本發(fā)明涉及微生物的檢測，具體涉及一種葡萄酒中腐敗酵母菌的檢測引物及數(shù)字PCR檢測方法。
背景技術(shù)：
：酒香酵母經(jīng)常被認為是葡萄酒各種不良氣味的誘因，可能導致葡萄酒變壞。由酒香酵母誘發(fā)的不良香氣和風味主要來源于幾種特殊化學物質(zhì)，尤其是對乙基苯酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚。一旦葡萄酒在發(fā)酵過程中產(chǎn)生這兩種物質(zhì)，它們就會與葡萄酒的其他物質(zhì)進行結(jié)合，產(chǎn)生異味、異香。酒香酵母包含多種不同的酵母，其中包括常見的布魯塞爾酒香酵母(B.bruxellensis)。市場上大約有30%的紅酒可以檢測到有布魯塞爾酒香酵母的存在，布魯塞爾酒香酵母存在于葡萄、葡萄酒、釀酒設備和橡木桶中。與釀酒酵母相比，布魯塞爾酒香酵母對二氧化硫和酒精的耐受性更強，普通的處理手段很難將其完全除去。因此，布魯塞爾酒香酵母是葡萄酒中最常發(fā)現(xiàn)的敗壞酵母。布魯塞爾酒香酵母可以利用葡萄酒中的對羥基肉桂酸，在羥基肉桂酸脫羧酶的作用下產(chǎn)生4-乙基苯酚和4-乙基-2-甲氧基苯酚/4-乙基愈創(chuàng)木酚等代謝產(chǎn)物。過高濃度的4-乙基苯酚和4-乙基-2-甲氧基苯酚/4-乙基愈創(chuàng)木酚會導致葡萄酒發(fā)出類似馬汗的味道，俗稱“馬味”葡萄酒，嚴重影響葡萄酒的品質(zhì)，因此，對葡萄酒中布魯塞爾酒香酵母的檢測十分重要。傳統(tǒng)的檢測方法是利用鑒別培養(yǎng)基進行分離檢測。但是布魯塞爾酒香酵母在葡萄酒尤其是瓶裝葡萄酒中有時呈現(xiàn)一種存活但不可培養(yǎng)的狀態(tài)。在此狀態(tài)下，其仍可進行生理代謝，但不能生長繁殖。因此，直接涂布平板其不能生長，導致假陰性的檢測結(jié)果。并且該方法檢測時間過長，現(xiàn)在技術(shù)中也無快速檢測布魯塞爾酒香酵母的標準方法。國際上，法國幾大酒莊，如波爾多大學下屬的葡萄酒及葡萄園研究所，波亞克地區(qū)酒類專家實驗室（拉菲產(chǎn)地）在生產(chǎn)、銷售環(huán)節(jié)中均檢測酒香酵母菌，把其作為企業(yè)內(nèi)部監(jiān)控紅酒品質(zhì)的一項重要指標；而目前國內(nèi)對其還沒有足夠的重視。因此建立葡萄酒中布魯塞爾酒香酵母的快速檢測方法，在葡萄酒釀造、生產(chǎn)、裝瓶前進行監(jiān)控，防止布魯塞爾酒香酵母數(shù)量超標，可以起到減少葡萄酒的變質(zhì)，降低變質(zhì)風險的作用；還可以從源頭上減少能源和社會物質(zhì)的浪費，提高葡萄酒品質(zhì)，加強進出口貿(mào)易發(fā)展。因此，建立葡萄酒中布魯塞爾酒香酵母菌的快速檢驗方法，改善國內(nèi)對布魯塞爾酒香酵母的檢測現(xiàn)狀，具有重要的現(xiàn)實意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了提供一種葡萄酒中腐敗酵母菌的檢測引物及數(shù)字PCR檢測方法。本發(fā)明的技術(shù)方案：檢測方法為：一、提取葡萄酒樣品中的DNA，裂解細胞并純化DNA；二、數(shù)字PCR反應。本發(fā)明的進一步設置：數(shù)字PCR的反應體系包括：2×PCR反應液10.0μL上游引物(10μmol/L)1.0μL下游引物(10μmol/L)1.0μL探針Bret(10μmol/L)0.5μLDNA模板5.0μL超純水2.5μL總體積20μL其中，上游引物：含有特定引物BretF，其序列為：5’-GTTCACACAATCCCCTCGATCAAC-3’；下游引物：含有特定引物BretR，其序列為：5’-GTTCACACAATCCCCTCGATCAAC-3’；探針Bret：含有探針Probe1，其序列為：5’-FAM-ATGGCGAGGATGAAAGTTTGGGATACA-BHQ1-3’。本發(fā)明的再進一步設置：數(shù)字PCR反應參數(shù)為：95℃預變性10min；95℃變性30sec，55℃退火延伸30sec，72℃30sec，50個循環(huán)；升溫速度2℃~4℃保存反應產(chǎn)物。本發(fā)明的再更進一步設置：數(shù)字PCR檢測方法在葡萄酒中布魯塞爾酒香酵母檢測的應用。本發(fā)明的有益效果是：解決了現(xiàn)在酒中無快速檢測標準方法及存在檢測時間長且容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果的技術(shù)問題。數(shù)字PCR的反應體系適合于任何品種葡萄酒中提取得到的基因組樣品，可以實現(xiàn)對布魯塞爾酵母基因片段進行精確檢測。采用數(shù)字PCR可以快速、特異定量地檢測樣品中的葡萄酒中腐敗酵母菌，從樣品DNA提取到數(shù)字PCR檢測完成整個程序所花費時間至多也不超過6h，靈敏度可達3cfu/mL?？梢姡摲桨缚梢钥焖?、靈敏、準確地檢出葡萄酒中的布魯塞爾酒香酵母，該檢測方法適合于各種葡萄酒樣品的檢測，對于改善國內(nèi)對布魯塞爾酒香酵母的檢測現(xiàn)狀具有重大意義。附圖說明圖1模擬樣品的靈敏度實驗。具體實施方式以下對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細的說明。實施例1：樣品中DNA的提取1、取45mL待分析葡萄酒樣品，置于具有無菌螺旋塞的50mL試管中，在4℃離心5min，離心力為9300×g，棄去上清液。然后加入45mL10mmol/LTris-HClpH8.0洗滌殘渣，渦旋振蕩上述溶液，在4℃離心5min，離心力為9300×g，棄去上清液。輕微渦旋，使沉淀懸浮于殘留液體中。2、DNA提取2.1細胞裂解向收集的沉淀懸浮液中加入0.3g玻璃珠，然后加入PVPP，使其最終的質(zhì)量/體積比為1%。加入200μL溶液I和200μL抽提液。渦旋振蕩上述溶液80s，然后置于-20℃冷卻80s；重復上述渦旋冷卻步驟3次。2.2純化DNA1)加入200μLTE溶液，12000×g，離心5min。小心收集400μL的上層水相至新的離心管中。如果水相和有機相分離不充分，重復上述離心步驟。2)向離心管中加入1mL無水乙醇，顛倒混勻4-5次。15700×g，離心5min，棄上清。3)加入400μLTE溶液和30μL濃度為1μg/μL的RNaseA溶液，重懸沉淀。37℃溫育5min。4)加入10μL濃度為4mol/L的醋酸銨溶液和1mL無水乙醇，顛倒混勻。5)12000×g，離心5min，棄上清。倒置于吸水紙上，吸干液體，不同樣品應在吸水紙不同位置吸干。6)沉淀干燥：打開離心管蓋，48℃恒溫干燥1h。7)向干燥后的離心管底部加入25μLTE，渦旋震蕩后于4℃放置1h-18h(幫助DNA溶解)。室溫下測定DNA含量。當DNA濃度為0.34μg/mL-340μg/mL，A260/A280比值在1.7～1.9之間時，適宜PCR擴增。實施例2：數(shù)字PCR反應1、PCR反應體系，見表1。表1數(shù)字PCR反應體系試劑名稱試劑用量（μL）2×PCR反應液10.0上游引物(10μmol/L)1.0下游引物(10μmol/L)1.0探針Bret(10μmol/L)0.5DNA模板5.0超純水2.5總體積202、PCR反應參數(shù)：95℃預變性10min；95℃變性30sec，55℃退火延伸30sec，72℃30sec，50個循環(huán)；升溫速度2℃~4℃保存反應產(chǎn)物。實施例3：方法的靈敏度實驗模擬樣品：葡萄酒樣品用快速檢測樣品中布魯塞爾酒香酵母的試劑盒檢測。試劑盒組成為：試劑A：DNA提取試劑；試劑B：PCR反應液，其中含有特定引物BretF，其序列為：5’-GTTCACACAATCCCCTCGATCAAC-3’。試劑C：PCR反應液，其中含有特定引物BretR，其序列為：5’-GTTCACACAATCCCCTCGATCAAC-3’。試劑D：PCR反應液，其中含有探針，其序列為：Probe15’-FAM-ATGGCGAGGATGAAAGTTTGGGATACA-BHQ1-3’。試劑E：2×PCR反應液（不含dUTP）。先用試劑A提取樣品中的DNA，之后進行PCR反應，反應結(jié)束后進行數(shù)據(jù)分析，即可對樣品中布魯塞爾酒香酵母進行定量。將布魯塞爾酒香酵母標準菌株稀釋后，1mL稀釋液添加到葡萄酒樣品45mL中，作模擬樣品的靈敏度實驗。數(shù)字PCR結(jié)果如圖1，A05～C05：布魯塞爾酒香酵母濃度為1.0×103cfu/mL；D05～F05：布魯塞爾酒香酵母濃度為1.0×102cfu/mL；G05～A06:布魯塞爾酒香酵母濃度為10cfu/mL；B05～D06：布魯塞爾酒香酵母濃度為1.0cfu/mL；E06～G06：布魯塞爾酒香酵母濃度為1.0×10-1cfu/mL；H06～B07：布魯塞爾酒香酵母濃度為1.0×10-2cfu/mL；C07～E07：布魯塞爾酒香酵母濃度為1.0×10-3cfu/mL。表2靈敏度實驗原始數(shù)據(jù)由附圖1、表2可知，模擬樣品的濃度在3.0cfu/mL可以定量檢測。即模擬樣品中布魯塞爾酒香酵母的定量限為3.0cfu/mL。實施例4：方法的特異性實驗引用布魯塞爾酒香酵母特異性的1對基因引物BretF和BretR，特異性探針Probe1對革蘭氏陽性細菌【金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）ATCC29213】、革蘭氏陰性細菌【大腸桿菌（Escherichiacoli）ATCC35218】、5株葡萄酒相關(guān)菌株【魯氏結(jié)合酵母（Zygosaccharomycesrouxii）CICC1378；釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）CICC1964；異酒香酵母（Brettanomycesanomalus）CICC32915；酒香酵母屬（Brettanomycessp.）CICC31575；間型酒香酵母（Brettanomycesintenmedius）CICC32929】進行檢測。結(jié)果如表3。表3方法特異性檢測數(shù)據(jù)由表3數(shù)據(jù)可得，該方法特異性良好。當前第1頁1 2 3