本發(fā)明屬于中藥材來源品種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用單核苷酸多態(tài)性(SNP位點(diǎn))鑒定金銀花提取物和中成藥中摻雜山銀花的方法。

背景技術(shù)：

金銀花Lonicerae Japonicae Flos，又稱忍冬花，為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica的干燥花蕾或帶初開的花。金銀花以花入藥，性寒，味甘，具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱功效。臨床用于溫?zé)岢跗冢髦瓮飧酗L(fēng)熱，咽喉腫痛之癥。金銀花含有揮發(fā)油，黃酮，三萜類和綠原酸等化學(xué)成分，其中綠原酸具有抗菌、抗病毒、利膽、保肝、降壓、興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用，能增加腸胃蠕動(dòng)能力，并能促進(jìn)胃液分泌及膽汁分泌等，綠原酸的水解產(chǎn)物咖啡酸亦有增加白細(xì)胞和抗氧化作用，在臨床上用于治療多種急性細(xì)菌性感染和放、化療所致的自細(xì)胞減少癥有顯著效果。由于金銀花中綠原酸的特殊功效，市場(chǎng)上常將綠原酸含量多少作為評(píng)定金銀花質(zhì)量好壞的標(biāo)準(zhǔn)。金銀花提取物的規(guī)格以綠原酸計(jì)，從5％-95％不等。，則價(jià)格也隨綠原酸含量的增高而增加。山銀花Lonicerae Flos是忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera fulvotomentosa、紅腺忍冬Lonicera confusa、華南忍冬Lonicera hypoglauca或黃褐毛忍冬Lonicera macranthoides的干燥花蕾或帶初開的花。在2005年之后的《中華人民共和國藥典》將金銀花和山銀花分開列入。由于其科屬相同，性狀相似，功能用量有效成分都相同，因此難以被區(qū)分。且山銀花較金銀花成本低，導(dǎo)致市場(chǎng)上時(shí)常有二者混雜的現(xiàn)象。由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)的監(jiān)管方法，市場(chǎng)上提取物摻假、造假越來越嚴(yán)重，因此，急需建立一種新的金銀花提取物或中成藥摻雜山銀花的鑒定方法。

分子鑒定已廣泛應(yīng)用于中藥材鑒定，而針對(duì)提取物和中成藥而言，DNA降解嚴(yán)重，擴(kuò)增長序列存在一定的困難。Shaw等的研究結(jié)果表明人參在煎煮兩小時(shí)后只能擴(kuò)增獲得短片段。本發(fā)明開發(fā)了一對(duì)針對(duì)金銀花山銀花的特異性引物，可以在金銀花提取物或中成藥中擴(kuò)增出110bp序列，在此區(qū)段開發(fā)了兩個(gè)穩(wěn)定的SNP位點(diǎn)，可以用于金銀花和山銀花及其混合粉末的鑒定。本專利用于鑒定金銀花提取物及中成藥中是否摻雜山銀花。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服傳統(tǒng)鑒別技術(shù)中存在的上述缺陷并提供一種結(jié)果準(zhǔn)確靈敏，鑒定過程簡(jiǎn)便快速的金銀花摻雜山銀花的鑒定方法。本發(fā)明所利用的是在大量的金銀花和山銀花ITS2序列分析的基礎(chǔ)上，開發(fā)了兩個(gè)穩(wěn)定的單核苷酸多態(tài)性SNPs的特點(diǎn)，并設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，可從金銀花提取物和中成藥中擴(kuò)增出包含此SNP位點(diǎn)的區(qū)段，該區(qū)段長度約110bp。在此區(qū)段，金銀花16bp和64bp堿基分別為G和C，而山銀花為A和T。經(jīng)過測(cè)序和峰圖分析可以明顯看到兩處峰圖的差異，若有二者混合，則可以明顯看到SNP位點(diǎn)處有雙峰出現(xiàn)，且可以根據(jù)雙峰高度判斷金銀花提取物和中成藥中摻雜山銀花比例。

本發(fā)明提供了一種從金銀花提取物和中成藥中鑒定是否摻雜有山銀花的鑒定方法，其中，所述方法包括檢測(cè)樣品基因組DNA中是否存在山銀花的關(guān)鍵SNP位點(diǎn)。當(dāng)存在所述堿基時(shí)，鑒定待測(cè)樣品中摻雜有山銀花。

可選的，所述方法包括如下步驟：

1)以待測(cè)樣品的基因組DNA為模板，對(duì)所述目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

2)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，拼接后去除引物區(qū)獲得擴(kuò)增片段，檢測(cè)擴(kuò)增片段中金銀花SNP位點(diǎn)G/C是否存在所述SNP位點(diǎn)A/T，如果含有此位點(diǎn)，則證明金銀花提取物或中成藥中摻有山銀花。

本發(fā)明對(duì)于PCR所使用的引物有特別的限制，僅為擴(kuò)增出金銀花和山銀花，特異性較高，因此在PCR擴(kuò)增的過程中為了達(dá)到目的條帶的準(zhǔn)確性，采用專門設(shè)計(jì)的特異引物。所述PCR擴(kuò)增使用的引物為：

JYHF1 5′-AGTGGTGGTCGTAACATTC-3′

JYHR1 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

上述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

可選的，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：

PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg²⁺ 2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 2μL(-約30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加滅菌雙蒸水至25μL，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

其中，所述待測(cè)樣品包括金銀花提取物以及主要成分為金銀花的中成藥品(膠囊，顆粒，藥片和蜜丸)。

附圖說明

圖1所示為金銀花和山銀花四個(gè)基源的測(cè)序峰圖文件，在SNP位點(diǎn)處，金銀花為G和C，而山銀花四個(gè)基源均為A和T。

圖2所示為金銀花和山銀花不同比例混合粉末的測(cè)序峰圖，金銀花和山銀花比例分別為15∶1(A)，1∶15(B)，4∶1(C)和1∶4(D)

圖3所示為應(yīng)用雙峰法鑒定中成藥和提取物的峰圖文件，TQWS7為摻雜山銀花的提取物，ZCY12-SW為首烏丸，ZCY16-QG為青果片，ACY17-KG為抗感顆粒。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1用于說明特異性引物擴(kuò)增金銀花和山銀花的可行性

1)DNA的獲取

從不同產(chǎn)地收集的金銀花和山銀花樣品(包括灰氈毛忍冬，紅腺忍冬，華南忍冬和黃褐毛忍冬)45份。分別取20mg藥材，在MM400球磨儀(德國Retsch)上進(jìn)行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA試劑盒提取總DNA。

2)PCR擴(kuò)增

正向引物JYHF1 5′-AGTGGTGGTCGTAACATTC-3′

反向引物JYHR1 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

由賽百盛基因技術(shù)有限公司(北京)合成。引物用無菌去離子溶解并稀釋至2.5μmol/μL。

25μL反應(yīng)體系：PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg2+ 2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 1μL(-約30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加滅菌雙蒸水至25μL，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)程序：在PCR儀上按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：

3)測(cè)序

PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。測(cè)序引物為正向引物JYHF1 5′-AGTGGTGGTCGTAACATTC-3′和反向引物JYHR1 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。為確保所擴(kuò)增序列的可靠性，需要進(jìn)行正反向測(cè)序或重復(fù)測(cè)序，然后將正反向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接獲得目的片段。

4)序列拼接

本實(shí)施例應(yīng)用軟件CodonCodeAligner 3.7.1(CodonCode Co.，Germany)進(jìn)行序列拼接及校對(duì)。首先，進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及預(yù)處理，即去除測(cè)序結(jié)果兩端的低質(zhì)量部分，并對(duì)剩余部分進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，如果滿足質(zhì)量要求，方可用于序列拼接，具體方法是：以20bp的窗口分別從序列5’端和3’端進(jìn)行滑動(dòng)，如果窗口內(nèi)有多于2個(gè)堿基的Q值小于20，則刪除一個(gè)堿基，窗口繼續(xù)滑動(dòng)，如果窗口內(nèi)堿基Q值小于20的數(shù)目小于或等于2個(gè)，窗口停止滑動(dòng)。

5)同屬近緣種序列比對(duì)

用MEGA 5軟件對(duì)測(cè)序并拼接后的各個(gè)樣品以及GenBank中金銀花，山銀花ITS2序列進(jìn)行比對(duì)，所有金銀花的SNP位點(diǎn)均含有G，C兩個(gè)堿基，山銀花相同位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的堿基為A，T。(圖1)

實(shí)施例2通過人工手段混合金銀花和山銀花藥材粉末

將實(shí)施例1中的金銀花和山銀花藥材粉末進(jìn)行人工混合，所混合比例分別為金銀花∶山銀花為15∶1，1∶15，4∶1，和1∶4。提取混合藥材粉末的DNA，應(yīng)用特異引物JYHF1/JYHR1進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，在序列中查找相應(yīng)的SNP位點(diǎn)。結(jié)果表明，混合粉末中金銀花和山銀花摻雜量的不同會(huì)對(duì)雙峰的相應(yīng)高度產(chǎn)生影響(圖2)。在金銀花∶山銀花混合比例為15∶1和4∶1的峰圖中(A，C)，含量高的金銀花的SNP位點(diǎn)峰圖高度明顯高于含量較低的金銀花SNP位點(diǎn)處的峰圖高度。山銀花摻雜情況反之亦然。(B為山銀花∶金銀花15∶1，D為山銀花∶金銀花4∶1)

實(shí)施例3金銀花提取物中山銀花成分的鑒定

采用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行鑒定，所不同的是以金銀花提取物為樣品，本次所選擇的樣品來自遼寧大連、陜西西安、以及湖南長沙。共計(jì)12批次，見表1。提取基因組DNA，應(yīng)用特異引物JYHF1/JYHR1進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，在序列中查找對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)(圖3)。研究結(jié)果表明：11/12份金銀花提取物中均檢測(cè)到了金銀花或山銀花的SNP位點(diǎn)，7份摻雜兩種藥材，其中6份觀察到雙峰中山銀花含量明顯高于金銀花，2份只檢測(cè)到山銀花SNP位點(diǎn)，只有2份只含有金銀花，均來自遼寧大連(TQWS5，TQWS6)。說明應(yīng)用此方法可以判斷金銀花提取物中是否摻雜山銀花。

表1金銀花提取物采樣表

注：“+”代表有此成分，“++”表示以此成分為主注：“-”代表沒有此成分

實(shí)施例4以金銀花為主要成分中成藥的鑒定

采用與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行鑒定，所不同的是以含金銀花的中成藥(膠囊，顆粒，藥片，蜜丸)為樣品，見表2，這些樣品85％在《中華人民共和國藥典》中的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)都是以綠原酸計(jì)。提取中成藥基因組DNA，應(yīng)用特異引物JYHF1/JYHR1進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，在序列中查找相應(yīng)的SNP位點(diǎn)，結(jié)果表明除去復(fù)方魚腥草片之外其余的樣品中成藥都可以擴(kuò)增出目的片段，其峰圖中均可以找到金銀花或山銀花的SNP位點(diǎn)(圖3)，且根據(jù)雙峰得知，12份中成藥中兩種藥材都有摻雜。4份中成藥中金銀花被山銀花完全替換，分別為清開靈滴丸、羚羊感冒軟膠囊、梔子金花丸和首烏丸，僅3份中成藥用的是金銀花正品，分別為金芪降糖片、連花清瘟膠囊和茵梔黃顆粒。

表2含金銀花中成藥取樣表

注：“+”代表有此成分，“++”表示以此成分為主注：“-”代表沒有此成分

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。