本發(fā)明屬于食品檢測和動(dòng)物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速鑒定牛肉的方法，適用于鑒定未知樣品是否是牛肉或是否含有牛肉成份。

背景技術(shù)：

隨著我國居民生活水平的提高，僅國內(nèi)生產(chǎn)的肉類遠(yuǎn)不能滿足市場需求，需要從國外進(jìn)口一部分肉類。這些因素為國內(nèi)外不法商販乘虛而入創(chuàng)造了條件。為保障消費(fèi)者合法權(quán)益，確立有效的肉源性成份鑒定方法十分必要。

PCR (polymerase chain reaction)，即DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是20世紀(jì)80年代發(fā)明的集高度特異性、靈敏性、高效性為一體的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于涉及生物的諸多領(lǐng)域，包括物種鑒定、法學(xué)鑒定、藥品/食品/飼料等諸多樣品中源自生物的成份及其含量的分析。PCR分為傳統(tǒng)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)。傳統(tǒng)PCR又分為使用Taq DNA聚合酶和pfu等高保真DNA聚合酶的兩種PCR。

在實(shí)際工作中Taq DNA聚合酶的傳統(tǒng)PCR和實(shí)時(shí)定量PCR均在使用，前者通常耗時(shí)長，后者雖檢測時(shí)間短，卻存在試劑、耗材及檢測設(shè)備昂貴的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種快速鑒定牛肉的方法。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題：一種快速鑒定牛肉的方法，包括以下步驟：

步驟1：設(shè)計(jì)特異性識別牛線粒體基因片段的1對引物；

步驟2：將牛肉總DNA的濃度調(diào)至20 ng/μL作為樣品PCR檢測的模板；

步驟3：使用步驟1的引物和步驟2的模板，借助PrimeSTAR MAX DNA聚合酶PCR擴(kuò)增牛線粒體基因特定片段；

步驟4：通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

步驟5：根據(jù)步驟4的電泳檢測結(jié)果，判斷樣品是否是或者是否含有牛肉或牛的其他組織成份。

所述牛線粒體基因片段的1對引物，上游引物堿基序列：5′-tcttatcaatattcttgaccctt-3′，下游引物堿基序列：5′-agggagacctaaaattacagg -3′，濃度均為2 pmol/μL。

所述PrimeSTAR MAX DNA聚合酶PCR擴(kuò)增牛線粒體基因特定片段的PCR反應(yīng)體系為10μL ，其中PrimeSTAR MAX Premix：5μL；上、下游引物各0.5μL；模板DNA：0.5μL；滅菌純水3.5μL。

所述PrimeSTAR MAX DNA聚合酶PCR擴(kuò)增牛線粒體基因特定片段的PCR程序?yàn)椋?8℃變性/10 s，59℃退火/5 s，72℃延伸反應(yīng)/5 s，30次循環(huán)。

所述根據(jù)步驟4的電泳檢測結(jié)果，判斷樣品是否是或含有牛肉或牛的其他組織成份，若出現(xiàn)178 bp PCR產(chǎn)物，表明檢測樣品是或含有牛肉或牛的其他組織成份；反之不是或不含有牛肉或牛的其他組織成份。

本發(fā)明的有益效果：使用自行設(shè)計(jì)的識別牛線粒體基因片段的一組引物，結(jié)合TaKaRa公司的PrimeSTAR MAX DNA聚合酶（一種高保真DNA聚合酶），既解決了實(shí)時(shí)定量PCR成本高的問題，亦解決了傳統(tǒng)Taq PCR耗時(shí)長的不足。本發(fā)明僅通過40分鐘PCR和20分鐘瓊脂糖凝膠電泳共計(jì)1小時(shí)的時(shí)間即可完成樣品是否是牛肉的鑒定，該發(fā)明可直接用于牛肉成份鑒定的試劑盒生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中以牛肉、豬肉、豬肝和羊肉為模板，使用特異性識別牛線粒體基因片段的引物，實(shí)施PCR獲得產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測的圖譜。

具體實(shí)施例

現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說明使用本發(fā)明的引物結(jié)合PrimeSTAR MAX DNA聚合酶鑒定牛肉的良好效果。本發(fā)明使用杭州朗基MG96+型PCR儀，但并不限制使用其他公司的儀器。

制備完全相同的4組，分別以牛肉、豬肉、豬肝和羊肉總DNA為模板，其他條件相同，共計(jì)4管10μL PCR反應(yīng)體系：PrimeSTAR MAX Premix：5μL；濃度均為2 pmol/μL的上、下游引物各0.5μL；模板DNA：0.5μL；滅菌純水3.5μL。PCR程序如下：98℃變性/10 s，59℃退火/5 s，72℃延伸反應(yīng)/5 s，30次循環(huán)。PCR完成后，使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測。

結(jié)果表明，僅在以牛肉總DNA為模板的PCR樣品中檢測到一條位于100-250 bp位置的PCR產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果178 bp相吻合，而以豬肉、豬肝和羊肉總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的樣品中，沒有檢測到特異性條帶，表明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物優(yōu)良特異性。