內(nèi)加入2.86ghema。在冰水浴下反應(yīng)30min，隨后氮氣氛圍下在室溫20—25攝氏度下繼續(xù)反應(yīng)36h。反應(yīng)結(jié)束后抽濾除去白色沉淀，得到的有機混合溶液用70ml蒸餾水和100ml二氯甲烷萃取四次，得到的有機層進一步依次用60ml0.1mol/l鹽酸溶液萃取兩次，60ml飽和碳酸氫鈉溶液和60ml飽和氯化鈉溶液洗滌兩次。最后用無水硫酸鈉干燥，攪拌過夜，過濾后，旋蒸除去溶劑。

利用核磁共振對制備的四種單體進行表征，結(jié)果如附圖2和3所示，鑒于四種單體的化學(xué)組成分為兩種(即亮氨酸甲基丙烯酸羥乙酯和賴氨酸甲基丙烯酸羥乙酯)，化學(xué)構(gòu)型分為d和l，同一個化學(xué)組成的不同構(gòu)型的核磁譜圖基本一致，如兩張附圖所示可知，核磁共振的化學(xué)位移對應(yīng)化學(xué)式中標記的不同化學(xué)環(huán)境的氫原子，恰恰證明四種單體成功制備。

實施例2—以實施例1制備的四種單體為原料，使用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合制備四種均聚物

采用raft聚合方法制備陽離子手性氨基酸甲基丙烯酸羥乙酯均聚物：在帶有磁力攪拌子的25mlschlenk瓶中，加入1.5g實施例1制得的單體、cpadb24.4mg、aibn2.86mg和1.5g無水dmf溶劑，經(jīng)過三次凍-抽-融循環(huán)除去反應(yīng)體系中的雜質(zhì)氣體后，置于70℃的油浴鍋中，在氮氣保護下反應(yīng)10小時。反應(yīng)完成后，暴露在空氣中并置于冰水浴中快速冷卻終止反應(yīng)，再用丙酮/正己烷反復(fù)沉淀5次。將得到的產(chǎn)物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h，得到每種均聚物的樣品。冰水浴條件下，按照每1g樣品加入20ml二氯甲烷與10ml三氟乙酸的比例，加入到反應(yīng)瓶中，然后在室溫反應(yīng)3h，旋蒸以脫除溶劑。將所得產(chǎn)物滴加入無水乙醚，反復(fù)沉淀三次。將得到的產(chǎn)物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h。將純化后的產(chǎn)物溶于去離子水中，透析72h除去殘留的雜質(zhì)，冷凍干燥后得到純凈的海綿狀固體樣品。

利用核磁共振對制備的四種均聚物進行表征，結(jié)果如附圖4和5所示，同理基于亮氨酸甲基丙烯酸羥乙酯和賴氨酸甲基丙烯酸羥乙酯的兩種聚合物存在化學(xué)構(gòu)型的不同(d型和l型)，同一個化學(xué)組成的不同構(gòu)型的核磁譜圖基本一致，如兩張附圖所示可知，核磁共振的化學(xué)位移對應(yīng)化學(xué)式中標記的不同化學(xué)環(huán)境的氫原子，恰恰證明四種均聚物成功制備，且在脫保護之后整體聚合物不產(chǎn)生變化。

實施例3—制備d-陽離子手性氨基酸甲基丙烯酸羥乙酯共聚物

(1)采用實施例2的方法首先制備d—亮氨酸的均聚物：在帶有磁力攪拌子的25mlschlenk瓶中，加入1.5g實施例1制備的單體d—亮氨酸甲基丙烯酸羥乙酯、cpadb24.4mg、aibn2.86mg和1.5g無水dmf溶劑，經(jīng)過三次凍-抽-融循環(huán)除去反應(yīng)體系中的雜質(zhì)氣體后，置于70℃的油浴鍋中，在氮氣保護下反應(yīng)10小時，待反應(yīng)基本結(jié)束后，不進行暴露空氣的終止反應(yīng)，而是保持d—亮氨酸均聚物末端的活性基團(cpadb)作為加入第二單體進行反應(yīng)的大分子鏈轉(zhuǎn)移劑；

(2)在反應(yīng)容器中，加入3g相同構(gòu)型的賴氨酸甲基丙烯酸酯單體(即d—賴氨酸甲基丙烯酸羥乙酯)，aibn2.15mg和和3g無水dmf溶劑，與之前制備的大分子鏈轉(zhuǎn)移劑0.96g進行反應(yīng)，經(jīng)過三次凍-抽-融循環(huán)除去反應(yīng)體系中的雜質(zhì)氣體后，置于70℃的油浴鍋中，在氮氣保護下反應(yīng)6小時，經(jīng)多次沉淀純化后將得到的產(chǎn)物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h；

(3)在冰水浴條件下，按照每1g樣品(即上述步驟2得到的樣品)加入20ml二氯甲烷與10ml三氟乙酸的比例，加入到反應(yīng)瓶中，然后在室溫反應(yīng)3h，旋蒸以脫除溶劑。將所得產(chǎn)物滴加入無水乙醚，反復(fù)沉淀三次。將得到的產(chǎn)物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h。將純化后的產(chǎn)物溶于去離子水中，透析72h除去殘留的雜質(zhì)，冷凍干燥后得到純凈的海綿狀固體樣品。得到d構(gòu)型的陽離子手性氨基酸甲基丙烯酸羥乙酯共聚物。

利用核磁共振對制備的d構(gòu)型的陽離子手性氨基酸甲基丙烯酸羥乙酯共聚物進行表征，如附圖4和5所示，核磁共振的化學(xué)位移對應(yīng)化學(xué)式中標記的不同化學(xué)環(huán)境的氫原子，恰恰證明共聚物成功制備，且在脫保護之后整體聚合物不產(chǎn)生變化。

實施例4—制備l-陽離子手性氨基酸甲基丙烯酸酯共聚物

(1)采用實施例2的方法首先制備l—亮氨酸的均聚物：在帶有磁力攪拌子的25mlschlenk瓶中，加入1.5g實施例1制備的單體l—亮氨酸甲基丙烯酸羥乙酯、cpadb24.4mg、aibn2.86mg和1.5g無水dmf溶劑，經(jīng)過三次凍-抽-融循環(huán)除去反應(yīng)體系中的雜質(zhì)氣體后，置于70℃的油浴鍋中，在氮氣保護下反應(yīng)10小時，待反應(yīng)基本結(jié)束后，不進行暴露空氣的終止反應(yīng)，而是保持l—亮氨酸均聚物末端的活性基團(cpadb)作為加入第二單體進行反應(yīng)的大分子鏈轉(zhuǎn)移劑；

(2)在反應(yīng)容器中，加入3g相同構(gòu)型的賴氨酸甲基丙烯酸酯單體(即l—賴氨酸甲基丙烯酸羥乙酯)，aibn2.15mg和和3g無水dmf溶劑，與之前制備的大分子鏈轉(zhuǎn)移劑0.96g進行反應(yīng)，經(jīng)過三次凍-抽-融循環(huán)除去反應(yīng)體系中的雜質(zhì)氣體后，置于70℃的油浴鍋中，在氮氣保護下反應(yīng)6小時，經(jīng)多次沉淀純化后將得到的產(chǎn)物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h；

(3)在冰水浴條件下，按照每1g樣品(即上述步驟2得到的樣品)加入20ml二氯甲烷與10ml三氟乙酸的比例，加入到反應(yīng)瓶中，然后在室溫反應(yīng)3h，旋蒸以脫除溶劑。將所得產(chǎn)物滴加入無水乙醚，反復(fù)沉淀三次。將得到的產(chǎn)物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h。將純化后的產(chǎn)物溶于去離子水中，透析72h除去殘留的雜質(zhì)，冷凍干燥后得到純凈的海綿狀固體樣品。得到l構(gòu)型的陽離子手性氨基酸甲基丙烯酸羥乙酯共聚物。

利用核磁共振對制備的共聚物進行表征，與實施例3制備的d構(gòu)型的陽離子手性氨基酸甲基丙烯酸羥乙酯共聚物相比，僅僅在構(gòu)型存在不同(l型)，氫原子的化學(xué)環(huán)境基本一致，即d型和l型的化學(xué)位移基本一致，結(jié)果如附圖4和5所示，核磁共振的化學(xué)位移對應(yīng)化學(xué)式中標記的不同化學(xué)環(huán)境的氫原子，恰恰證明共聚物成功制備，且在脫保護之后整體聚合物不產(chǎn)生變化。

實施例5—制備d-賴氨酸/l-亮氨酸甲基丙烯酸酯共聚物

(1)采用實施例2的方法首先制備l—亮氨酸的均聚物：在帶有磁力攪拌子的25mlschlenk瓶中，加入1.5g實施例1制備的單體l—亮氨酸甲基丙烯酸羥乙酯、cpadb24.4mg、aibn2.86mg和1.5g無水dmf溶劑，經(jīng)過三次凍-抽-融循環(huán)除去反應(yīng)體系中的雜質(zhì)氣體后，置于70℃的油浴鍋中，在氮氣保護下反應(yīng)10小時，待反應(yīng)基本結(jié)束后，不進行暴露空氣的終止反應(yīng)，而是保持l—亮氨酸均聚物末端的活性基團(cpadb)作為加入第二單體進行反應(yīng)的大分子鏈轉(zhuǎn)移劑；

(2)在反應(yīng)容器中，加入3g不同構(gòu)型的賴氨酸甲基丙烯酸酯單體(即d—賴氨酸甲基丙烯酸羥乙酯)，aibn2.15mg和和3g無水dmf溶劑，與之前制備的大分子鏈轉(zhuǎn)移劑0.96g進行反應(yīng)，經(jīng)過三次凍-抽-融循環(huán)除去反應(yīng)體系中的雜質(zhì)氣體后，置于70℃的油浴鍋中，在氮氣保護下反應(yīng)6小時，經(jīng)多次沉淀純化后將得到的產(chǎn)物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h；

(3)在冰水浴條件下，按照每1g樣品(即上述步驟2得到的樣品)加入20ml二氯甲烷與10ml三氟乙酸的比例，加入到反應(yīng)瓶中，然后在室溫反應(yīng)3h，旋蒸以脫除溶劑。將所得產(chǎn)物滴加入無水乙醚，反復(fù)沉淀三次。將得到的產(chǎn)物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h。將純化后的產(chǎn)物溶于去離子水中，透析72h除去殘留的雜質(zhì)，冷凍干燥后得到純凈的海綿狀固體樣品，得到d-賴氨酸/l-亮氨酸甲基丙烯酸酯共聚物。

實施例6—制備d-亮氨酸/l-賴氨酸甲基丙烯酸酯共聚物

(1)采用實施例2的方法首先制備d—亮氨酸的均聚物：在帶有磁力攪拌子的25mlschlenk瓶中，加入1.5g實施例1制備的單體d—亮氨酸甲基丙烯酸羥乙酯、cpadb24.4mg、aibn2.86mg和1.5g無水dmf溶劑，經(jīng)過三次凍-抽-融循環(huán)除去反應(yīng)體系中的雜質(zhì)氣體后，置于70℃的油浴鍋中，在氮氣保護下反應(yīng)10小時，待反應(yīng)基本結(jié)束后，不進行暴露空氣的終止反應(yīng)，而是保持d—亮氨酸均聚物末端的活性基團(cpadb)作為加入第二單體進行反應(yīng)的大分子鏈轉(zhuǎn)移劑；

(2)在反應(yīng)容器中，加入3g不同構(gòu)型的賴氨酸甲基丙烯酸酯單體(即l—賴氨酸甲基丙烯酸羥乙酯)，aibn2.15mg和和3g無水dmf溶劑，與之前制備的大分子鏈轉(zhuǎn)移劑0.96g進行反應(yīng)，經(jīng)過三次凍-抽-融循環(huán)除去反應(yīng)體系中的雜質(zhì)氣體后，置于70℃的油浴鍋中，在氮氣保護下反應(yīng)6小時，經(jīng)多次沉淀純化后將得到的產(chǎn)物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h；

(3)在冰水浴條件下，按照每1g樣品(即上述步驟2得到的樣品)加入20ml二氯甲烷與10ml三氟乙酸的比例，加入到反應(yīng)瓶中，然后在室溫反應(yīng)3h，旋蒸以脫除溶劑。將所得產(chǎn)物滴加入無水乙醚，反復(fù)沉淀三次。將得到的產(chǎn)物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h。將純化后的產(chǎn)物溶于去離子水中，透析72h除去殘留的雜質(zhì)，冷凍干燥后得到純凈的海綿狀固體樣品。得到d-亮氨酸/l-賴氨酸甲基丙烯酸酯共聚物。

由四種單體均聚得到的聚合物表現(xiàn)出與相應(yīng)單體一致的d和l構(gòu)型，兩個l型單體共聚得到的共聚物表現(xiàn)為l型，兩個d型單體共聚得到的共聚物表現(xiàn)為d型，實施例5和6制備的共聚物采用d型和l型單體進行共聚，可通過d型/l型單體的投料比例，變更兩者之間的摩爾比，以使共聚物表現(xiàn)為d型或者l型，即利用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合方法通過d型和l型單體的投料比例，變更共聚物中d型單體和l型單體之間的摩爾比，以使共聚物整體表現(xiàn)為d型或者l型。

實施例7—均聚物、共聚物性質(zhì)測試

如圖6所示，將制備的d構(gòu)型和l構(gòu)型聚合物進行圓二色譜測試，在相同的波長范圍內(nèi)出現(xiàn)向上的波峰和向下的波谷，向上波峰對應(yīng)的聚合物為l構(gòu)型，向下波谷對應(yīng)的聚合物為d構(gòu)型，表現(xiàn)出完全相反的螺旋構(gòu)象。

微稀釋法抗菌實驗參考文獻：p.li,c.c.zhou,s.rayatpisheh,k.ye,y.f.poon,p.t.hammond,h.w.duan,m.b.chan-park,adv.mater.,2012,24,4130-4137；體外人主動脈平滑肌細胞相容性實驗參考文獻：s.e.exley,l.c.paslay,g.s.sahukhal,b.a.abel,t.d.brown,c.l.mccormick,s.heinhorst,v.koul,v.choudhary,m.o.elasri,s.e.morgan,biomacromolecules,2015,16,3845-3852；溶血實驗參考文獻：a.pascual,j.p.k.tan,a.yuen,j.m.w.chan,d.j.coady,d.mecerreyes,j.l.hedrick,y.y.yang,h.sardon,biomacromolecules,2015,16,1169-1178。

選擇金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌代表，大腸桿菌為革蘭氏陰性菌代表，首先將細菌菌株過夜培養(yǎng)達到生長中期，用pbs緩沖液稀釋到每毫升3×10⁸個菌落形成單位(cfu)，其次將高分子溶液(制備的聚合物的水溶液)用無菌液體培養(yǎng)基二倍稀釋，取100μl稀釋好的細菌懸液，加入到96孔板中100μl的高分子溶液中，得到抗菌聚合物的最終濃度為2-4096μg·ml^-1。隨后將96孔板置于37℃培養(yǎng)18h，使用酶標儀測試微孔在600nm處的吸光度值。將200μl不含抗菌聚合物的細菌細胞培養(yǎng)液作為陽性對照組，200μl純的培養(yǎng)液為陰性對照組。每次實驗均設(shè)置4-6個平行樣品。同時設(shè)置一系列濃度聚合物溶液的對照組以排除聚合物溶液對實驗組吸光度值的影響。隨后，用2.5％體積百分數(shù)的戊二醛磷酸鹽緩沖液將經(jīng)過100μl致死劑量的聚合物溶液培養(yǎng)接觸3h的細菌在室溫下(20—25攝氏度)固定4h，并用pbs緩沖液漂洗兩次，然后經(jīng)過梯度濃度的乙醇溶液依次脫水15min，在1000rpm下離心10min，將其均勻涂布在硅片上，自然風(fēng)干，噴金50s，在場發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察細菌表面破壞形貌。

如附圖7所示，從場發(fā)射掃描電鏡結(jié)果圖直觀的展現(xiàn)出本發(fā)明制得的抗菌聚合物能夠明顯的破壞細菌膜結(jié)構(gòu)引起細菌的死亡，且依據(jù)上述實施例制備的聚合物表現(xiàn)出與基本一致的性能。如附圖8和9所示，p(d-leu-hema)均聚物、p(d-lys-hema)均聚物和p(d-leu-hema)-b-p(d-lys-hema)嵌段共聚物表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌性能，實驗結(jié)果表明，p(d-leu-hema)均聚物的最低抑菌濃度(mic)為798～820μg·ml^-1，p(d-lys-hema)均聚物的mic為100～120μg·ml^-1，p(d-leu-hema)-b-p(d-lys-hema)嵌段共聚物的mic為180～200μg·ml^-1(針對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出基本一致的情況)；換用基于l型氨基酸的均聚物和共聚物，表現(xiàn)與上述實施例基本一致的抗菌性能，略低于d型氨基酸的均聚物和共聚物。采用d型和l型單體進行共聚的共聚物，通過調(diào)整d型/l型單體的投料比例，共聚物表現(xiàn)為d型或者l型，同樣具有與相應(yīng)構(gòu)型一致的抗菌性能，低于各自構(gòu)型的抗菌性能。

如附圖10—13所示，溶血實驗和體外人主動脈平滑肌細胞相容性實驗表明，本發(fā)明制備的聚合物在抗菌所需濃度下仍可以保持顯著的生物相容性，其中溶血率低于10％，平滑肌細胞活性可達到80％以上。

依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容進行上述聚合物的制備，聚合物均表現(xiàn)出與實施例基本一致的性能。以上對本發(fā)明做了示例性的描述，應(yīng)該說明的是，在不脫離本發(fā)明的核心的情況下，任何簡單的變形、修改或者其他本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠不花費創(chuàng)造性勞動的等同替換均落入本發(fā)明的保護范圍。