本發(fā)明涉及微生物分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種嗜肺軍團(tuán)菌dotA基因的LAMP引物組及其試劑盒和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

嗜肺軍團(tuán)菌（Legionella pneumophila，LP）是一種革蘭氏陰性桿菌，也是一種條件性致病菌及胞內(nèi)病原菌。它廣泛存在于天然淡水或人工水體中，是軍團(tuán)菌病最主要的致病原，也可引起龐蒂亞克熱。1976年，美國費(fèi)城召開的退伍軍人大會(huì)上暴發(fā)了一場大規(guī)模感染，221人出現(xiàn)非典型肺炎癥狀，22人死亡；次年分離出致病菌株，即嗜肺軍團(tuán)菌。此后，軍團(tuán)菌病在世界各地時(shí)有暴發(fā)流行，我國也于1982年首次報(bào)道了軍團(tuán)菌病的臨床病例。研究表明，軍團(tuán)菌病暴發(fā)的首要風(fēng)險(xiǎn)來自于中央空調(diào)冷卻塔和供水系統(tǒng)，因而有人稱其為“現(xiàn)代城市文明病”。而隨著我國城市化水平的提高，空調(diào)及供水系統(tǒng)逐漸普及，軍團(tuán)菌病及其致病原值得我們的警惕和重視。

傳統(tǒng)的嗜肺軍團(tuán)菌實(shí)驗(yàn)室檢測方法有分離培養(yǎng)、血清抗體檢測、尿抗原檢測等。細(xì)菌培養(yǎng)法是檢測嗜肺軍團(tuán)菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其生長所需營養(yǎng)豐富，耗時(shí)長，檢測成本高且效率低下；血清學(xué)檢測則存在滯后性，缺乏早期診斷意義；尿抗原檢測對血清型1型（LP1）以外的嗜肺軍團(tuán)菌敏感性較低。而近年來發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)以其快速、簡便、特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)，已在軍團(tuán)菌檢測及軍團(tuán)菌病快速診斷方面占有一席之地。其中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）無疑是一種相對成熟、應(yīng)用廣泛的方法。PCR依賴于熱循環(huán)完成擴(kuò)增，在實(shí)際應(yīng)用中往往離不開熱循環(huán)儀（即PCR儀）；而新興的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)能夠在恒溫條件下完成擴(kuò)增，實(shí)際應(yīng)用中只需一臺(tái)恒溫水浴鍋，應(yīng)用于病原微生物的檢測將更為簡便高效。

2000年，Notomi T.等報(bào)道了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）。該方法可在恒溫條件（60～65℃）下高效、快速地?cái)U(kuò)增DNA，且具有高特異性。LAMP利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）及一套針對靶序列6個(gè)不同區(qū)域的4條引物（FIP、BIP、F3、B3），可在1h內(nèi)實(shí)現(xiàn)10⁹倍的擴(kuò)增。

自LAMP誕生以來，將其應(yīng)用于嗜肺軍團(tuán)菌的檢測已有少量報(bào)道；其靶標(biāo)多為16S rRNA基因及巨噬細(xì)胞感染力增強(qiáng)因子（Macrophage Infectivity Potentiator, mip）基因等，未見以嗜肺軍團(tuán)菌分泌系統(tǒng)的基因?yàn)榘袠?biāo)的檢測方法。嗜肺軍團(tuán)菌具有I型、II型、IVA型和IVB型4種分泌系統(tǒng)，V型分泌系統(tǒng)也于近期在巴黎株中被發(fā)現(xiàn)。其中，IVB型分泌系統(tǒng)（Type IVB secretion system, T4BSS）是其最主要的毒力系統(tǒng)，也被稱為Dot（Defective Organelle Trafficking）/Icm（Intracellular Multiplication）系統(tǒng)。目前的研究表明，T4BSS的結(jié)構(gòu)基因dotA對嗜肺軍團(tuán)菌至關(guān)重要，缺失dotA的嗜肺軍團(tuán)菌將完全喪失毒力和感染能力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種嗜肺軍團(tuán)菌dotA基因的LAMP引物組。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供含有所述嗜肺軍團(tuán)菌dotA基因的LAMP引物組的試劑盒。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種嗜肺軍團(tuán)菌dotA基因的LAMP引物組，所述引物組包含外引物F3、外引物B3、內(nèi)引物FIP、內(nèi)引物BIP、環(huán)引物L(fēng)F、環(huán)引物L(fēng)B，其序列如SEQ ID NO：1～6所示。

本發(fā)明還提供所述嗜肺軍團(tuán)菌dotA基因的LAMP引物組在制備檢測嗜肺軍團(tuán)菌的試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供含有所述嗜肺軍團(tuán)菌dotA基因的LAMP引物組的試劑盒。

優(yōu)選地，所述試劑盒中外引物B3的濃度為0.2μM、外引物F3的濃度為0.2μM、內(nèi)引物FIP的濃度為1.6μM、內(nèi)引物BIP的濃度為1.6μM、環(huán)引物L(fēng)F的濃度為0.4μM、環(huán)引物L(fēng)B的濃度為0.4μM。

優(yōu)選地，所述試劑盒還含有DNA聚合酶、dNTP mix和反應(yīng)緩沖液。

優(yōu)選地，利用所述試劑盒進(jìn)行LAMP反應(yīng)的體系為：引物FIP、BIP各2μL，引物F3、B3各0.25μL ，引物L(fēng)F、LB各0.5μL ，10×Isothermal Amplification Buffer 2.5μL，模板DNA 1μL，濃度為8000U/mL Bst DNA聚合酶1μL，濃度為100mmol/L的MgSO4 1.5μL，濃度為10mmol/L的dNTP mix 3.5μL，加入ddH2O補(bǔ)足25μL。

優(yōu)選地，利用所述試劑盒進(jìn)行LAMP反應(yīng)的程序?yàn)椋?2℃，50min擴(kuò)增，85℃，10min失活。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明通過對嗜肺軍團(tuán)菌IVB型分泌系統(tǒng)序列的比對，設(shè)計(jì)、篩選出特異性LAMP引物組，利用該引物組，只需要通過簡單的LAMP擴(kuò)增，可以通過觀察是否出現(xiàn)白色沉淀來判斷靶基因的存在與否；亦可加入熒光染料后在紫外光下觀察是否出現(xiàn)熒光加以判斷，不需要復(fù)雜的專用檢測設(shè)備。該方法相對于常規(guī)的PCR，操作簡便，特異性強(qiáng)，靈敏度高，可于30min內(nèi)檢出嗜肺軍團(tuán)菌，本方法具備現(xiàn)場檢測及基層推廣的應(yīng)用潛力。

附圖說明

圖1為嗜肺軍團(tuán)菌A1、A2、A3引物組LAMP實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果圖。

圖2為嗜肺軍團(tuán)菌A1引物組LAMP產(chǎn)物及其BamHI酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；NTC：陰性對照；D0：陰性對照的酶切產(chǎn)物；1、2：陽性結(jié)果；D1、D2：1、2陽性結(jié)果的酶切產(chǎn)物；M：DS 2000 marker。

圖3為嗜肺軍團(tuán)菌A2引物組LAMP產(chǎn)物及其BamHI酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；NTC：陰性對照；D0：陰性對照的酶切產(chǎn)物；1、2：陽性結(jié)果；D1、D2：1、2陽性結(jié)果的酶切產(chǎn)物；M：DS 2000 marker。

圖4為嗜肺軍團(tuán)菌A3引物組LAMP產(chǎn)物及其BamHI酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；NTC：陰性對照；D0：陰性對照的酶切產(chǎn)物；1、2：陽性結(jié)果；D1、D2：1、2陽性結(jié)果的酶切產(chǎn)物；M：DS 2000 marker。

圖5為嗜肺軍團(tuán)菌dotA-LAMP檢測法沉淀判定；左側(cè)2管為陰性管，右側(cè)3管為陽性管；紅色箭頭所指即為反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀。

圖6為嗜肺軍團(tuán)菌dotA-LAMP檢測法目視熒光判定；左管為陰性管，右管為陽性管。

圖7為嗜肺軍團(tuán)菌dotA-LAMP檢測法特異性試驗(yàn)實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果圖；上方的大圖為總圖，4個(gè)小圖分別為約旦軍團(tuán)菌、馬氏軍團(tuán)菌、沙門氏菌及陰性對照的擴(kuò)增曲線。

圖8為梯度稀釋模板的普通PCR產(chǎn)物電泳圖；1～9：梯度稀釋模板（192ng/μL、19.2 ng/μL、1.92 ng/μL、192 pg/μL、19.2 pg/μL、1.92 pg/μL、192 fg/μL、19.2 fg/μL、1.92 fg/μL）；NTC：陰性對照；M：DS 2000 marker。

圖9為梯度稀釋模板的LAMP實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果圖。

圖10為環(huán)境水樣dotA-LAMP嗜肺軍團(tuán)菌檢測結(jié)果電泳圖；1：嘉禾望崗站空調(diào)系統(tǒng)冷卻水；2：嘉禾望崗站空調(diào)系統(tǒng)冷凍水；3：區(qū)莊站空調(diào)系統(tǒng)冷卻水；4：區(qū)莊站空調(diào)系統(tǒng)冷凍水；NTC：陰性對照；+：陽性對照Lp02；M：DS 2000 marker。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1嗜肺軍團(tuán)菌的檢測

（1）引物設(shè)計(jì)

以嗜肺軍團(tuán)菌IVB型分泌系統(tǒng)dotA基因（NC_002942.5）為靶標(biāo)設(shè)計(jì)多組引物，分別為引物組A1、引物組A2和引物組A3，每一組的引物序列如下：

引物組A1：

外引物A1-F3：ACAAAATCTTCACCCTGC；

外引物A1-B3：CCTGATCTTAGTGATAATCCTC；

內(nèi)引物A1-FIP：ACCGTTGACCTTTGCCAATCTAATCAAAATCCTGGTGCTTC；

內(nèi)引物A1-BIP：CCTGGCAATTGAACCATCATGAACGACAGTCTGTGAGTG；

環(huán)引物A1-LB：TTGACAAATCCATAGACTGTTGAGG。

引物組A2：

外引物A2-F3：GATCAGGTTGCTTGACGC；

外引物A2-B3：CCAATTTGATACGGGAACAG；

內(nèi)引物A2-FIP ：TGTACCTGGTTTCAAAACAAGAGTGGACCTAAAGCAGGTACGC；

內(nèi)引物A2-BIP：AATGAATAGGGATCCTGACACGGTAGTTTTGATCCCACACA；

環(huán)引物A2-LF：GCTGATTCAAATCCAGTCAC；

環(huán)引物A2-LB：TTTCCAAAGGGTTTGGTAAG；

引物組A3：

外引物A3-F3：GATCAGGTTGCTTGACGC；

外引物A3-B3：CCAATTTGATACGGGAACAG；

內(nèi)引物A3-FIP：TGTACCTGGTTTCAAAACAAGAGTGGACCTAAAGCAGGTACGC；

內(nèi)引物A3-BIP：GAATAGGGATCCTGACACGTTTAGTAGTTTTGATCCCACACAG；

環(huán)引物A3-LF：GCTGATTCAAATCCAGTCAC；

環(huán)引物A3-LB：TTCCAAAGGGTTTGGTAAG。

（2）LAMP反應(yīng)

以嗜肺軍團(tuán)菌L. pneumophila Philadelphia-1 Lp02的基因組DNA為陽性模板，篩選出一套特異性好、擴(kuò)增速度快的引物組。反應(yīng)體系共25μL，具體組分如下：

引物FIP、BIP各2μL，引物F3、B3各0.25μL，引物L(fēng)F、LB各0.5μL，10×Isothermal Amplification Buffer 2.5μL，模板DNA（樣品）1μL，濃度為8000U/mL Bst DNA聚合酶1μL，濃度為100mmol/L的MgSO₄ 1.5μL，濃度為10mmol/L的dNTP mix 3.5μL，100×SYBR Green I 0.25μL，加入ddH₂O補(bǔ)足25μL。

反應(yīng)條件為：62℃1h擴(kuò)增，每隔1min收集1次熒光信號；85℃10min失活。

（3）結(jié)果判讀：

實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果如圖1所示，3組引物的擴(kuò)增區(qū)域均含BamHI酶切位點(diǎn)。A1、A2、A3的擴(kuò)增產(chǎn)物及BamHI酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果分別如圖2、3和4所示。A1的陰性對照有條帶，說明可能發(fā)生了非特異擴(kuò)增；A2的陰性對照及其酶切產(chǎn)物均無條帶，陽性模板的產(chǎn)物呈現(xiàn)LAMP特有的梯形條帶，酶切產(chǎn)物也符合理論值（65bp和132bp）；A3的陰性對照及其酶切產(chǎn)物均無條帶，但陽性模板的產(chǎn)物酶切后并無條帶，可能出現(xiàn)了不正確的擴(kuò)增；即引物組A2正確地?cái)U(kuò)增了目標(biāo)基因。

除了根據(jù)條帶判斷之外，也可以采用簡便的目視檢測來判斷反應(yīng)結(jié)果。如圖5所示，反應(yīng)液離心后，陽性管中可見白色沉淀，陰性管則無；在反應(yīng)液中加入熒光染料，如溴乙錠，在相應(yīng)波長的紫外光下觀察，陽性管發(fā)出明顯熒光，陰性管無明顯變化（如圖6所示）。

實(shí)施例2 引物組A2的特異性實(shí)驗(yàn)

挑取沙門氏菌、約旦軍團(tuán)菌、馬氏軍團(tuán)菌及嗜肺軍團(tuán)菌血清型3型、6型的菌落，移至50μL無菌水中，煮沸10min后，冰浴1min，13000×g離心5min，上清液即為擴(kuò)增樣本。然后以Lp02的基因組DNA為陽性對照，ddH₂O為陰性對照，利用實(shí)施例1所述擴(kuò)增體系和方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果如圖7所示?？梢娛确诬妶F(tuán)菌Lp02、LP3、LP6均發(fā)生了擴(kuò)增，約旦軍團(tuán)菌、馬氏軍團(tuán)菌、沙門氏菌及陰性對照未擴(kuò)增，說明利用引物組A2的特異性好。

實(shí)施例3 引物組A2的靈敏度實(shí)驗(yàn)

測得Lp02基因組提取原液的DNA濃度為192ng/μL。10倍倍比稀釋至1.92×10^-6ng/μL，分別作為LAMP及普通PCR的模板。LAMP反應(yīng)體系如實(shí)施例1所示。普通PCR反應(yīng)體系共20μL，具體組分如下：

2×Taq PCR StarMix 2.5μL，引物F3、B3各1μL，模板1μL，加入ddH₂O補(bǔ)足20μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸8s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min；12℃停止。

取10μL普通PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖8所示，產(chǎn)物條帶為199bp。普通PCR在模板濃度為1.92×10^-3ng/μL時(shí)，電泳條帶已十分微弱。LAMP實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果如圖9所示。LAMP在模板濃度為1.92×10^-5ng/μL時(shí)仍可見明顯的擴(kuò)增，可見LAMP檢測法的敏感性高于普通PCR。

實(shí)施例4 地鐵空調(diào)水樣的檢測

在廣州地鐵嘉禾望崗站、區(qū)莊站采集了空調(diào)系統(tǒng)的冷卻水及冷凍水。水樣用0.2μm濾膜抽濾后，用1ml無菌水收集濾膜上的菌體。以環(huán)境水樣濃縮、煮沸后的上清為模板，利用實(shí)施例1所述LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖10所示。4份水樣均檢測出嗜肺軍團(tuán)菌。

實(shí)施例5 嗜肺軍團(tuán)菌LAMP檢測試劑盒的建立

按下列組成（終濃度）配制嗜肺軍團(tuán)菌LAMP檢測試劑盒（利用引物組A2）：

引物組A2，1×Isothermal Amplification Buffer， Bst DNA聚合酶8U， MgSO₄ 8mM，dNTP mix 1.4mM，1×SYBR Green I（可選）。

引物組A2：

外引物A2-F3：GATCAGGTTGCTTGACGC；

外引物A2-B3：CCAATTTGATACGGGAACAG；

內(nèi)引物A2-FIP ：TGTACCTGGTTTCAAAACAAGAGTGGACCTAAAGCAGGTACGC；

內(nèi)引物A2-BIP：AATGAATAGGGATCCTGACACGGTAGTTTTGATCCCACACA；

環(huán)引物A2-LF：GCTGATTCAAATCCAGTCAC；

環(huán)引物A2-LB：TTTCCAAAGGGTTTGGTAAG。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種嗜肺軍團(tuán)菌dotA基因的LAMP引物組及其試劑盒和應(yīng)用

<130>

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> A2-F3

<400> 1

gatcaggttg cttgacgc 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> A2-B3

<400> 2

ccaatttgat acgggaacag 20

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> A2-FIP

<400> 3

tgtacctggt ttcaaaacaa gagtggacct aaagcaggta cgc 43

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> A2-BIP

<400> 4

aatgaatagg gatcctgaca cggtagtttt gatcccacac a 41

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> A2-LF

<400> 5

gctgattcaa atccagtcac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> A2-LB

<400> 6

tttccaaagg gtttggtaag 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> A1-F3

<400> 7

acaaaatctt caccctgc 18

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> A1-B3

<400> 8

cctgatctta gtgataatcc tc 22

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> A1-FIP

<400> 9

accgttgacc tttgccaatc taatcaaaat cctggtgctt c 41

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> A1-BIP

<400> 10

cctggcaatt gaaccatcat gaacgacagt ctgtgagtg 39

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> A1-LB

<400> 11

ttgacaaatc catagactgt tgagg 25

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> A3-F3

<400> 12

gatcaggttg cttgacgc 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> A3-B3

<400> 13

ccaatttgat acgggaacag 20

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> A3-FIP

<400> 14

tgtacctggt ttcaaaacaa gagtggacct aaagcaggta cgc 43

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> A3-BIP

<400> 15

gaatagggat cctgacacgt ttagtagttt tgatcccaca cag 43

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> A3-LF

<400> 16

gctgattcaa atccagtcac 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> A3-LB

<400> 17

ttccaaaggg tttggtaag 19