本發(fā)明屬于食品檢測(cè)和動(dòng)物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種羊源性成份鑒定的引物及其使用條件，適用于鑒定未知樣品是否是或是否含有羊源性成份以及物種羊的鑒定。

背景技術(shù)：

“掛羊頭，賣狗肉”，我國(guó)這句俗話將不法商販兜售假冒偽劣產(chǎn)品的行徑體現(xiàn)的淋漓盡致。實(shí)際上，這是全世界范圍內(nèi)普遍存在的問(wèn)題。隨著我國(guó)居民生活水平的提高，對(duì)肉類的需求量越來(lái)越多，不免需要從國(guó)外進(jìn)口肉類以滿足市場(chǎng)需求。這些因素均為國(guó)內(nèi)外不法經(jīng)營(yíng)者乘虛而入創(chuàng)造了條件。為保障消費(fèi)者合法權(quán)益，確立一種行之有效的羊源性成份鑒定方法迫在眉睫。

PCR (polymerase chain reaction)，即DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是20世紀(jì)80年代發(fā)明的集高度特異性、靈敏性、高效性為一體的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于涉及生物的諸多領(lǐng)域，包括物種鑒定、法學(xué)鑒定、藥品/食品/飼料/食品飼料添加劑/化妝品等諸多樣品中源自生物的成份及其含量的分析。PCR分為傳統(tǒng)PCR和實(shí)時(shí)定量PCR。傳統(tǒng)PCR又分為使用TaqDNA聚合酶和pfu DNA聚合酶的兩種PCR。

在實(shí)際工作中傳統(tǒng)PCR和實(shí)時(shí)定量PCR均在使用，前者通常耗時(shí)長(zhǎng)，后者雖檢測(cè)時(shí)間短，卻存在試劑、耗材及檢測(cè)設(shè)備昂貴的問(wèn)題，因此繼續(xù)優(yōu)化PCR肉源性鑒定方法勢(shì)在必行。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種羊源性成份鑒定的引物及其使用條件，該方法提供識(shí)別羊線粒體基因片段的一組引物，同時(shí)提供使用該引物和Taq DNA 聚合酶特異性擴(kuò)增羊線粒體DNA 片段的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：1) 根據(jù)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中羊線粒體基因的堿基序列，設(shè)計(jì)1組引物；2) 通過(guò)酚-氯仿抽提法純化的樣品總DNA作為PCR檢測(cè)的模板；3) 使用1) 的引物和2) 的模板，通過(guò)Taq DNA聚合酶PCR擴(kuò)增羊線粒體基因特定片段；4) 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)3) 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；5) 根據(jù)4) 的電泳檢測(cè)結(jié)果，判斷樣品是否是或者是否含有羊源性成份。

所述一組引物，其特征在于如下堿基序列：上游引物P1：5′-tctctcctaggcatttgctta-3′，下游引物P2：5′-cccgtcctacatgcatgaat-3′，濃度為2 pmol/μL。

所述樣品總DNA，其特征在于濃度調(diào)至20 ng/μL。

所述Taq DNA聚合酶PCR擴(kuò)增羊線粒體基因特定片段，其特征在于PCR反應(yīng)體系為10μL (10×Buffer：1μL；10 mmol/L dNTPS：0.4μL；上、下游引物P1和P2各0.5μL；模板DNA：0.5μL；5 U/μL Taq：0.1μL；滅菌純水7μL）。

所述Taq DNA聚合酶PCR擴(kuò)增羊線粒體基因特定片段，其特征還在于PCR程序?yàn)椋?4℃變性/25 s，61.8℃退火/25 s，72℃延伸反應(yīng)/25 s，30次循環(huán)。

所述瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其特征在于瓊脂糖凝膠濃度為 1.2%。

所述根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果，判斷樣品是否是或者是否含有羊源性成份，其特征在于若出現(xiàn)199 bp PCR產(chǎn)物，則判斷檢測(cè)樣品是或含有羊源性成份；反之不是或不含有羊源性成份。

采用上述技術(shù)方案，使低成本、方便、快速地鑒定羊源性成份成為可能，該發(fā)明亦可直接用于鑒定羊源性成份的試劑盒生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1示出利用本發(fā)明將羊肉區(qū)別于豬肉、豬肝和牛肉的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)良效果。本發(fā)明使用TaKaRa rTaqPCR試劑盒和杭州LongGene PCR儀 (MG96G)，但并不限制使用其他公司的試劑盒和儀器設(shè)備。

制備完全相同的12組（每組4個(gè)樣品，分別以羊肉、豬肉、豬肝和牛肉總DNA為模板，其他條件相同) 共計(jì)48管PCR反應(yīng)體系：10×Buffer：1μL；10 mmol/L dNTPS：0.4μL；濃度為2 pmol/μL的上、下游引物P1和P2各0.5μL；模板DNA：0.5μL；5 U/μL rTaq：0.1μL；滅菌純水7μL。除了以下特別說(shuō)明的退火溫度外，PCR程序如下：94℃變性/25 s，T℃退火/25 s，72℃延伸反應(yīng)/25 s，30次循環(huán)。12組樣品的退火溫度T設(shè)置如下：51.8℃、52℃、52.8℃、53.8℃、55℃、56.2℃、57.4℃、58.6℃、59.8℃、60.8℃、61.5℃和61.8℃。PCR完成后，使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)。結(jié)果表明，在所檢測(cè)的退火溫度范圍內(nèi)，僅在以羊肉總DNA為模板的PCR樣品中檢測(cè)到一條介于標(biāo)準(zhǔn)DNA 100～250 bp之間的PCR產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果出現(xiàn)199 bp的PCR產(chǎn)物相吻合，而以豬肉、豬肝和牛肉總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的樣品中，沒(méi)有檢測(cè)到任何條帶，表明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物優(yōu)良特異性。圖1示退火溫度為61.8℃時(shí)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本發(fā)明使低成本、方便、快速地鑒定羊源性成份成為可能，可直接用于生產(chǎn)鑒定羊源性成份的試劑盒。