本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種檢測(cè)MSH3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的引物和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)在已經(jīng)明確DNA的甲基化與腫瘤的發(fā)生有著密切的聯(lián)系，DNA的甲基化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著極其重要的角色，其異常是通過影響癌基因和抑癌基因的表達(dá)以及基因組的穩(wěn)定性而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展的。抑癌基因的高度廣泛甲基化使DNA發(fā)生轉(zhuǎn)錄抑制，抑癌基因的不能表達(dá)參與了腫瘤的發(fā)生。近年來，癌基因和抑癌基因的甲基化與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展之間的關(guān)系已成為腫瘤研究的另一熱點(diǎn)。

MSH3基因定位于5q11-13，cDNA全長(zhǎng)4374bp，含24個(gè)外顯子，其編碼產(chǎn)物參與DNA復(fù)制中錯(cuò)配或未配對(duì)堿基的識(shí)別與切除。在膀胱癌中對(duì)MSH3基因的研究，包括單核苷酸多態(tài)性，雜合子丟失，基因突變及微衛(wèi)星DNA不穩(wěn)定性等方面，均無顯著意義。通過一些實(shí)驗(yàn)研究，推測(cè)表遺傳改變，如MSH3基因啟動(dòng)子序列的甲基化，可能在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色，也就是說MSH3基因在膀胱癌中的表達(dá)受其啟動(dòng)子甲基化調(diào)控。

目前研究發(fā)現(xiàn)，hMSH2、MSH3基因的啟動(dòng)子甲基化異常與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)缺失是遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌發(fā)病的重要原因。在散發(fā)性大腸癌、胃癌、肝癌、肺癌、右半結(jié)腸根治術(shù)癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌及子宮內(nèi)膜癌等腫瘤中，均存在hMSH2、MSH3基因的表達(dá)異?，F(xiàn)象，顯示DNA錯(cuò)配修復(fù)表達(dá)缺失與腫瘤發(fā)病相關(guān)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、腎細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)hMSH2、MSH3基因表達(dá)下調(diào)。

目前對(duì)于MSH3啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的常規(guī)方法有：甲基化特異性PCR(MSP)、亞硫酸氫鹽焦磷酸測(cè)序、甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析(MS-HRM)，甲基化特異性PCR(MS-PCR)等。其中MSP法是使用PCR擴(kuò)增檢測(cè)來判斷樣本是否存在甲基化，該法實(shí)用且普遍，但假陽性較高，穩(wěn)定性較差；亞硫酸氫鹽焦磷酸測(cè)序因其操作繁瑣，因此不適合大批量檢測(cè)；MS-HRM是通過將單堿基序列的差異轉(zhuǎn)變成熔解曲線的差異，從而判斷是否存在甲基化，這種方法對(duì)儀器的要求頗高，需要帶HRM模塊的熒光定量PCR儀，同時(shí)該法只能分析檢測(cè)片段整體甲基化狀態(tài)，而不能明確每個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)；MS-PCR是基于PCR開發(fā)的技術(shù)，主要是在檢測(cè)中加入了TaqMan探針，從而保證了較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但其對(duì)于多個(gè)甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)，也只能做到整體化分析，同時(shí)探針成本較高，因此該法較適用于少數(shù)位點(diǎn)大量樣本檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是：設(shè)計(jì)用于檢測(cè)MSH3基因啟動(dòng)子甲基化的引物，包括一對(duì)特異性擴(kuò)增兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其序列為：

SEQ NO 1：5’-YGTTTTTYGTTAGGTTTTGTYGTC-3’；

SEQ NO 2：5’-ACRCCAAAATCCACCTAATCR-3’。

R堿基代表A或G，Y堿基代表C或T，所述SEQ NO 1和SEQ NO 2同時(shí)也為雙向測(cè)序引物。

本發(fā)明提供的另一個(gè)技術(shù)方案是：用于檢測(cè)MSH3基因啟動(dòng)子甲基化的方法，包括：

(1)提取樣本中的DNA；

(2)將步驟(1)中提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理；

(3)以步驟(2)中的DNA作為模板，使用SEQ NO1和SEQ NO 2擴(kuò)增MSH3基因片段，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

(4)對(duì)步驟(3)中獲得的產(chǎn)物測(cè)序；

(5)根據(jù)步驟(4)的測(cè)序結(jié)果，得到序列CG位點(diǎn)的甲基化結(jié)果；

其中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：第一階段，92-97℃預(yù)變性5-15min；第二階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度62-66℃90sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)12-18次，每循環(huán)一次，所述退火溫度降低0.5℃；第三階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度53-57℃30sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)24-34次；第四階段，72℃10min；第五階段，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃下保存。

所述的測(cè)序?yàn)镾anger測(cè)序，測(cè)序引物為：

SEQ NO 1：5’-YGTTTTTYGTTAGGTTTTGTYGTC-3’；

SEQ NO 2：5’-ACRCCAAAATCCACCTAATCR-3’。

該方法檢測(cè)的樣本為石蠟切片樣本、全血樣本、新鮮組織樣本或細(xì)胞系樣本。

更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)MSH3基因啟動(dòng)子甲基化的試劑盒的技術(shù)方案，包括亞硫酸鹽修飾、PCR擴(kuò)增試劑以及Sanger測(cè)序試劑、陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品，其中：

(1)亞硫酸鹽處理試劑包括：Bisulfite Mix、RNase free water、DNA Protect Buffer；

(2)PCR擴(kuò)增試劑：10*PCR Buffer、2mM dNTP、5*Q Solution Buffer、5U/ul Taq酶、10uM擴(kuò)增引物(SEQ NO1、SEQ NO 2)以及滅菌水；

(3)酶純化試劑：EXOI、CIP；

(4)測(cè)序試劑：Bigdye Terminator V3.1、無水乙醇、EDTA、及測(cè)序引物(SEQ NO 1、SEQ NO 2)。

其中，陽性對(duì)照品為經(jīng)過所有胞嘧啶甲基化修飾的全甲基化正常人群血液基因組DNA，陰性對(duì)照品為正常人群血液基因組DNA。

本發(fā)明采用Touch-down PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序法MSH3啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)，針對(duì)石蠟切片DNA片段化嚴(yán)重，在造成亞硫酸氫鹽處理飽和的情況下，仍出現(xiàn)的有效模板濃度很低的情況，Touch-down PCR擴(kuò)增可確保正、反向擴(kuò)增引物與樣本DNA模板的結(jié)合發(fā)生在最互補(bǔ)的序列之間，當(dāng)退火溫度降低到非特異性擴(kuò)增發(fā)生的水平時(shí)，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物在此時(shí)已經(jīng)有一個(gè)幾何數(shù)的起始優(yōu)勢(shì)，豐度較高，在剩余的擴(kuò)增反應(yīng)中，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物與非特異擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，但是因非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物豐度較低，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物始終優(yōu)先擴(kuò)增，從而產(chǎn)生單一的占主導(dǎo)地位的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。而Sanger測(cè)序法是檢測(cè)基因甲基化的金標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高，并且很大程度上地節(jié)省了檢測(cè)成本。

由于DNA序列在經(jīng)亞硫酸鹽處理后，其部分C堿基會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)門，導(dǎo)致序列區(qū)域內(nèi)CG含量和TM值發(fā)生較大程度的變異，進(jìn)而影響常規(guī)引物設(shè)計(jì)軟件在其序列上獲得理想的引物序列。因此，本發(fā)明中PCR采用的擴(kuò)增引物以及測(cè)序引物均為自行設(shè)計(jì)，其中測(cè)序引物使用兼并堿基，從而使得陰性、陽性都可在同一體系擴(kuò)增。同時(shí)，擴(kuò)增引物的使用比例經(jīng)過多次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，相對(duì)于其它文獻(xiàn)和軟件設(shè)計(jì)的引物具備了更加理想的擴(kuò)增效率。

因此，本發(fā)明的檢測(cè)方法具備了檢測(cè)出率高，檢測(cè)穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確度高以及低污染風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)勢(shì)。檢測(cè)結(jié)果將有助于預(yù)見相關(guān)腫瘤疾病的早期，同時(shí)具有潛在的指導(dǎo)臨床醫(yī)生個(gè)體化治療的作用。

附圖說明

圖1和圖2是本發(fā)明的檢測(cè)基因甲基化的方法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)序列，圖1為陰性標(biāo)準(zhǔn)序列，圖2為陽性標(biāo)準(zhǔn)序列。

圖3是本發(fā)明的檢測(cè)基因甲基化的實(shí)施例中陰性檢測(cè)的結(jié)果圖，圖4是本發(fā)明的檢測(cè)基因甲基化的實(shí)施例中陽性結(jié)果的圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實(shí)施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。

實(shí)施例1

MSH3基因啟動(dòng)子區(qū)CG島甲基化檢測(cè)試劑盒包括一對(duì)特異性兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，同時(shí)，此引物為測(cè)序引物，其堿基序列如下所示：

SEQ NO 1：5’-YGTTTTTYGTTAGGTTTTGTYGTC-3’；

SEQ NO 2：5’-ACRCCAAAATCCACCTAATCR-3’；

MSH3基因啟動(dòng)子區(qū)CG島甲基化檢測(cè)試劑盒還包括如下試劑：

(1)亞硫酸鹽處理試劑：Bisulfite Mix、RNase free water、DNAProtect Buffer；

(2)PCR擴(kuò)增試劑：10*PCR Buffer、2mM dNTP、5*Q Solution Buffer、5U/ul Taq酶、10uM擴(kuò)增引物(SEQ NO1、SEQ NO 2)以及滅菌水；

(3)酶純化試劑：EXOI，CIP；

(4)測(cè)序試劑：Bigdye Terminator V3.1，無水乙醇，EDTA，及測(cè)序引物(SEQ NO 1，SEQ NO 2)。

(5)陽性質(zhì)控品：已確定的MSH3基因啟動(dòng)子區(qū)CG島甲基化的DNA。陰性質(zhì)控品：已確定的MSH3基因啟動(dòng)子區(qū)CG島無甲基化的DNA?？瞻讓?duì)照品：滅菌水。

實(shí)施例2

DNA提取試劑和方式。

取石蠟切片(5-10μm厚，1×1cm2大小)5-8張，將石蠟包埋組織收集到1.5mL離心管內(nèi)，短暫離心；加入1mL組織透明液，充分振蕩，13200rpm離心1min，移除上清液；加入0.5mL組織透明液，充分振蕩，13200rpm離心1min，移除上清液；加入1mL乙醇(96-100％)，劇烈振蕩，13200rpm室溫離心2min，移除上清液；打開蓋子，室溫(15-25℃)或金屬浴37℃孵育直到剩余乙醇完全揮發(fā)；取180μL Buffer ATL對(duì)管內(nèi)組織進(jìn)行吹吸重懸，然后加入20μL蛋白酶K，再次振蕩；將含有混合液的離心管置于56℃的金屬浴上，孵育1h，期間顛倒混勻3次，直至樣品完全溶解；將離心管轉(zhuǎn)移至90℃的金屬浴上，再次孵育1h；短暫離心，將管蓋上的溶液甩至管底；向管內(nèi)加入200μL Buffer AL，充分振蕩混勻。然后加入200μL乙醇(96-100％)，再次振蕩混勻；短暫離心，將管蓋上的溶液甩至管底；小心將混合液用移液器轉(zhuǎn)移至含有QIAamp MinElute column吸附柱的2mL收集管內(nèi)，8000rpm離心1min，棄收集管，將吸附柱置于一個(gè)新的收集管上；向吸附柱內(nèi)加入500μL Buffer AW1，務(wù)必不要打濕吸附柱管口邊緣。8000rpm離心1min，棄收集管，將吸附柱置于一個(gè)新的收集管上；向吸附柱內(nèi)加入500μL Buffer AW2，務(wù)必不要打濕吸附柱管口邊緣。8000rpm離心1min，棄收集管，將吸附柱置于一個(gè)新的收集管上；13200rpm室溫離心3min，以徹底甩掉吸附膜上殘留的溶液；將吸附柱將吸附柱置于一個(gè)干凈的1.5mL離心管上(自備)，小心向膜中央滴加50μL Buffer ATE；13200rpm室溫離心1min，取收集到的DNA溶液1.5μL用NanoDrop檢測(cè)所得DNA的濃度和純度；將剩余的DNA溶液于-20℃保存。

實(shí)施例3

亞硫酸鹽處理試劑和方法如下。

操作步驟：將實(shí)施例2提取的基因組DNA與1.5mlEP管中使用雙蒸水稀釋至50ul加5.5ul新鮮配制的3MNaOH溶液，42℃水浴30min；水浴期間配制以下溶液：10mM氫醌溶液(Hydryquinone)：取55mg氫醌于50ml水中溶解；3.6mol/LNaHSO₃：取18.8g NaHSO₃加入40ml水中，并以3MNaOH溶液調(diào)節(jié)溶液PH至5.0，最終定容至50ml。加30ul 10mM氫醌溶液和520ul3.6mol/LNaHSO₃至上述水浴后溶液中，EP管外包裹以鋁箔紙避光，輕柔顛倒混勻溶液，管內(nèi)加100ul石蠟油，短暫離心使石蠟油蓋住液面，防止水浴過程中水分的蒸發(fā)并限制氧化50℃避光水浴16h；水浴完后將移液器槍頭伸入石蠟油層下，先輕輕加壓使其中一小段石蠟油排出，然后小心吸取約580ulDNA溶液至潔凈的1.5mlEP管中，使用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收DNA，所得到的DNA溶于50ul去離子水，加5.5ul新鮮配制的3MNaOH，室溫放置15min，然后加33ul 10M乙酸銨中和NaOH，使溶液PH＝7，也加入4ul 10mg/ml葡萄糖作為沉淀位置指示劑，加入270ul冰無水乙醇，至于-20℃，過夜沉淀后，4℃，12000rpm離心，30min，倒掉上清液，收集沉淀，加入500ul70％乙醇，洗劑沉淀，4℃12000rpm，5min離心兩次；倒掉上清，室溫干燥至沉淀由不透明變?yōu)榘胪该骰蛲该鲿r(shí)，依DNA沉淀多少加入30-50ul雙蒸水溶解沉淀。

利用本發(fā)明所述的DNA亞硫酸氫鈉處理試劑和方法，可以獲得更高的DNA回收率，高轉(zhuǎn)化率，同時(shí)可以降低DNA降解率和片段化率，從而提高了PCR擴(kuò)增和后續(xù)分析技術(shù)的靈敏度。

實(shí)施例4

PCR檢測(cè)方法如下。

PCR引物為：所有引物純度達(dá)到PAGE級(jí)或HPLC級(jí)，不含雜帶。提供合成結(jié)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜，證明使用引物達(dá)到檢測(cè)要求。MSH3的引物序列如下：

F：5’-YGTTTTTYGTTAGGTTTTGTYGTC-3’；

R：5’-ACRCCAAAATCCACCTAATCR-3’；

PCR檢測(cè)反應(yīng)體系為：8-10×PCR緩沖液、0.8-1.2mM dNTPs、0.8-1.2uM擴(kuò)增引物(SEQ NO 1和SEQ NO 2)、0.5-2ng模板DNA，0.05-0.1U/ul DNA聚合酶。

所述dNTPs包括：10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP。

所述PCR緩沖液包括：TRIS.CL、氯化鉀、硫酸鎂和氯化鎂。

PCR檢測(cè)的反應(yīng)條件為：第一階段，92-97℃預(yù)變性5-15min；第二階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度62-66℃90sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)12-18次，每循環(huán)一次，所述退火溫度降低0.5℃；第三階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度53-57℃30sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)24-34次；第四階段，72℃10min；第五階段，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃下保存。

電泳檢測(cè)后將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶純化，測(cè)序反應(yīng)，上機(jī)測(cè)序；

所述酶純化的反應(yīng)條件為：37℃50min，95℃5min。所述測(cè)序反應(yīng)的反應(yīng)條件為：95℃4min，95℃15S；50℃20S；60℃2min，25個(gè)循環(huán)。

依據(jù)相關(guān)軟件獲得樣本的MSH3啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。以亞硫酸鹽處理后的MSH3啟動(dòng)子序列為標(biāo)準(zhǔn)序列，通過軟件分析獲得樣本的MSH3啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。

針對(duì)石蠟切片DNA片段化嚴(yán)重，而亞硫酸氫鹽修飾飽和狀態(tài)下仍呈現(xiàn)有效模板濃度低的問題，將Touch-down PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序相結(jié)合，可顯著提高檢測(cè)靈敏度。

實(shí)施例5

子宮頸癌樣本檢測(cè)：

選擇石蠟切片樣本10例，3例為已確診子宮頸癌樣本，3例為正常人樣本，其余4例為未知樣本。利用本發(fā)明的試劑盒按照實(shí)施例3中的方法進(jìn)行樣本DNA提取、亞硫酸處理、純化回收、PCR擴(kuò)增、測(cè)序及結(jié)果分析。

(1)材料：待測(cè)樣本、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、空白對(duì)照。

(2)儀器：移液器、高速離心機(jī)、NANODROP1000、渦旋震蕩以、冰箱、電泳儀、凝膠拍照系統(tǒng)，ABI 3500XL Genetic Analyzer，PCR儀。

(3)試劑：DNA聚合酶(凱杰)，DNA純化試劑(凱杰)，dNTPs(TaTaRa)、純化水，亞硫酸鹽處理試劑(凱杰)，EXOI(NEB)，CIP(NEB)，Bigdye Terminator(NEB).

(4)引物：所有引物純度達(dá)到PAGE級(jí)或HPLC級(jí)，不含雜帶。提供合成結(jié)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜，證明使用引物達(dá)到檢測(cè)要求。MSH3的引物序列如下：

F：5’-YGTTTTTYGTTAGGTTTTGTYGTC-3’；

R：5’-ACRCCAAAATCCACCTAATCR-3’；

(5)PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為：8-10X PCR緩沖液、0.8-1.2mM dNTPs、0.8-1.2uM如權(quán)利要求3所述的擴(kuò)增引物、0.5-2ng模板DNA，0.05-0.1U/ul DNA聚合酶。

(6)所述dNTPs中包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP，所述PCR緩沖液包含TRIS.CL、氯化鉀、硫酸鎂和氯化鎂。

(7)所述PCR檢測(cè)的反應(yīng)條件為：第一階段，92-97℃預(yù)變性5-15min；第二階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度62-66℃90sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)12-18次，每循環(huán)一次，所述退火溫度降低0.5℃；第三階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度53-57℃30sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)24-34次；第四階段，72℃10min；第五階段，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃下保存。

(8)電泳檢測(cè)后將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶純化，測(cè)序反應(yīng)，上機(jī)測(cè)序；

(9)所述酶純化的反應(yīng)條件為：37℃50min，95℃5min。所述測(cè)序反應(yīng)的反應(yīng)條件為：95℃4min，95℃15S；50℃20S；60℃2min，25個(gè)循環(huán)。

(10)依據(jù)相關(guān)軟件獲得樣本的MSH3啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。以亞硫酸鹽處理后的MSH3啟動(dòng)子序列為標(biāo)準(zhǔn)序列，通過軟件分析獲得樣本的MSH3啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。

10例樣本的MSH3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)結(jié)果如下表所示：

檢測(cè)樣本的MSH3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)結(jié)果如圖3和圖4所示，圖3為S4樣本檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果為陰性(箭頭指CG位點(diǎn))。圖4為為S1樣本檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果為陽性(箭頭指CG位點(diǎn))。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司

<120> MSH3基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的引物和檢測(cè)方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ygtttttygt taggttttgt ygtc 24

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acrccaaaat ccacctaatc r 21

<210> 3

<211> 198

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgttttttgt taggttttgt tgttgggttg ttatttttgt tttgttatgt tttgttggaa 60

gtttgtgttg ggtggttttg ttgtttttag tttagttttt gtgaggtaag tggttttgag 120

ttgatttttt tagtttatgg gaagtttgaa atttattttt ttttttatag gtgtagttga 180

ttaggtggat tttggtgt 198

<210> 4

<211> 198

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgtttttcgt taggttttgt cgtcgggttg ttatttttgt tttgttatgt ttcgtcggaa 60

gtttgcgtcg ggcggtttcg ttgtttttag tttagttttt gcgaggtaag cggttttgag 120

tcgatttttt tagtttacgg gaagtttgaa atttattttt ttttttatag gtgtagtcga 180

ttaggtggat tttggcgt 198