本發(fā)明涉及植物次生代謝產(chǎn)物分離純化領(lǐng)域，具體涉及一種從藥用植物中提取、分離具有抗腫瘤活性的松香烷型二萜化合物及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

長(zhǎng)葉大青為馬鞭草科大青屬藥用植物。大青屬植物味苦，性寒，有清熱解毒，祛風(fēng)除濕的功效，用于治療乙腦、流腦、感冒高燒、頭痛、腸炎、痢疾、黃疸、齒痛、鼻衄、咽喉腫痛等癥,為我國(guó)傳統(tǒng)民間中藥。中醫(yī)臨床作為抗病毒感染藥物療效確切，被用于傳染性肝炎、流行性感冒、上呼吸道感染及登革熱的治療，臨床效果顯著。

本發(fā)明中的化合物為松香烷型二萜化合物是一種新的化合物，在已有文獻(xiàn)中未見報(bào)道，實(shí)驗(yàn)證實(shí)該化合物具有較好的抗腫瘤活性，可在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供了從長(zhǎng)葉大青中分離得到一種新的二萜化合物，如式(i)所示松香烷型二萜化合物為：12(16),8(9)–二環(huán)氧–18(4→3)–移–3,5,12–松香烷三烯–7,11,14–三酮。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述松香烷型二萜化合物的制備方法

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述松香烷型二萜化合物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，尤其是在抗白血病或人肺癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

一種如式(i)所示的松香烷型二萜化合物的制備方法，所述方法具體按如下步驟進(jìn)行：

(1)以干燥的長(zhǎng)葉大青枝條碎片為原料，用90％-95％的乙醇水溶液加熱回流提取，提取完畢，合并提取液減壓濃縮后得浸膏。

(2)將步驟(1)所得浸膏加水混合成懸濁液后，用等量乙酸乙酯萃取，合并萃取液，得到乙酸乙酯萃取物。

(3)取步驟(2)所得乙酸乙酯萃取物，進(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液并通過薄層層析分析，對(duì)相似組分進(jìn)行合并，得到不同的組分。

(4)將步驟(3)所得不同的組分進(jìn)行反相c18柱層析，分別采用20％、40％、60％和80％的甲醇水溶液作為流動(dòng)相，收集洗脫液。

(5)將步驟(4)所得洗脫液通過凝膠柱色譜分析，以甲醇：氯仿＝4:1作為流動(dòng)相，得到式(i)所示的松香烷型二萜化合物。

進(jìn)一步，步驟(1)中所述提取是在回流溫度下提取3次，每次為6小時(shí)。

進(jìn)一步，步驟(1)中乙醇加入量以長(zhǎng)葉大青枝條碎片質(zhì)量計(jì)為5ml/g。

進(jìn)一步，步驟(3)中洗脫梯度石油醚:乙酸乙酯的體積比依次為100：1、20：1、5：1、3：1、1：1、1：3和1：10。

再進(jìn)一步，步驟(4)中所述組分為步驟(3)以石油醚：乙酸乙酯為3:1為洗脫劑得到的洗脫部分。

更進(jìn)一步，步驟(5)中所述組分為步驟(4)中以80％甲醇水溶液洗脫所得部分。更進(jìn)一步，本發(fā)明中所得二萜化合物經(jīng)過抗腫瘤活性檢測(cè)，結(jié)果顯示該化合物具有良好的抗腫瘤活性，可為醫(yī)藥工業(yè)提供有藥用價(jià)值的新化合物或先導(dǎo)化合物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：

1、提供一種具有抗腫瘤活性的新化合物。

2、操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，提高了長(zhǎng)葉大青的藥用價(jià)值。

附圖說明：

圖1為式(i)所示的單體化合物的氫譜(氘代試劑：cdcl3)。

圖2為式(i)所示的單體化合物的碳譜(氘代試劑：cdcl3)。

圖3為式(i)所示的單體化合物的dept135譜(氘代試劑：cdcl3)。

圖4為式(i)所示的單體化合物的cosy譜(氘代試劑：cdcl3)。

圖5為式(i)所示的單體化合物的hsqc譜(氘代試劑：cdcl3)。

圖6為式(i)所示的單體化合物的hmbc譜(氘代試劑：cdcl3)。

具體實(shí)施方式：

為了使本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)更加明白清楚，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，必須說明此處所描述的具體實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1：

(1)取干燥的長(zhǎng)葉大青枝條碎片9kg作為原料，用90％的乙醇45l加熱回流提取3次，每次6小時(shí)，合并提取液并減壓濃縮后得浸膏(630g)。

(2)取500g浸膏加2l的水混合成懸濁液后，用等體積(2l)的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，乙酸乙酯萃取相(81g)。

(3)采用浸膏70g，以100g硅膠拌樣，1500g硅膠裝柱，進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度分別為100:1，20:1，5:1，3:1，1:1，1:3，1:10，每個(gè)梯度收集10個(gè)餾分，共70個(gè)餾分，每個(gè)餾分為500ml，所得餾分通過薄層層析分析將相似組分合并，共得到19個(gè)組分、分別為e1-e19。

(4)在石油醚-乙酸乙酯(3:1)洗脫部分得到組分e11(0.8g)，對(duì)此進(jìn)行反相c18柱層析，采用20％、40％、60％及80％的甲醇水溶液作為流動(dòng)相，分別得到組分e11-1～e11-4。

(5)將e11-4組分過sephadexlh-20凝膠柱色譜，以甲醇：氯仿＝4:1作為流動(dòng)相，得到單體化合物12(16),8(9)–二環(huán)氧–18(4→3)–移–3,5,12–松香烷三烯–7,11,14–三酮90mg,收率0.01％。

實(shí)施例2：

(1)取干燥的長(zhǎng)葉大青枝條碎片100g作為原料，用95％的乙醇500ml加熱回流提取3次，每次6小時(shí)，合并提取液并減壓濃縮后得浸膏(6.5g)。

(2)取5g浸膏加20ml的水混合成懸濁液后，用等體積20ml的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，乙酸乙酯萃取相0.82g。

(3)采用浸膏0.7g，以1g硅膠拌樣，15g硅膠裝柱，進(jìn)行硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度分別為100:1，20:1，5:1，3:1，1:1，1:3，1:10，每個(gè)梯度收集10個(gè)餾分，共70個(gè)餾分，每個(gè)餾分為5ml，所得餾分通過薄層層析分析將相似組分合并，共得到19個(gè)組分、分別為e1-e19。

(4)在石油醚-乙酸乙酯(3:1)洗脫部分得到組分e11(0.008g)。對(duì)此進(jìn)行反相c18柱層析，采用20％、40％、60％和80％的甲醇水溶液作為流動(dòng)相，分別得到組分e11-1～e11-4。

(5)將e11-4組分過sephadexlh-20凝膠柱色譜，以甲醇：氯仿＝4:1作為流動(dòng)相，得到單體化合物12(16),8(9)–二環(huán)氧–18(4→3)–移–3,5,12–松香烷三烯–7,11,14–三酮，1mg，得率0.01％。

實(shí)施例3二萜單體化合物結(jié)構(gòu)鑒定

由圖1～圖6為所述單體化合物的核磁共振波譜圖可知，¹h–nmr(cdcl3)譜中顯示分子中含有4個(gè)甲基氫原子的吸收峰:δh1.49(3h,d,j＝13.0,h–17),1.39(3h,s,me–18),1.79(3h,s,me–19),1.89(3h,s,me–20)；2個(gè)次甲基上的氫原子:δh5.93(1h,s,h–6),5.10(1h,m,h–16)；6個(gè)亞甲基質(zhì)子δh3.16(1h,dd,j＝15.4,9.6,h–15α),2.70(1h,dd,j＝15.4,7.2,h–15β),1.91(1h,m,h–1α),2.89(1h,dd,j＝15.3,7.3,h–1β),1.91(1h,m,h–2α),2.26(1h,m,h–2β)。

¹³c–nmr譜＝中顯示分子中含有20個(gè)碳原子,結(jié)合dept譜可知分子中含有4個(gè)ch3,3個(gè)飽和ch2,2個(gè)次甲基,11個(gè)季碳；碳譜中顯示分子中含有3個(gè)羰基碳原子δc188.8,182.9,181.7；3個(gè)雙鍵δc142.3,123.9,157.3,115.8(ch),157.6,122.2,由于分子中含有20個(gè)氫原子,剩余5個(gè)不飽和度,可知分子中還有5個(gè)環(huán)。因此,化合物具有松香烷型二萜骨架。從hmbc譜圖可知,δh1.49(3h,d,j＝13.0,h–17),δh1.39(3h,s),δh1.79(3h,s),δh1.89(3h,s)的甲基氫原子分別位于c–17,18,19,20位。δh5.10和δh3.16(1h,dd,j＝15.4,9.6,h–15α),δh2.70(1h,dd,j＝15.4,7.2,h–15β),δh1.49(3h,d,j＝13.0,h–17)分別相關(guān),所以化合物i結(jié)構(gòu)式為

實(shí)施例4對(duì)松香烷型二萜化合物進(jìn)行了抗hl-60和a549腫瘤實(shí)驗(yàn)：

體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度(50000～100000個(gè)/毫升)，每孔100μl細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種24h后給藥(100μl/孔)，分別設(shè)空白對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組以及6個(gè)濃度(1.56，3.12，6.25，12.5，25，50μmol/l)受試藥物組。繼續(xù)培養(yǎng)72h后每孔加入100μlmtt(1mg/ml，以dmem培養(yǎng)液溶解)，37℃孵育4h，棄去各孔內(nèi)液體后加入150μl酸化異丙醇(含0.04mol/lhcl)，避光放置30min，酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處吸光度，計(jì)算受試藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率，并以孫瑞元教授編寫的ndst(newdrugstatisticaltreatment)軟件計(jì)算受試物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖(72h)的半數(shù)抑制濃度(ic50)。表1對(duì)hl-60和a549細(xì)胞的72小時(shí)半致死濃度.(μmol/l)

由表1所示的試驗(yàn)結(jié)果可知，實(shí)施例制備的式ⅰ所示化合物對(duì)白血病細(xì)胞hl-60細(xì)胞和人肺癌a549細(xì)胞的72h后的ic50值均小于20μmol/l，表明實(shí)施例制備的式ⅰ所示化合物對(duì)上述2種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。