本發(fā)明涉及大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)拮抗菌高效的篩選方法，屬于生物防治研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)是一類分布廣泛、破壞力極強的植物土傳病病原真菌，可引起世界范圍內(nèi)寄主植物產(chǎn)生黃萎病害。該病菌不僅地區(qū)分布廣，而且寄主范圍也十分廣泛，可以侵染400多種植物，包括一年生及多年生農(nóng)作物、蔬菜、花卉、果蔬、木本觀賞植物和纖維油料作物，且該病菌的寄主范圍仍在繼續(xù)擴大。大麗輪枝菌可以在棉花、馬鈴薯、生菜和橄欖等許多作物上造成50％或者更加慘重的經(jīng)濟損失；在未經(jīng)土壤熏蒸處理的草莓田中可造成的經(jīng)濟損失高達75％；與根結(jié)線蟲共存時可導致的損失更大。
黃萎病是土壤傳播的維管束病害，該病的病原菌大麗輪枝菌以微菌核的休眠結(jié)構(gòu)在土壤中存活可達十幾年之久，防治難度較大，目前尚無特效的防治藥劑。選育抗病品種是防治黃萎病最經(jīng)濟有效的措施，但抗病育種的抗源材料短缺、抗病水平不高，且黃萎病抗性穩(wěn)定性遺傳研究至今尚無確切結(jié)論，單純依靠選育抗病品種對黃萎病的防治具有一定的局限性；在過去的50多年中，用溴甲烷進行土壤熏蒸成為防治黃萎病不可或缺的手段，然而化學防治對生態(tài)環(huán)境及人類健康帶來較大威脅，2005年1月溴甲烷在發(fā)達國家已全面禁止使用，發(fā)展中國家也于2015年全面淘汰溴甲烷。
生物防治是一種有潛力的防治方法，以其高效、綠色環(huán)保見長，尤其是在防治黃萎病這類土傳病害方面具有重要意義。至今已有多種生防菌被用于黃萎病防治方面的研究。拮抗菌包括細菌如芽孢桿菌、熒光假單孢桿菌，真菌如木霉、淡紫擬青霉菌以及菌根真菌。生物防治的前提，是篩選出高效的拮抗菌。然而傳統(tǒng)的拮抗細菌篩選過程較為繁雜，將采集的樣品進行梯度稀釋后涂布培養(yǎng)，然后需要將平板長出的所有細菌一一挑出劃線純化，然后再將所有的菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上采樣平板對峙法逐一進行拮抗實驗。平板涂布培養(yǎng)時長出的成百上千個細菌，大部分細菌是沒有拮抗作用的，這樣沒有針對性的逐一篩選，造成許多重復和繁雜的工作，工作量大，效率低。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于針對傳統(tǒng)拮抗菌篩選工作量大、效率低的的實際問題，建立了一種從土壤樣品中高效、快速的拮抗細菌篩選方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：
1.拮抗細菌的篩選：
a.稱取10g待分離拮抗細菌的土壤樣品加入100mL含玻璃珠的無菌水中，靜置20min，在200r/min搖床中振蕩30min，即為土壤懸液。用無菌移液槍吸取5mL土壤懸液加入45mL無菌水中，按1∶10進行系列稀釋，得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5的稀釋液，取適宜的稀釋度，用無菌移液槍吸取100μL不同稀釋梯度的稀釋液均勻涂布于直徑為15cm的LB培養(yǎng)基平板上，每梯度重復涂布3個平板，平板置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d。
b.將大麗輪枝菌接種在PDA培養(yǎng)基中活化，取菌落邊緣處菌塊接種于PDB液體培養(yǎng)基中，25℃，200r/min振蕩培養(yǎng)7d。無菌紗布過濾除去菌絲后，用血球計數(shù)板對大麗輪枝菌孢子計數(shù)，并將孢子液濃度稀釋為1×107CFU/mL。
c.將噴霧器放入70℃烘箱加熱1h滅菌，將大麗輪枝菌孢子液加入滅菌的噴霧器中，在長有細菌的平板上噴1.5mL大麗輪枝菌孢子液，待平板中噴霧的孢子液在超凈工作臺中晾干后，將平板用封口膜封好后置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3d。
d.噴霧接種2-3d后，平板中長滿大麗輪枝菌菌絲，如果平板中的細菌周圍出現(xiàn)明顯的抑菌圈，說明該抑菌圈內(nèi)的細菌對大麗輪枝菌有一定的拮抗能力，為拮抗菌。
2.拮抗細菌分離純化：將所有抑菌圈內(nèi)的拮抗菌挑出，在另一LB平板中劃線，純化，平板置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1d，使平板上長出單菌落，觀察每個平板上單菌落的形態(tài)、大小顏色等性狀，如果有性狀不一致的菌落，則需要再次重復劃線純化過程，直到每個平板中的菌落性狀一致。
3.拮抗細菌驗證：用直徑為7mm的打孔器在大麗輪枝菌菌落邊緣打孔，將菌餅倒置接種至PDA平板中間，在距中心2.5cm的圓周上均勻取四個點，點接四個純化好的拮抗菌。接種好后，用封口膜包好，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，觀察抑菌圈的有無及大小，進一步確定該菌的拮抗作用。
4.拮抗菌的保存：將確定為拮抗菌的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，30℃，200r/min搖床培養(yǎng)24h，吸取菌液加入同體積30％的甘油，混勻后于-70℃保存。
本發(fā)明的優(yōu)點在于：從樣品中用稀釋涂布法分離出來的細菌量非常大，傳統(tǒng)的方法需將所有的細菌逐一挑出進行拮抗實驗，十分繁瑣。對篩選方法改善后，將樣品稀釋液涂布在直徑15cm的大平板上，待細菌菌落長出后，直接在同一平板上噴霧接種大麗輪枝菌，待大麗輪枝菌長滿平板時，只需將抑菌圈內(nèi)的細菌挑出，進行劃線純化，再進行平板拮抗實驗，篩選拮抗菌。與傳統(tǒng)的篩選方法比較，該發(fā)明大大縮小了篩選對象的范圍，極大的減少了工作量，節(jié)約了人力、物力及財力，對促進拮抗菌的篩選，加快生防菌的開發(fā)利用，具有重要的實際應用價值。
附圖說明
圖1是大麗輪枝菌拮抗細菌在LB平板上的初篩照片
具體實施方式
下面用實施例來進一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實施例1 培養(yǎng)基配制
配方一、普通細菌LB培養(yǎng)基
蛋白胨10.0g/L，酵母膏5.0g/L，NaCl 2.0g/L，瓊脂15～20g/L，pH 7.0-7.5。
配方二、普通真菌PDA培養(yǎng)基
馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂15～20g/L。
實施例2 土壤樣品中拮抗細菌篩選
a.采集江蘇省南京市田間病土，稱取10g土樣加入100mL含玻璃珠的無菌水中，靜置20min，在200r/min搖床中振蕩30min，即為土壤懸液。用無菌移液槍吸取5mL土壤懸液加入45mL無菌水中，按1∶10進行系列稀釋，得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5的稀釋液，取適宜的稀釋度，用無菌移液槍吸取10-4、10-5兩個稀釋梯度的稀釋液各100μL，均勻涂布于直徑為15cm的LB培養(yǎng)基平板上，每梯度重復涂布3個平板，平板置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d。
b.將大麗輪枝菌V茄nj接種在PDA培養(yǎng)基中活化，取菌落邊緣處菌塊接種于PDB液體培養(yǎng)基中，25℃，200r/min振蕩培養(yǎng)7d。無菌紗布過濾除去菌絲后，用血球計數(shù)板對V茄nj孢子計數(shù)，并將孢子液濃度稀釋為1×107CFU/mL。
c.將V茄nj孢子液加入滅菌的噴霧器中，在長有細菌的平板上噴1.5mL大麗輪枝菌孢子液，待平板中噴霧的孢子液在超凈工作臺中晾干后，將平板用封口膜封好后置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3d。
實施例3 拮抗細菌的純化
噴霧接種2-3d后，平板中長滿V茄nj菌絲，平板中出現(xiàn)明顯的抑菌圈(見圖1)，將所有抑菌圈內(nèi)的30株拮抗菌挑出，在另一LB平板中劃線，純化，平板置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1d，使平板上長出單菌落，觀察每個平板上單菌落的形態(tài)、大小顏色等性狀，如果有性狀不一致的菌落，則需要再次重復劃線純化過程，直到每個平板中的菌落性狀一致。
實施例4 拮抗細菌的驗證
用直徑為7mm的打孔器在V茄nj菌落邊緣打孔，將菌餅倒置接種至PDA平板中間，在距中心2.5cm的圓周上均勻取四個點，點接四次純化好的拮抗細菌。接種好后，用封口膜包好，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，進一步確定挑出的30株菌是否為拮抗菌，結(jié)果表明30株細菌均有拮抗作用，篩選效率為100％，其中1株細菌的抑菌圈達到8.0mm，拮抗效果最好。
實施例5 拮抗細菌的保存
通過復篩確定對V茄nj有拮抗作用的細菌，將拮抗細菌的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，30℃，200r/min搖床培養(yǎng)24h，吸取700μL菌液加入同體積30％的甘油，混勻后于-70℃保存，備用。