本發(fā)明屬于食品健康領域，特別涉及一種對食品中大豆過敏原P34蛋白基因進行定量的檢測方法。
背景技術(shù)：
大豆是一種常見的食品過敏原，被稱為八大類食品過敏原之一，美國、歐盟等都要求在食品標簽中強制性標識。大豆具有較高的營養(yǎng)價值，可作為食品原料廣泛用于各類食品的制作大豆蛋白、大豆卵磷脂等，也常作為重要的食品添加劑(乳化劑、穩(wěn)定劑、發(fā)泡劑、凝固劑等)廣泛應用于食品工業(yè)，如嬰兒配方食品、肉類產(chǎn)品、面包點心、乳制品和各種可食用產(chǎn)品。大豆作為配料中的組成成分，可能在標簽標識中不能體現(xiàn)，但它是一種潛在的過敏原，其危害性不容忽視。為確保消費者尤其是食品過敏人群的健康安全，近年來一些國家和國際組織相繼出臺了食品過敏原標識的法律法規(guī)，如食品法典委員會《預包裝食品標識法典通用準則》，美國《食品過敏原標簽及消費者保護法》、歐盟2003/89/EC指令、2006/142/EC指令等對食品標簽過敏原標識都作了嚴格規(guī)定。美國、歐盟、加拿大、澳大利亞、新西蘭等國家要求在食品標簽中強制性標識大豆、花生、奶、蛋等過敏原。大豆P34蛋白是大豆的主要過敏蛋白，也被稱為Gly m Bd 30k蛋白或30K，P34蛋白廣泛存在于所有大豆品種中，有研究結(jié)果表明65％的大豆過敏癥狀都是由P34蛋白引起的。
基于以上的分析和目前迫切的需求，本領域技術(shù)人員致力于開發(fā)一種能夠簡單、快速、準確鑒定食品中大豆過敏原的技術(shù)。以便能夠為保護消費者健康和知情權(quán)及食品標簽過敏原標識提供技術(shù)保障，對保障出口企業(yè)國際貿(mào)易的順利進行等。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種對食品中大豆過敏原P34蛋白基因(NC_016095.2)進行定量的檢測方法。
本發(fā)明的第一方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒用于對大豆過敏原P34蛋白基因進行鑒定，并且所述試劑盒中包括引物對：
上游引物：5’-ATATAGGAAGCGGTTGGGCG-3’(SEQ ID NO.1)；和
下游引物：5’-CTTTTCCCACCAAAATTGACCG-3’(SEQ ID NO.2)。
進一步地，所述試劑盒還包括DNA提取試劑。
進一步的，所述DNA提取試劑選自下組的一種或多種：
CTAB緩沖液，蛋白酶K，水飽和酚、三氯甲烷和異戊醇的混合溶液(體積比為25:24:1)，異丙醇，TE緩沖液，RNA酶溶液，三氯甲烷和異戊醇混合溶液(體積比為24:1)，70％(v/v)乙醇。
進一步地，所述試劑盒還包括用于實時熒光定量PCR的試劑。
進一步地，所述用于實時熒光定量PCR的試劑包括：
探針：5’-(FAM)ACATGGTGGGATTGCCACTGATG-Eclipse-3’(SEQ ID NO.3)。
進一步地，所述試劑盒還包括用于擴增18S rRNA基因的引物，優(yōu)選地，所述引物序列如下：
上游引物：:5’-TCTGCC CTATCA ACTTTCGATGGTA-3’(SEQ ID NO.4)
下游引物：5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’(SEQ ID NO.5)。
本發(fā)明的第二方面，提供了一種對食品中大豆過敏原P34蛋白基因進行定量的方法，所述方法包括步驟：
1)DNA提取
提供待測樣品，并自所述待測樣品中提取DNA，作為后續(xù)PCR擴增的模板；
2)實時熒光定量PCR
使用如下引物對，對步驟1)獲得的DNA進行實時熒光定量PCR：
上游引物：5’-ATATAGGAAGCGGTTGGGCG-3’(SEQ ID NO.1)；和
下游引物：5’-CTTTTCCCACCAAAATTGACCG-3’(SEQ ID NO.2)。
進一步地，所述步驟2)中，實時熒光定量PCR中使用的探針序列為：
5’-(FAM)ACATGGTGGGATTGCCACTGATG-Eclipse-3’(SEQ ID NO.3)。
進一步地，所述步驟1)包括步驟：
將大豆樣品研磨成粉狀，稱取100mg制備好的樣品于2mL離心管中，加入600L CTAB緩沖液和10L蛋白酶K，振蕩混勻，65℃30min，期間每隔10min振蕩混勻；加入500L水飽和酚、三氯甲烷和異戊醇的混合液，體積比為25:24:1；劇烈振蕩，12 000g離心15min；吸取上清液至一新離心管中，加入等體積異丙醇，振蕩均勻，12 000g離心10min；棄去上清液，用預熱至65℃的TE緩沖液溶解DNA；加入5L RNA酶溶液，37℃，30min；加入200μL三氯甲烷:異戊醇(體積比24:1)，劇烈振蕩，12 000g離心15min；吸取上清液至一新離心管中，加入等體積異丙醇，振蕩均勻，12 000g離心10min；棄去上清液，70％乙醇洗滌一次，12 000g離心1min；棄上清液，晾干；加入50L TE緩沖液，溶解DNA沉淀。
進一步地，所述步驟2)中，PCR擴增體系包括：
實時熒光PCR混合液12.5μL，上游引物、下游引物(10M)各1L，探針(5M，5’-(FAM)ACATGGTGGGATTGCCACTGATG-Eclipse-3’(SEQ ID NO.3))0.5L，模板DNA 100ng，水補足至25L。
進一步地，所述步驟2)中，實時熒光PCR反應循環(huán)參數(shù)為:
50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，40個循環(huán)。
進一步地，所述步驟2)中，還包括步驟：對18S rRNA基因進行PCR擴增。通過對18S rRNA基因進行監(jiān)測，能夠?qū)ι蠘恿窟M行定量。
進一步地，所述步驟2)中，對18S rRNA基因進行PCR擴增的PCR反應體系為:PCR預混合液12.5L，引物(5M，上游引物為5’-TCTGCC CTATCA ACTTTCGAT GGTA-3’(SEQ ID NO.4)；下游引物為5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCT T-3’(SEQ ID NO.5))各0.5L，模板100ng，反應體積為25L。
進一步地，所述步驟2)中，對18S rRNA基因進行PCR擴增的擴增條件為94℃，3min；94℃，20s，54℃，40s，72℃，40s，40個循環(huán)；72℃，5min。
進一步地，所述方法還包括步驟：DNA濃度測定及配制
用核酸蛋白濃度分析儀測定步驟1)獲得的樣品DNA的濃度，用ddH2O將抽提的DNA溶液(100ng/L)稀釋成10ng/L。對DNA濃度測定及配制用來制作標準曲線，用于Ct值與大豆過敏原含量的換算。
進一步地，所述方法還包括步驟，3)結(jié)果鑒定：
觀察步驟2)熒光定量PCR的擴增曲線、Ct值及電泳結(jié)果，如CT值在18.26-28.71區(qū)間，則認定結(jié)果為陽性，樣品含有食品過敏原P34；如無目標片段，則認定結(jié)果為陰性，樣品不含有大豆過敏原。
本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明設計的引物對只是針對大豆物種的P34基因序列進行特異性擴增，其他物種不能擴增出來，采用普通PCR即可進行大豆過敏原的鑒定，不需要進行酶切和測序。配合本發(fā)明的探針，可以進行熒光定量PCR檢測，不僅檢測的穩(wěn)定性好，而且檢測靈敏度極高。本發(fā)明操作方便，檢測時間短，具有很好的應用前景，滿足于市場監(jiān)督檢測。
以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。
附圖說明
圖1是根據(jù)獲得是實時熒光定量PCR檢測獲得的CT值與過敏原大豆成分比例換算曲線。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
本發(fā)明中針對大豆過敏原P34蛋白基因，設計了數(shù)十對的引物和探針進行測試，其中有些引物對雖然特異性較好，但是擴增不穩(wěn)定，結(jié)果準確率較低，容易造成假陰性的結(jié)果；有些引物對穩(wěn)定性較好，但是靈敏度較低。經(jīng)過大量測試，最終獲得了特異性好，擴增穩(wěn)定，靈敏度高的擴增引物對：上游引物5’-ATATAGGAAGCGGTTGGGCG-3’(SEQ ID NO.1)和下游引物5’-CTTTTCCCACCAAAATTGACCG-3’(SEQ ID NO.2)，配合探針序列5’-(FAM)ACATGGTGGGATTGCCACTGATG-Eclipse-3’(SEQ ID NO.3)，對大豆制品樣品進行檢測，檢測靈敏度可以達到0.001％(w/w)。
實施例1
為了便于直觀理解本發(fā)明的技術(shù)方案，在上海市各區(qū)菜場采集小麥和大豆樣品2份，按照上述方法進行檢測。
步驟一：DNA提取
用冷凍研磨機將大豆樣品研磨成粉狀。稱取100mg已制備好的樣品于2mL離心管中，加入600L CTAB緩沖液和10L蛋白酶K，振蕩混勻，65℃30min，期間每隔10min振蕩混勻；加入500L水飽和酚、三氯甲烷和異戊醇的混合液，體積比為25:24:1；劇烈振蕩，12 000g離心15min；吸取上清液至一新離心管中，加入等體積異丙醇，振蕩均勻，12 000g離心10min；棄去上清液，用預熱至65℃的TE緩沖液溶解DNA；加入5L RNA酶溶液，37℃，30min；加入200μL三氯甲烷:異戊醇(24:1)，劇烈振蕩，12 000g離心15min；吸取上清液至一新離心管中，加入等體積異丙醇，振蕩均勻，12 000g離心10min；棄去上清液，70％乙醇洗滌一次，12 000g離心1min；棄上清液，晾干；加入50L TE緩沖液，溶解DNA沉淀。
步驟二：DNA濃度測定及配制
用德國Eppendorf Biophotometer型核酸蛋白濃度分析儀測定抽提樣品DNA的濃度。用ddH2O將抽提的大豆DNA溶液(100ng/L)稀釋成10，1，0.1，0.01，0.001，0.0001和0.00001ng/L混合液。
步驟三：實時熒光定量PCR
反應體系為:實時熒光PCR混合液12.5μL，正、反向引物(10M)各1L，探針(5M，5’-(FAM)ACATGGTGGGATTGCCACTGATG-Eclipse-3’(SEQ ID NO.3))0.5 L，模板DNA 100ng，水補足至25L。實時熒光PCR反應循環(huán)參數(shù):50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，40個循環(huán)。
18S rRNA基因引物PCR反應體系:PCR預混合液12.5L，引物(5M，上游引物為5’-TCTGCC CTATCA ACTTTCGAT GGTA-3’(SEQ ID NO.4)；下游引物為5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCT T-3’(SEQ ID NO.5))各0.5L，模板100ng，反應體積為25L。
擴增條件為:94℃，3min；94℃，20s，54℃，40s，72℃，40s，40個循環(huán)；72℃，5min。
步驟四、結(jié)果鑒定
觀察Ct值電泳結(jié)果，使用過敏原大豆成分引物對10，1，0.1，0.01，0.001和0.0001％大豆粉含量(W/W)的樣品DNA進行檢測。10，1，0.1，0.01，0.001％大豆粉在3次檢測中均出現(xiàn)擴增曲線，而0.0001％大豆粉在3次檢測中均未出現(xiàn)擴增曲線，根據(jù)稀釋比例和獲得的Ct值進行統(tǒng)計，獲得換算曲線(圖1)。實驗表明，在重量百分比水平上，該方法的檢測靈敏度為0.001％大豆粉(w/w)。
實施例2
為了便于直觀理解本發(fā)明的技術(shù)方案，在市場上采購10個國內(nèi)市場流通的市售食品進行檢測，按照上述方法進行檢測。
步驟一：DNA提取
用冷凍研磨機將樣品研磨成粉狀。稱取100mg已制備好的樣品于2mL離心管中，加入600L CTAB緩沖液和10L蛋白酶K，振蕩混勻，65℃30min，期間每隔10min振蕩混勻；加入500L水飽和酚、三氯甲烷和異戊醇的混合液，體積比為25:24:1；劇烈振蕩，12 000g離心15min；吸取上清液至一新離心管中，加入等體積異丙醇，振蕩均勻，12 000g離心10min；棄去上清液，用預熱至65℃的TE緩沖液溶解DNA；加入5L RNA酶溶液，37℃，30min；加入200μL三氯甲烷:異戊醇(24:1)，劇烈振蕩，12 000g離心15min；吸取上清液至一新離心管中，加入等體積異丙醇，振蕩均勻，12 000g離心10min；棄去上清液，70％乙醇洗滌一次，12 000g離心1min；棄上清液，晾干；加入50L TE緩沖液，溶解DNA沉淀。
步驟二：DNA濃度測定及配制
用德國Eppendorf Biophotometer型核酸蛋白濃度分析儀測定抽提樣品DNA的濃度。用ddH2O將抽提的DNA溶液(100ng/L)稀釋成10，1，0.1，0.01，0.001，0.0001和0.00001ng/L混合液。
步驟三、實時熒光定量PCR
反應體系為:實時熒光PCR混合液12.5μL，正反向引物(10M)各1L，探針(5M)0.5L，模板DNA 100ng，水補足至25L。實時熒光PCR反應循環(huán)參數(shù):50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，40個循環(huán)。
18S rRNA基因引物PCR反應體系:PCR預混合液12.5L，引物(5M)各0.5L，模板100ng，反應體積為25L。擴增條件為:94℃，3min；94℃，20s，54℃，40s，72℃，40s，40個循環(huán)；72℃，5min。
步驟四、結(jié)果鑒定
在10個市售食品中，有2個樣品檢測結(jié)果與食品標簽不符；在1個未標識大豆成分的餅干中檢出大豆過敏原成分；在1份標識大豆成分的香腸中未檢出大豆過敏原成分(表1)。
表1.10份市場來源食品大豆過敏原成分檢測結(jié)果。
以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術(shù)人員無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術(shù)方案，皆應在由權(quán)利要求書所確定的保護范圍內(nèi)。
序列表
<110> 河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院
<120> 一種對食品中大豆過敏原P34蛋白基因進行定量的檢測方法
<130> 0002
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atataggaag cggttgggcg 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cttttcccac caaaattgac cg 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acatggtggg attgccactg atg 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tctgccctat caactttcga tggta 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aatttgcgcg cctgctgcct tcctt 25