本發(fā)明涉及病毒檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地，涉及一種豬H1N1亞型流感病毒血凝素重組蛋白的制備方法及該病毒抗體的液相芯片檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：豬流感(SwineInfluenza，SI)是豬流感病毒(SwineInfluenzavirus，SIV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病，臨床上以突發(fā)、咳嗽、高熱、呼吸困難、精神沉郁、高發(fā)病率、低病死率為特征。目前，全球豬群中以經(jīng)典豬流感H1N1和類人H3N2亞型為主廣泛流行，盡管豬流感死亡率低，但是其可造成其他病原的繼發(fā)感染，對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬是人、禽流感病毒的易感宿主，是流感病毒跨種傳播的中間宿主，是流感病毒基因重組的“混合器”，是引起流感大爆發(fā)的重要原因。2009年，甲型H1N1流感病毒(pdm2009)在墨西哥、美國相繼爆發(fā)，該流行毒株是由人流感、豬流感和禽流感病毒基因自然重組而形成的一種新型流感病毒。該毒株的PB1基因來于H3N2人流感，PA和PB2基因來自于北美禽流感，NA和M基因來自歐亞類禽豬流感，HA、NP和NS基因來自經(jīng)典豬流感。該毒株能通過抗原的變異逃避機(jī)體的免疫系統(tǒng)，短時間內(nèi)迅速蔓延至全球，造成流感的大流行，而引起人們的關(guān)注。在豬場內(nèi)進(jìn)行定期的SIV抗體監(jiān)測對于預(yù)防其它疾病的出現(xiàn)，以及在人群中流行具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。液相芯片技術(shù)又稱為Luminex技術(shù)、xMAP技術(shù)，是美國Luminex公司于20世紀(jì)90年代中期開發(fā)的一種多功能液相生物芯片檢測技術(shù)。該技術(shù)集流式細(xì)胞技術(shù)、熒光技術(shù)、激光技術(shù)、傳統(tǒng)的化學(xué)技術(shù)和計算機(jī)處理系統(tǒng)為一體新型多通道高通量生物芯片檢測體系，具有高通量、重復(fù)性好、快速準(zhǔn)確的特點。目前，液相芯片檢測技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)、醫(yī)療保健、環(huán)境衛(wèi)生等領(lǐng)域的微生物檢測，在呼吸道、蟲媒介等病毒檢測、細(xì)菌檢測、基因檢測、藥物殘留、細(xì)胞因子檢測等方面廣泛應(yīng)用。2001年12月，美國食品與藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)了用于臨床診斷的液相芯片檢測技術(shù)，該技術(shù)是唯一一個被FDA認(rèn)證了的診斷技術(shù)。目前，豬流感病毒抗體診斷方法主要為血凝抑制試驗(hemagglutinationinhibitiontest，HI)和微量中和試驗(Microtitreneutralizationtest，MIVN)。其中，HI檢測方法簡單、易操作，但敏感性較差；MIVN檢測方法敏感性和特異性好，但操作繁瑣、周期長。鑒于此，需要建立一種操作簡便、敏感性高、特異性強(qiáng)的方法，對目前進(jìn)行補(bǔ)充和校對。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，首先提供一種豬流感病毒的血凝素重組蛋白的制備方法。本發(fā)明的第二個目的是提供上述方法制備得到的豬流感病毒的血凝素重組蛋白。本發(fā)明的第三個目的是提供所述豬流感病毒的血凝素重組蛋白作為免疫原在制備檢測豬流感病毒的試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個目的是提供一種檢測豬流感病毒的試劑盒。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：一種豬流感病毒的血凝素重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：S1.去除表達(dá)HA基因的信號肽的基因序列，利用HA-F和HA-R引物擴(kuò)增HA基因；其中，HA-F和HA-R引物的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；S2.連接pMAL-c5X載體，獲得pMAL-cHA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌誘導(dǎo)表達(dá)即可。SIV的血凝素蛋白(HA)頭部包含5個抗原決定簇，是流感病毒的主要表面抗原，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，從而起到保護(hù)機(jī)體的作用。同時血凝素是流感病毒亞型分類的依據(jù)，因此，HA蛋白是開發(fā)流感病毒疫苗以及檢測方法的首選生物材料。本研究應(yīng)用生物學(xué)軟件SignalPV2.0.b2對HA基因進(jìn)行信號肽分析，去除HA的信號肽。根據(jù)HA序列設(shè)計一對帶有His標(biāo)簽的引物，構(gòu)建了帶有6*His-麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)組合標(biāo)簽的原核表達(dá)質(zhì)粒。MBP標(biāo)簽由大腸桿菌K12的malE基因編碼，大小約為40KD，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中可增加目的蛋白的可溶性；同時，His標(biāo)簽便于重組蛋白的純化，易于進(jìn)行之后的實驗。前期研究中發(fā)現(xiàn)，若去除HA基因的跨膜區(qū)，容易影響HA基因表達(dá)的抗原的完整性，影響其免疫原性。保留跨膜區(qū)也是為了保留HA基因的抗體完整性及其天然構(gòu)象。使用pMAL-c5X載體的目的是增加目的重組蛋白的可溶性，借以保持其天然空間結(jié)構(gòu)及抗原性。但用于純化含有MBP標(biāo)簽重組蛋白的Amylose樹脂純化效率較低(即重組蛋白的純化效率和純化度低)，因此在上述pMAL-c5X重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，在HA基因下游引入6*His標(biāo)簽基因。其目的是在后期純化過程中使用Ni2+純化填料，提高目的蛋白的純化效率。最終，本研究構(gòu)建了帶有6*His-MBP組合標(biāo)簽的原核表達(dá)質(zhì)粒pMAL-cHA，成功獲得以可溶形式表達(dá)的HA重組蛋白。該蛋白能夠與H1N1亞型豬流感病毒HA鼠源抗體發(fā)生反應(yīng)，說明了HA重組蛋白具有良好的抗原性，為H1亞型SIV抗體檢測方法的建立奠定了基礎(chǔ)。優(yōu)選地，S2所述誘導(dǎo)表達(dá)的條件為IPTG0.3mM，溫度37℃，時間2小時。因此，本發(fā)明還提供所述方法獲得的豬流感病毒的血凝素重組蛋白。本發(fā)明還提供所述豬流感病毒的血凝素重組蛋白作為免疫原在制備檢測豬流感病毒的試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明以液相芯片技術(shù)為基礎(chǔ)，以SIVH1N1HA重組蛋白為抗原，建立一種豬流感病毒抗體檢測新方法。因此，本發(fā)明還提供一種檢測豬流感病毒的羧基化熒光微球46-HA，是將所述豬流感病毒的血凝素重組蛋白與羧基化熒光微球046(即第46號羧基化熒光微球)偶聯(lián)獲得。具體地，所述的檢測豬流感病毒的羧基化熒光微球46-HA的制備方法，包括以下步驟：S1.羧基化熒光微球的活化：將清洗后的羧基化熒光微球046分別依次重懸于磷酸氫二鈉緩沖液、Sulfo-NHS溶液和EDC溶液中進(jìn)行活化；S2.活化后的羧基化熒光微球046懸液中加入豬流感病毒的血凝素重組蛋白進(jìn)行孵育，并用PBS-TBN重懸即得。本發(fā)明還提供一種檢測豬流感病毒的試劑盒，所述試劑盒含有所述的豬流感病毒的血凝素重組蛋白，該豬流感病毒的血凝素重組蛋白可用于基于抗原抗體反應(yīng)原理的免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，所述試劑盒含有上述羧基化熒光微球46-HA，將偶聯(lián)好的微球避光保存于4℃，3個月時間內(nèi)仍然具有很好的穩(wěn)定性。具體地，針對利用羧基化熒光微球46-HA進(jìn)行液相芯片檢測的技術(shù)，所述試劑盒還含有生物標(biāo)記的雞抗鼠IgG抗體或者兔抗豬IgG抗體、鏈霉素-棗紅蛋白。更優(yōu)選地，所述生物標(biāo)記的雞抗鼠IgG抗體的稀釋度為1：1000，兔抗豬IgG抗體的稀釋度為1：5000，鏈霉素-藻紅蛋白的稀釋度為1：1000。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明首先提供了豬流感病毒的血凝素重組蛋白的制備方法，通過去除HA的信號肽。根據(jù)HA序列設(shè)計一對帶有HIS標(biāo)簽的引物，構(gòu)建了帶有6*His-麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)組合標(biāo)簽的原核表達(dá)質(zhì)粒。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功獲得以可溶形式表達(dá)的HA重組蛋白。該蛋白能夠與H1N1亞型豬流感病毒HA鼠源抗體發(fā)生反應(yīng)，說明了HA重組蛋白具有良好的抗原性，利用該凝素重組蛋白建立液相芯片檢測技術(shù)，靈敏度比ELISA高，該方法的建立，將為開展豬流感病毒抗體的檢測提供必要的技術(shù)補(bǔ)充，為其它疫病抗體液相芯片檢測技術(shù)的研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)，為多種豬病抗體多重液相芯片檢測技術(shù)的建立提供試驗依據(jù)。附圖說明圖1為HA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中，M：DL-2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1：樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2為重組質(zhì)粒pMAL-cHA酶切鑒定，其中，M：DL-2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1為重組質(zhì)粒雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3為HA重組蛋白表達(dá)結(jié)果，其中，M：DL-2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1：pMAL-c5X空載體誘導(dǎo)前；2：pMAL-c5X空載體誘導(dǎo)后；3：重組質(zhì)粒pMAL-cHA誘導(dǎo)前；4.重組質(zhì)粒pMAL-cHA誘導(dǎo)后。圖4為HA重組蛋白可溶性分析結(jié)果，其中，M：DL-2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1：pMAL-c5X空載體誘導(dǎo)后；2：重組質(zhì)粒pMAL-cHA誘導(dǎo)前；3：重組質(zhì)粒pMAL-cHA誘導(dǎo)后；4：菌液超聲破碎上清；5：菌液超聲破碎沉淀。圖5為HA重組蛋白的WesternBlot分析，其中，M：DL-2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1：Rosetta-pMAL-cHA誘導(dǎo)后；2：Rosetta-pMAL-cHA誘導(dǎo)前。圖6為HA蛋白的純化SDS-PAGE分析，其中，M：DL-2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1：Rosetta-pMAL-cHA純化前；2：Rosetta-pMAL-cHA純化后。圖7為偶聯(lián)和檢測方法可行性的驗證結(jié)果。圖8為單抗稀釋梯度的檢測結(jié)果。圖9為血清稀釋梯度檢測結(jié)果。圖10為檢測方法的特異性分析。具體實施方式下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建一、流感病毒總RNA的抽提與cDNA的合成參考RNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行病毒總RNA的提取。獲得總RNA后參照寶生物工程(大連)有限公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的使用說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，反應(yīng)體系如表1。表1反轉(zhuǎn)錄體系試劑名稱體積RNA9.5μL5×MLVBuffer4.0μLMLV反轉(zhuǎn)錄酶1.0μLdNTPs(2.5mmoleach)4.0μLRNaseInhibitor(20U/μL)0.5μL反轉(zhuǎn)錄引物1.0μL總計20μL表1中的各試劑加入后充分混勻，于42℃水浴鍋中放置1h，獲得cDNA產(chǎn)物置于-20℃凍存?zhèn)溆?。二、SIVH1N1HA基因的擴(kuò)增應(yīng)用Oligo7.0生物學(xué)軟件，根據(jù)SIVH1N1HA基因序列(GenBank：JN375120.1，去除表達(dá)信號肽部分的核苷酸序列)設(shè)計一對特異性引物，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，上、下游引物加入酶切位點，且下游引物加入His標(biāo)簽，引物序列為：HA-F：5’-TTGCGGCCGCGACACATTATGTATAGG-3’(NotI)；HA-R：5’-GCGTCGACATGATGATGATGATGATGAATACATATTCTACACTG-3’(SalI)；下劃線部分為引物的限制性酶切位點，限制性酶切位點名稱在引物后括號內(nèi)顯示；下游引物中斜體部分為表達(dá)6×His基因序列；HA基因擴(kuò)增片段長度為1,683bp。SIVH1N1HA基因的擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：10×TaqBuffer2.5μL、ExTaqDNA聚合酶0.25μL、HA-F0.5μL、HA-R0.5μL、模板1μL、ddH2O20.25μL；反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，退火溫度為55℃30s，72℃延伸2min，共30個循環(huán)，72℃終延伸7min，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖1，HA基因片段大小與預(yù)期相符，目的片段長度為1683bp。(圖1)。三、連接、轉(zhuǎn)化與鑒定應(yīng)用DNA膠回收試劑盒對首輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，連接pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落培養(yǎng)過夜，抽提質(zhì)粒并進(jìn)行PCR的初步鑒定，將陽性質(zhì)粒送至上海生工進(jìn)行測序鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pMD-SIVHA。將重組質(zhì)粒pMD-SIVHA進(jìn)行NotI和SalI限制性內(nèi)切酶的雙酶切，回收目的基因片段；同時對pMAL-c5X載體進(jìn)行NotI和SalI雙酶切，回收酶切載體片段。利用T4連接酶將HA與pMAL-c5X載體雙酶切片段進(jìn)行連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，鑒定結(jié)果如圖2，重組質(zhì)粒pMAL-cHA測序結(jié)果與目的基因的序列一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，即獲得pMAL-cHA重組質(zhì)粒。實施例2重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定將含有重組質(zhì)粒pMAL-cHA的Rosetta(DE3)大腸桿菌接種至Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)液中，培養(yǎng)物OD值達(dá)0.6時加入終濃度為0.3mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃培養(yǎng)2小時后，收集產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測；應(yīng)用Westernblot方法，以抗SIVHA單抗為一抗，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測。同時離心收集菌體，冰浴超聲破碎，再次離心后，沉淀物和上清液分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測，分析表達(dá)產(chǎn)物的溶解性。HA目的蛋白大小與預(yù)期相符，在約100KD處有一條目的條帶(圖3)，且目的蛋白在上清和沉淀中均有表達(dá)，說明該蛋白具有可溶性(圖4)。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至NC膜上，HA蛋白分別與各自單抗孵育，進(jìn)行Western-blot分析，結(jié)果顯示HA蛋白與其單抗均可發(fā)生特異性反應(yīng)，產(chǎn)生單一條帶(圖5)。說明了表達(dá)的目的蛋白具有抗原性，可用于基于抗原抗體反應(yīng)的檢測技術(shù)的建立。一、重組蛋白的純化超聲破碎后的上清液經(jīng)濾器(0.45μm)過濾，用GE填料填充的Ni2+親和層析柱過柱純化。主要操作步驟如下：放掉純化柱中20％乙醇溶液，用6倍柱體積的去離子水沖洗層析柱；用5～10倍柱體積的20mM咪唑緩沖液過柱，流速保持為每滴6s，平衡柱子；將上清液過柱，保持流速每滴6s，上清液重復(fù)過柱3遍；用10倍柱體積的20mM、80mM咪唑緩沖液洗脫雜蛋白，保持流速每滴6s；最后用500mM咪唑洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，保持流速每滴6s，每管收集1mL洗脫液。用分光光度計測定分段收集的目的蛋白的濃度并做SDS-PAGE進(jìn)行純度分析，純化后的HA蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析結(jié)果如圖6。實施例3應(yīng)用Rosetta-pMAL-cHA建立液相芯片檢測方法一、抗原與微球的偶聯(lián)參照Luminex公司的技術(shù)大全，兩步酰胺反應(yīng)：首先磷酸化微球經(jīng)磷酸氫二鈉緩沖液、Sulfo-NHS和EDC溶液成為活化狀態(tài)，其次利用實施例2制備得到的HA重組蛋白作為抗原與微球形成共價酰胺鍵，偶聯(lián)上抗原的微球用PBS-TBN溶液重懸于4℃避光保存。具體操作步驟如下：(1)漩渦儀振蕩微球懸液1min，使微球均勻散開；(2)取微球100μL轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，8000g/min，2min離心，并放于磁力架上，輕輕移走上清(不要吸走微球)；(3)加入100μLddH2O，渦旋1min，再8000g/min，2min離心，并放于磁力架上，輕輕移走上清(不要吸走微球)；(4)加入80μL100mM、pH＝6.2的磷酸二氫鈉鹽溶液(NaH2PO4)，渦旋1min，重懸微球；(5)加入10μL、50mg/mL的N-羥基硫代琥珀酰亞胺(N-Hydroxysulfosuccinimiesodiumsalt-Sulfo-NHS，N-Sulfo-NHS)，和10μL50mg/mL1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亞胺[1-thyl-3-(3-Dimethylaminoproy)carbodimideHydrochloride，EDC]，渦旋1min。(6)室溫孵育20min(每隔10min用漩渦儀輕振)，8000g/min，2min離心，并放于磁力架上，輕輕移走上清；(7)加入250μL50mM、pH＝5.0的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(2-(N-Moropholino)ethanesulfonicacid，MES)，渦旋1min，并放于磁力架上，輕輕移走上清；(8)重復(fù)步驟(7)一次；(9)將上述活化后的微球中加入100μL50mM、pH＝5.0的MES，渦旋1min，在混勻的磁珠中加入10μg的HA重組蛋白抗原，再用MES定容至500μL，渦旋1min；(10)在室溫下放在搖床上孵育2h，8000g/min，2～3min離心，并放于磁力架上，輕輕移走上清；(11)渦旋1min，再在搖床上孵育30min，8000g/min，2～3min離心，并放于磁力架上，輕輕移走上清；(12)再加入1mLPBS-TBN，8000g/min，2～3min離心，沉淀微球，棄上清，再重復(fù)一次；(13)加入1mLPBS-TBN，重懸微球，即得偶聯(lián)抗原的微球：46-HA(即第46號微球與HA重組蛋白偶聯(lián))，并4℃避光保存。二、樣品上機(jī)檢測參照Luminex公司的技術(shù)大全，具體步驟如下：(1)每孔加入50μL(2500個)偶聯(lián)有抗原的微球和50μL待檢測樣品(單抗或血清)，室溫震蕩(500r/min)避光孵育1h，用PBST洗滌2次，200μL/孔；(2)加入生物素標(biāo)記的雞抗鼠(1：1000)或兔抗豬(1：5000)IgG抗體100μL/孔，室溫震蕩(500r/min)避光孵育1h，用PBST洗滌2次，200μL/孔；(3)加入1：1000稀釋的鏈霉素-藻紅蛋白(SA-PE)100μL/孔，室溫震蕩(500r/min)避光孵育0.5h，用PBST洗滌2次，200μL/孔；(4)每孔加入125μL鞘液重懸，于Flex3D液相芯片檢測系統(tǒng)讀取中位數(shù)熒光強(qiáng)度(MFI)。三、偶聯(lián)效率的評價HA蛋白與46號微球偶聯(lián)，用偶聯(lián)有抗原的微球?qū)IV陽性血清、SIV陰性血清、PBS進(jìn)行檢測，結(jié)果表明陽性血清的MFI(meanfluorescenceintensities)大于10000，且大于5倍陰性對照的MFI，空白對照的MFI小于100(圖7)，且大于5倍陰性對照的MFI，空白對照的MFI小于100(圖7)，說明該偶聯(lián)方法和檢測方法是可行的。將HA單抗從初始濃度14.6ug/mL進(jìn)行2倍梯度稀釋，用液相蛋白芯片檢測方法檢測，MFI值采用SPSS軟件進(jìn)行擬合三次方程。結(jié)果表明，SIV液相蛋白芯片檢測方法的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.997，說明了曲線相關(guān)性好(圖8)。同時，當(dāng)單抗?jié)舛鹊椭?ng/mL時，該方法仍具有高靈敏度(圖8)。四、血清稀最佳釋度的確定SIV陽性血清、SIV陰性血清用PBS-1％BSA進(jìn)行梯度稀釋：1：50、1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600，每個稀釋度3個重復(fù)，以確定血清最佳稀釋倍數(shù)。檢測結(jié)果顯示血清的最佳稀釋倍數(shù)為1：200，當(dāng)血清稀釋至1：1600時，陽性血清的MFI大于臨界值，仍可檢測出陽性(圖9)。本研究建立的液相蛋白芯片檢測方法具有較高的靈敏度，當(dāng)血清稀釋至1：1600，檢測結(jié)果仍為陽性。此外，MFI值隨著血清濃度稀釋呈先升高后降低的趨勢。五、特異性試驗利用上述液相蛋白技術(shù)芯片檢測方法對豬常見疾病PRRSV、SIV、HEV、CSFV、PCV-2、PRV、FMDV陽性血清進(jìn)行檢測，以驗證該檢測方法的特異性。結(jié)果顯示：應(yīng)用SIV液相蛋白檢測方法時，只有SIV陽性血清檢測結(jié)果為陽性，其他疾病陽性血清檢測結(jié)果為陰性(圖10)。說明本研究建立的液相蛋白芯片檢測方法特異性好，與其它病毒陽性血清無交叉反應(yīng)。六、重復(fù)性試驗批內(nèi)重復(fù)：取HEV4份陽性血清、1份陰性血清，每份血清10個重復(fù)，通過計算其變異系數(shù)以評價該方法的批內(nèi)精密度。批間重復(fù)：取HEV11份陽性血清、1份陰性血清，每份血清3個重復(fù)，不同時間做3次，通過計算變異系數(shù)以評價該方法的批間精密度。SIV液相蛋白芯片檢測方法的批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為4.4～7.8％(表2)，批間變異系數(shù)為：2～10.6％(表3)。其平均批內(nèi)變異系數(shù)為：6.2％，平均批間變異系數(shù)為：6.5％(表4)；符合Luminex精密度的要求：批內(nèi)CV為不大于10％，批間CV不大于20％，說明該檢測方法具有良好的重復(fù)性。表2SIV液相蛋白芯片檢測方法批內(nèi)重復(fù)試驗表3SIV液相蛋白芯片檢測方法批間重復(fù)試驗表4平均批內(nèi)、批間變異系數(shù)批內(nèi)(CV％)批間(CV％)SIV4.4～7.8(6.2)2～10.6(6.5)七、液相蛋白芯片與ELISA的比較采用上述液相芯片檢測方法和ELISA同時檢測臨床血清，SIV110份，通過MedCalc軟件進(jìn)行ROC分析，確定最優(yōu)臨界值、靈敏度、特異性。同時通過配對卡方檢驗(關(guān)聯(lián)卡方檢驗，優(yōu)勢卡方檢驗)評價其符合率。結(jié)果顯示，SIV液相蛋白芯片檢測技術(shù)的靈敏度為96.6％，特異性為93.8％，臨界值為6511(表5)。表5液相蛋白芯片檢測方法ROC分析結(jié)果靈敏度(％)特異性(％)臨界值SIV96.693.86511關(guān)聯(lián)性卡方檢驗結(jié)果：SIV液相蛋白芯片法與ELISA檢測結(jié)果差異不顯著，具有一致性，能反映同一指標(biāo)(表6)，液相蛋白芯片和ELISA試劑盒對110份臨床血清樣品的檢測SIV陽性率分別為30.9％、26.4％，液相蛋白芯片檢測方法的靈敏度比ELISA高，與預(yù)期相符。表6MFIA與ELISA關(guān)聯(lián)卡方檢驗結(jié)果SEQUENCELISTING<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種豬H1N1的血凝素重組蛋白的制備方法及其血凝素重組蛋白和檢測試劑盒<130><160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>27<212>DNA<213>HA-F<400>1ttgcggccgcgacacattatgtatagg27<210>2<211>44<212>DNA<213>HA-R<400>2gcgtcgacatgatgatgatgatgatgaatacatattctacactg44當(dāng)前第1頁1 2 3