本發(fā)明涉及藥用真菌液體發(fā)酵領(lǐng)域，尤其涉及一種提高茯苓液體發(fā)酵菌絲體中茯苓酸產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
：茯苓屬藥用真菌，不僅具有醫(yī)療保健作用，還可以食用，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材和歷史悠久的食品。茯苓味甘、淡、平，具有利水滲濕、健脾補(bǔ)中、寧心安神等功效。茯苓酸是茯苓特有的一種四環(huán)三萜化合物，也是茯苓的主要活性成分之一，具有多種與藥效有關(guān)的藥理活性。據(jù)研究報(bào)道茯苓酸在干燥茯苓菌核中的含量在0.1462％-0.2996％。茯苓酸具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、鎮(zhèn)靜催眠等方面的作用。目前茯苓酸主要來源于茯苓菌核，而利用松樹兜來栽培茯苓菌核對松林破壞嚴(yán)重。開發(fā)研究新方法來獲取茯苓酸十分必要。CN104357524A公開了一種使茯苓高產(chǎn)三萜酸的純小麥培養(yǎng)基，表明了一套測定純小麥栽培料培養(yǎng)過程中的總?cè)啤⒍嗵呛腿扑岬姆椒ㄅc步驟，通過該方法測定的固體栽培料在培養(yǎng)到25天使三萜酸達(dá)到最大量，其中胞外三萜酸高達(dá)130mg/L，是液體發(fā)酵胞外三萜酸濃度的2倍以上。然而，其發(fā)酵周期較長，不利于加快工業(yè)化生產(chǎn)。因此，如何研發(fā)一種發(fā)酵周期短、茯苓菌絲體和茯苓酸產(chǎn)量高的培養(yǎng)方法已成為目前亟待解決的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種提高茯苓液體發(fā)酵菌絲體中茯苓酸產(chǎn)量的方法，利用該方法可以實(shí)現(xiàn)茯苓菌絲體產(chǎn)量的最大化，同時(shí)提高菌絲體中茯苓酸的含量，可工業(yè)化生產(chǎn)茯苓酸，不僅解決了利用松樹兜來栽培茯苓菌核對野生松林資源的破壞，而且為將來茯苓藥食用價(jià)值的綜合開發(fā)和工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)和提供技術(shù)保障。為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：第一方面，本發(fā)明提供了一種茯苓(Poriacocos)菌株ZJ2，保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(GDMCC)，地址：廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓廣東省微生物研究所，保藏日期為2016年1月15日，保藏編號(hào)為GDMCCNo.60007。該菌為多孔科菌真菌，菌絲為多核菌絲體，無鎖狀聯(lián)合，粗壯分枝少，具有明顯的隔膜。該菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上的生長狀態(tài)為：5-7天菌絲鋪滿直徑為75mm的平板，具有茯苓特有的芳香味。培養(yǎng)基基底黃色，菌絲乳白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，爬壁能力強(qiáng)，常有網(wǎng)狀交聯(lián)，交聯(lián)處有細(xì)小淡黃色水珠，形成菌索。本發(fā)明所述茯苓菌株ZJ2經(jīng)分子生物學(xué)技術(shù)鑒定，包括進(jìn)行ITS-PCR擴(kuò)增和測序，將獲得的序列與Genbank中所登錄的茯苓序列比對，與茯苓(Poriacocos)相似性為99％。第二方面，本發(fā)明還提供了一種茯苓發(fā)酵用液體種子培養(yǎng)基，以每升計(jì)，所述液體種子培養(yǎng)基的組成為：馬鈴薯150-200g，葡萄糖5-10g，纖維素5-10g，馬尾松根浸提物20-30g，甘油1-3g，(NH4)2SO42-3g，MgSO4·7H2O1.5-2g，KH2PO42-4g，復(fù)合維生素B0.1-0.2g，其余為水；并調(diào)節(jié)pH至6.5-7。本發(fā)明所提供的茯苓發(fā)酵用液體種子培養(yǎng)基中，由于在原料中增加了馬尾松浸提物、纖維素和復(fù)合維生素B組分，三者產(chǎn)生協(xié)同增效作用，可以大幅增加茯苓菌絲體產(chǎn)量，同時(shí)提高菌絲體中茯苓酸的含量，并解決了利用松樹兜來栽培茯苓菌核而帶來的對野生松林資源破壞的技術(shù)問題。根據(jù)本發(fā)明，以每升計(jì)，所述馬鈴薯的含量為150-200g，例如150g、155g、160g、165g、170g、175g、180g、185g、190g、195g或200g；所述葡萄糖的含量為5-10g，例如5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g或10g；所述纖維素的含量為5-10g，例如5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g或10g；所述馬尾松根浸提物的含量為20-30g，例如20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g或30g；所述甘油的含量為1-3g，例如1g、1.2g、1.5g、1.8g、2g、2.3g、2.5g、2.8g或3g；所述(NH4)2SO4的含量為2-3g，例如2g、2.3g、2.5g、2.8g或3g；所述MgSO4·7H2O的含量為1.5-2g，例如1.5g、1.6g、1.7g、1.8g、1.9g或2g；所述KH2PO4的含量為2-4g，例如2g、2.3g、2.5g、2.8g、3g、3.3g、3.5g、3.8g或4g；所述復(fù)合維生素B的含量為0.1-0.2g，例如0.11g、0.12g、0.15g、0.18g、0.19g或0.2g。本發(fā)明中，所述茯苓發(fā)酵用液體種子培養(yǎng)基，以每升計(jì)，所述液體種子培養(yǎng)基優(yōu)選的組成為：馬鈴薯180-200g，葡萄糖8-10g，纖維素5-8g，馬尾松根浸提物25-30g，甘油1-2g，(NH4)2SO42-2.5g，MgSO4·7H2O1.5-1.8g，KH2PO42-2.5g，復(fù)合維生素B0.12-0.18g，其余為水；并調(diào)節(jié)pH至6.5-6.8。本發(fā)明中，所述茯苓發(fā)酵用液體種子培養(yǎng)基，以每升計(jì)，所述液體種子培養(yǎng)基進(jìn)一步優(yōu)選的組成為：馬鈴薯200g，葡萄糖10g，纖維素5g，馬尾松根浸提物30g，甘油1g，(NH4)2SO42g，MgSO4·7H2O1.5g，KH2PO42.5g，復(fù)合維生素B0.14g，其余為水；并調(diào)節(jié)pH至6.5。根據(jù)本發(fā)明，所述馬尾松浸提物可以采用如下方法進(jìn)行制備：將馬尾松樹根洗凈放入干燥箱中，在40-45℃下干燥至恒重，粉碎后，過30-40目篩；稱取20-30g馬尾松根粉末放入容器中，加入2-3倍體積的蒸餾水，加熱煮沸后，小火煎熬20-40min，紗布過濾除去沉淀；濾液經(jīng)6000-8000r/min離心5-15min后，取上清液，得到所述馬尾松浸提物。示例性地，所述馬尾松浸提物具體采用如下方法進(jìn)行制備：將馬尾松樹根洗凈放入干燥箱中，在40℃下干燥至恒重，粉碎后，過40目篩；稱取30g馬尾松根粉末放入500mL的燒杯中，加入2-3倍體積的蒸餾水，加熱煮沸后，小火煎熬30min，紗布過濾除去沉淀，濾液經(jīng)6000r/min離心10min后，把上清液定容至相當(dāng)于含原材料30g/L，得到所述馬尾松浸提物。本發(fā)明中的馬尾松浸提物優(yōu)選采用上述方法制得，但并非僅限該方法，只要本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)公知技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對馬尾松樹根的浸提即可。根據(jù)本發(fā)明，所述纖維素，例如可以是食品級(jí)的微晶纖維素，其粒徑為20-80μm，極限聚合度≤350。但并非僅限于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行選擇。根據(jù)本發(fā)明，所述復(fù)合維生素B是指：每0.1g復(fù)合維生素B中含有維生素B13mg，維生素B21.5mg，維生素B60.2mg，煙酰胺10mg和泛酸鈣1mg。根據(jù)本發(fā)明，所述茯苓發(fā)酵用液體種子培養(yǎng)基可以應(yīng)用于第一方面所述茯苓(Poriacocos)菌株ZJ2的液體發(fā)酵培養(yǎng)，也可應(yīng)用于其它公知的茯苓菌株，其對于實(shí)現(xiàn)茯苓菌絲體產(chǎn)量的增加，同時(shí)提高菌絲體中茯苓酸的含量都起到至關(guān)重要的作用。第三方面，本發(fā)明還提供了一種茯苓發(fā)酵用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以每升計(jì)，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖20-30g，纖維素5-10g，馬尾松根浸提物20-30g，甘油1-3g，(NH4)2SO42-3g，MgSO4·7H2O1.5-2g，KH2PO41-2g，KNO31-2g，復(fù)合維生素B0.1-0.2g，其余為水；并調(diào)節(jié)pH至6.5-7。本發(fā)明所提供的茯苓發(fā)酵用液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，由于在原料中增加了馬尾松浸提物、纖維素和復(fù)合維生素B組分，三者產(chǎn)生了協(xié)同增效作用，可以大幅增加茯苓菌絲體產(chǎn)量，同時(shí)提高菌絲體中茯苓酸的含量，并解決了利用松樹兜來栽培茯苓菌核而帶來的對野生松林資源破壞的技術(shù)問題。根據(jù)本發(fā)明，以每升計(jì)，所述葡萄糖的含量為20-30g，例如20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g或30g；所述纖維素的含量為5-10g，例如5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g或10g；所述馬尾松根浸提物的含量為20-30g，例如20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g或30g；所述甘油的含量為1-3g，例如1g、1.2g、1.5g、1.8g、2g、2.3g、2.5g、2.8g或3g；所述(NH4)2SO4的含量為2-3g，例如2g、2.3g、2.5g、2.8g或3g；所述MgSO4·7H2O的含量為1.5-2g，例如1.5g、1.6g、1.7g、1.8g、1.9g或2g；所述KH2PO4的含量為1-2g，例如1g、1.1g、1.2g、1.3g、1.5g、1.6g、1.7g、1.9g或2g；所述KNO3的含量為1-2g，例如1g、1.1g、1.2g、1.3g、1.5g、1.6g、1.7g、1.9g或2g；所述復(fù)合維生素B的含量為0.1-0.2g，例如0.11g、0.12g、0.15g、0.18g、0.19g或0.2g。本發(fā)明中，所述茯苓發(fā)酵用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以每升計(jì)，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選的組成為：葡萄糖25-30g，纖維素8-10g，馬尾松根浸提物25-30g，甘油1-2g，(NH4)2SO42-2.2g，MgSO4·7H2O1.5-1.6g，KH2PO41-1.2g，KNO31-1.5g，復(fù)合維生素B0.11-0.13g，其余為水；并調(diào)節(jié)pH至6.5-6.6。本發(fā)明中，所述茯苓發(fā)酵用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以每升計(jì)，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)一步優(yōu)選的組成為：葡萄糖30g，纖維素10g，馬尾松根浸提物30g，甘油1g，(NH4)2SO42g，MgSO4·7H2O1.5g，KH2PO41g，KNO31g，復(fù)合維生素B0.14g，其余為水；并調(diào)節(jié)pH至6.5。根據(jù)本發(fā)明，所述茯苓發(fā)酵用液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的馬尾松浸提物與本發(fā)明第二方面所述的馬尾松浸提物制備方法相同，在此不做贅述。根據(jù)本發(fā)明，所述茯苓發(fā)酵用液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的纖維素和復(fù)合維生素B的具體組分及選擇與本發(fā)明第二方面所述的纖維素和復(fù)合維生素B組分的選擇相同，在此不做贅述。根據(jù)本發(fā)明，所述茯苓發(fā)酵用液體發(fā)酵培養(yǎng)基可以應(yīng)用于第一方面所述茯苓(Poriacocos)菌株ZJ2的液體發(fā)酵培養(yǎng)，也可應(yīng)用于其它公知的茯苓菌株，其利于實(shí)現(xiàn)茯苓菌絲體產(chǎn)量的增加，同時(shí)提高菌絲體中茯苓酸的含量，并縮短發(fā)酵周期。采用將所述茯苓發(fā)酵用液體發(fā)酵培養(yǎng)基與本發(fā)明第二方面所述的茯苓發(fā)酵用液體種子培養(yǎng)基進(jìn)行組合，將其共同用于茯苓的液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，相比采用單一的培養(yǎng)基，即單獨(dú)采用所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基或所述液體種子培養(yǎng)基，這兩者可產(chǎn)生協(xié)同作用，進(jìn)一步增加了茯苓菌絲體產(chǎn)量，提高了菌絲體中茯苓酸的含量，從根本上解決了利用松樹兜來栽培茯苓菌核對野生松林資源的破壞；同時(shí)還可大大縮短發(fā)酵周期，利于工業(yè)化生產(chǎn)。采用將所述茯苓發(fā)酵用液體發(fā)酵培養(yǎng)基與本發(fā)明第二方面所述的茯苓發(fā)酵用液體種子培養(yǎng)基進(jìn)行組合，并將其用于本發(fā)明第一方面所述茯苓(Poriacocos)菌株ZJ2的液體發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，可實(shí)現(xiàn)茯苓菌絲體產(chǎn)量的最優(yōu)最大化，使其生物量(干重)達(dá)到14.8g/L以上，同時(shí)提高菌絲體中茯苓酸的含量，其產(chǎn)量可達(dá)到0.384％以上。第四方面，本發(fā)明還提供了一種提高茯苓液體發(fā)酵菌絲體中茯苓酸產(chǎn)量的方法，其包括對茯苓進(jìn)行液體發(fā)酵的操作。根據(jù)本發(fā)明，在對茯苓進(jìn)行液體發(fā)酵時(shí)，采用如本發(fā)明第一方面所述的茯苓(Poriacocos)菌株ZJ2進(jìn)行液體發(fā)酵，也可以采用本領(lǐng)域公知的茯苓菌種進(jìn)行，只是利用第一方面所述的茯苓(Poriacocos)菌株ZJ2進(jìn)行液體發(fā)酵，相比本領(lǐng)域公知的茯苓菌種，可進(jìn)一步提高茯苓菌絲體和茯苓酸含量。根據(jù)本發(fā)明，在對茯苓進(jìn)行液體發(fā)酵時(shí)，在液體種子培養(yǎng)基和/或液體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入馬尾松浸提物，其有助于提高茯苓菌絲體和茯苓酸的含量；以每升培養(yǎng)基計(jì)，所述馬尾松浸提物的加入量優(yōu)選為20-30g，例如20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g或30g。在該添加量下的液體種子培養(yǎng)基和/或液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其能夠促進(jìn)茯苓菌絲體的快速生長，從而實(shí)現(xiàn)茯苓菌絲體和茯苓酸的質(zhì)量最優(yōu)，產(chǎn)量大幅增加。根據(jù)本發(fā)明，在對茯苓進(jìn)行液體發(fā)酵時(shí)，在液體種子培養(yǎng)基和/或液體發(fā)酵培養(yǎng)基中還可以加入纖維素和復(fù)合維生素B，該兩種組分的加入可提高培養(yǎng)基中的溶解氧濃度，促進(jìn)茯苓菌絲體的發(fā)酵，并可與上述馬尾松浸提物發(fā)生協(xié)同增效作用，進(jìn)一步提高茯苓菌絲體和茯苓酸的產(chǎn)量；以每升培養(yǎng)基計(jì)，所述纖維素的加入量優(yōu)選為5-10g，5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g或10g；所述復(fù)合維生素B的加入量優(yōu)選為0.1-0.2g，0.11g、0.12g、0.15g、0.18g、0.19g或0.2g。根據(jù)本發(fā)明，在對茯苓進(jìn)行液體發(fā)酵時(shí)，所述液體種子培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的馬尾松浸提物與本發(fā)明第二方面所述的馬尾松浸提物制備方法相同，在此不做贅述。根據(jù)本發(fā)明，在對茯苓進(jìn)行液體發(fā)酵時(shí)，所述液體種子培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的纖維素和復(fù)合維生素B的具體組分及選擇與本發(fā)明第二方面所述的纖維素和復(fù)合維生素B組分的選擇相同，在此不做贅述。根據(jù)本發(fā)明，在對茯苓進(jìn)行液體發(fā)酵時(shí)，可直接采用如本發(fā)明第二方面所述的茯苓發(fā)酵用液體種子培養(yǎng)基和/或如本發(fā)明第三方面所述的茯苓發(fā)酵用液體發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明所述提高茯苓液體發(fā)酵菌絲體中茯苓酸產(chǎn)量的方法，可以包括以下步驟：(1)斜面試管菌種活化培養(yǎng)：將茯苓菌株的菌絲塊接種于斜面試管培養(yǎng)基，在25-27℃下培養(yǎng)7-15d，得到斜面菌種；(2)通過液體搖瓶進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到種子液：在搖瓶中裝入液體種子培養(yǎng)基，在高溫高壓下滅菌，待自然冷卻至室溫，將步驟(1)得到的斜面菌種接種到液體種子培養(yǎng)基中，在22-28℃、轉(zhuǎn)速100-180r/min下振蕩培養(yǎng)4-8天，得到液體搖瓶種子液；(3)接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基：將步驟(2)得到的種子液按7％-15％的接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后于黑暗條件，22-28℃、轉(zhuǎn)速100-180r/min下振蕩培養(yǎng)7-10天，得到茯苓菌絲體；(4)測定茯苓酸含量。本發(fā)明中，對于步驟(3)所述的發(fā)酵培養(yǎng)條件，優(yōu)選采用如下操作：將步驟(2)得到的種子液按15％的接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后于黑暗條件、25℃、轉(zhuǎn)速180r/min下培養(yǎng)7天。利用上述優(yōu)選的培養(yǎng)條件，可進(jìn)一步增加發(fā)酵液中茯苓菌絲生物量(干重)，提高茯苓酸產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明，步驟(4)所述測定茯苓酸含量的方法包括：1)將茯苓菌絲體干燥后研磨成粉末，向其加入甲醇，所述茯苓菌絲體粉末與甲醇的質(zhì)量體積比為1:30，密塞后稱定重量；2)經(jīng)甲醇浸泡1-2h后在40-50℃下超聲處理10-30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，上清液即為待測樣品溶液；3)采用反相高效液相色譜法進(jìn)行茯苓酸的測定。根據(jù)本發(fā)明，步驟3)所述反相高效液相色譜法的色譜條件為：DiamonsilC18(2)色譜柱，其規(guī)格為250mm×4.6mm，粒徑5μm；流動(dòng)相：乙腈-0.1％甲酸(80％:20％)；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；檢測波長：210nm。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以根據(jù)實(shí)際需要選擇其它色譜條件，以能檢測茯苓酸含量為準(zhǔn)。第五方面，本發(fā)明還提供了如第一方面所述茯苓(Poriacocos)菌株ZJ2、第二方面所述茯苓發(fā)酵用液體種子培養(yǎng)基或第三方面所述茯苓發(fā)酵用液體發(fā)酵培養(yǎng)基在生產(chǎn)制備茯苓菌絲體或茯苓酸中的用途。與現(xiàn)有技術(shù)方案相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：(1)經(jīng)本發(fā)明的茯苓(Poriacocos)菌株ZJ2、培養(yǎng)基或方法得到的發(fā)酵液中茯苓菌絲生物量(干重)可達(dá)14.8g/L以上，茯苓酸產(chǎn)量達(dá)到0.384％以上；發(fā)酵周期可縮短至7天；(2)本發(fā)明提供的方法可解決利用松樹兜來栽培茯苓菌核對野生松林資源的破壞，而且為將來茯苓藥食用價(jià)值的綜合開發(fā)和工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)和提供技術(shù)保障；(3)本發(fā)明工藝簡單、有效、發(fā)酵周期短，在工業(yè)化生產(chǎn)中具有應(yīng)用價(jià)值，可成功實(shí)現(xiàn)明顯提高表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。附圖說明圖1是茯苓酸標(biāo)準(zhǔn)品反相高效液相色譜圖；圖2是本發(fā)明的茯苓發(fā)酵菌絲體反相高效液相色譜圖。下面對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。但下述的實(shí)例僅僅是本發(fā)明的簡易例子，并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明中，所述馬尾松浸提物可以采用如下方法進(jìn)行制備：將馬尾松樹根洗凈放入干燥箱中，在40-45℃下干燥至恒重，粉碎后，過30-40目篩；稱取20-30g馬尾松根粉末放入容器中，加入2-3倍體積的蒸餾水，加熱煮沸后，小火煎熬20-40min，紗布過濾除去沉淀；濾液經(jīng)6000-8000r/min離心5-15min后，取上清液，得到所述馬尾松浸提物。本發(fā)明中，采用如下方法來測定茯苓酸含量：1)將茯苓菌絲體干燥后研磨成粉末，向其加入甲醇，所述茯苓菌絲體粉末與甲醇的質(zhì)量體積比為1:30，密塞后稱定重量；2)經(jīng)甲醇浸泡1h后在50℃下超聲處理10min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，上清液即為待測樣品溶液；3)采用反相高效液相色譜法進(jìn)行茯苓酸的測定，色譜條件為：DiamonsilC18(2)色譜柱，其規(guī)格為250mm×4.6mm，粒徑5μm；流動(dòng)相：乙腈-0.1％甲酸(80％:20％)；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；檢測波長：210nm。圖1示出了茯苓酸標(biāo)準(zhǔn)品的反相高效液相色譜圖，保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，電壓強(qiáng)度為縱坐標(biāo)。圖2示出了本發(fā)明的茯苓發(fā)酵菌絲體的反相高效液相色譜圖，保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，電壓強(qiáng)度為縱坐標(biāo)。為更好地說明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的典型但非限制性的實(shí)施例如下：實(shí)施例1茯苓(Poriacocos)菌株ZJ2的分離與鑒定以2011年3月從湖南靖州縣茯苓種植基地獲得茯苓菌核，其菌核經(jīng)過表面消毒后采用組織分離的方法分離純化，獲得一種茯苓原始菌株，接入PDA斜面培養(yǎng)基制備斜面母種，斜面母種再接種至固體栽培培養(yǎng)基，獲得茯苓子實(shí)體，將茯苓子實(shí)體中的擔(dān)孢子經(jīng)過培育獲得了一株茯苓酸含量高的菌株，即本發(fā)明所使用的茯苓(Poriacocos)菌株ZJ2。本發(fā)明所述茯苓(Poriacocos)菌株ZJ2經(jīng)分子生物學(xué)技術(shù)鑒定，包括進(jìn)行ITS-PCR擴(kuò)增和測序，將獲得的ITS序列(如SEQNO.1所示)與Genbank中所登錄的茯苓序列比對，與它最近的茯苓(Poriacocos)相似性為99％。實(shí)施例2一種茯苓發(fā)酵用液體種子培養(yǎng)基，以每升計(jì)，其組成為：馬鈴薯150g，葡萄糖10g，纖維素10g，馬尾松根浸提物20g，甘油3g，(NH4)2SO43g，MgSO4·7H2O1.5g，KH2PO42g，復(fù)合維生素B0.1g，其余為水；并調(diào)節(jié)pH至6.6。馬尾松浸提物采用如下方法進(jìn)行制備：將馬尾松樹根洗凈放入干燥箱中，在45℃下干燥至恒重，粉碎后，過30目篩；稱取20g馬尾松根粉末放入容器中，加入3倍體積的蒸餾水，加熱煮沸后，小火煎熬30min，紗布過濾除去沉淀；濾液經(jīng)8000r/min離心15min后，取上清液，得到所述馬尾松浸提物。所述纖維素采用食品級(jí)的微晶纖維素，其粒徑為20-80μm，極限聚合度≤350；所述復(fù)合維生素B中含有維生素B13mg，維生素B21.5mg，維生素B60.2mg，煙酰胺10mg和泛酸鈣1mg。實(shí)施例3一種茯苓發(fā)酵用液體種子培養(yǎng)基，以每升計(jì)，其組成為：馬鈴薯180g，葡萄糖8g，纖維素7g，馬尾松根浸提物25g，甘油2g，(NH4)2SO42.5g，MgSO4·7H2O1.8g，KH2PO43g，復(fù)合維生素B0.2g，其余為水；并調(diào)節(jié)pH至7。其中馬尾松根浸提物的制備方法同實(shí)施例2，只需將馬尾松根粉末調(diào)整為25g；纖維素和復(fù)合維生素B的選擇同實(shí)施例2。實(shí)施例4一種茯苓發(fā)酵用液體種子培養(yǎng)基，以每升計(jì)，其組成為：馬鈴薯200g，葡萄糖10g，纖維素5g，馬尾松根浸提物30g，甘油1g，(NH4)2SO42g，MgSO4·7H2O1.5g，KH2PO42.5g，復(fù)合維生素B0.14g，其余為水；并調(diào)節(jié)pH至6.5。其中馬尾松根浸提物的制備方法同實(shí)施例2，只需將馬尾松根粉末調(diào)整為30g；纖維素和復(fù)合維生素B的選擇同實(shí)施例2。對比例1與實(shí)施例4相比，除不添加馬尾松根浸提物外，其它與實(shí)施例4相同。對比例2與實(shí)施例4相比，除不添加纖維素外，其它與實(shí)施例4相同。對比例3與實(shí)施例4相比，除不添加復(fù)合維生素B外，其它與實(shí)施例4相同。對比例4與實(shí)施例4相比，除不添加馬尾松根浸提物和纖維素外，其它與實(shí)施例4相同。對比例5與實(shí)施例4相比，除不添加纖維素和復(fù)合維生素B外，其它與實(shí)施例4相同。實(shí)施例5一種茯苓發(fā)酵用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以每升計(jì)，其組成為：葡萄糖25g，纖維素7g，馬尾松根浸提物26g，甘油2g，(NH4)2SO42.5g，MgSO4·7H2O1.5g，KH2PO41.5g，KNO32g，復(fù)合維生素B0.16g，其余為水；并調(diào)節(jié)pH至7。馬尾松浸提物采用如下方法進(jìn)行制備：將馬尾松樹根洗凈放入干燥箱中，在45℃下干燥至恒重，粉碎后，過30目篩；稱取26g馬尾松根粉末放入容器中，加入3倍體積的蒸餾水，加熱煮沸后，小火煎熬30min，紗布過濾除去沉淀；濾液經(jīng)8000r/min離心15min后，取上清液，得到所述馬尾松浸提物。所述纖維素采用食品級(jí)的微晶纖維素，其粒徑為20-80μm，極限聚合度≤350；所述復(fù)合維生素B中含有維生素B13mg，維生素B21.5mg，維生素B60.2mg，煙酰胺10mg和泛酸鈣1mg。實(shí)施例6一種茯苓發(fā)酵用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以每升計(jì)，其組成為：葡萄糖20g，纖維素5g，馬尾松根浸提物20g，甘油3g，(NH4)2SO43g，MgSO4·7H2O2g，KH2PO42g，KNO32g，復(fù)合維生素B0.1g，其余為水；并調(diào)節(jié)pH至6.8。其中馬尾松根浸提物的制備方法同實(shí)施例5，只需將馬尾松根粉末調(diào)整為20g；纖維素和復(fù)合維生素B的選擇同實(shí)施例5。實(shí)施例7一種茯苓發(fā)酵用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以每升計(jì)，其組成為：葡萄糖30g，纖維素10g，馬尾松根浸提物30g，甘油1g，(NH4)2SO42g，MgSO4·7H2O1.5g，KH2PO41g，KNO31g，復(fù)合維生素B0.14g，其余為水；并調(diào)節(jié)pH至6.5。其中馬尾松根浸提物的制備方法同實(shí)施例5，只需將馬尾松根粉末調(diào)整為30g；纖維素和復(fù)合維生素B的選擇同實(shí)施例5。對比例6與實(shí)施例7相比，除不添加馬尾松根浸提物外，其它與實(shí)施例7相同。對比例7與實(shí)施例7相比，除不添加纖維素外，其它與實(shí)施例7相同。對比例8與實(shí)施例7相比，除不添加復(fù)合維生素B外，其它與實(shí)施例7相同。對比例9與實(shí)施例7相比，除不添加馬尾松根浸提物和纖維素外，其它與實(shí)施例7相同。對比例10與實(shí)施例7相比，除不添加纖維素和復(fù)合維生素B外，其它與實(shí)施例7相同。實(shí)施例8一種提高茯苓液體發(fā)酵菌絲體中茯苓酸產(chǎn)量的方法，其包括以下步驟：(1)斜面試管菌種活化培養(yǎng)：將實(shí)施例1的茯苓(Poriacocos)菌株ZJ2的菌絲塊接種于斜面試管培養(yǎng)基，在27℃下培養(yǎng)10d，得到斜面菌種；(2)通過液體搖瓶進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到種子液：在搖瓶中裝入實(shí)施例4的液體種子培養(yǎng)基，在高溫高壓下滅菌，待自然冷卻至室溫，將步驟(1)得到的斜面菌種接種到液體種子培養(yǎng)基中，在26℃、轉(zhuǎn)速100r/min下振蕩培養(yǎng)4天，得到液體搖瓶種子液；(3)接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基：將步驟(2)得到的種子液按15％的接種量接入實(shí)施例7的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后于黑暗條件，22℃、轉(zhuǎn)速120r/min下振蕩培養(yǎng)8天，得到茯苓菌絲體；(4)測定茯苓酸含量。實(shí)施例9一種提高茯苓液體發(fā)酵菌絲體中茯苓酸產(chǎn)量的方法，其包括以下步驟：(1)斜面試管菌種活化培養(yǎng)：將實(shí)施例1的茯苓(Poriacocos)菌株ZJ2的菌絲塊接種于斜面試管培養(yǎng)基，在25℃下培養(yǎng)7d，得到斜面菌種；(2)通過液體搖瓶進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到種子液：在搖瓶中裝入實(shí)施例4的液體種子培養(yǎng)基，在高溫高壓下滅菌，待自然冷卻至室溫，將步驟(1)得到的斜面菌種接種到液體種子培養(yǎng)基中，在25℃、轉(zhuǎn)速180r/min下振蕩培養(yǎng)7天，得到液體搖瓶種子液；(3)接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基：將步驟(2)得到的種子液按15％的接種量接入實(shí)施例7的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后于黑暗條件，25℃、轉(zhuǎn)速180r/min下振蕩培養(yǎng)7天，得到茯苓菌絲體；(4)測定茯苓酸含量。實(shí)施例10與實(shí)施例9相比，將茯苓(Poriacocos)菌株ZJ2替換成保藏編號(hào)為CCTCCNO.M2010361的茯苓菌株，其它與實(shí)施例9相同。實(shí)施例11與實(shí)施例9相比，將茯苓(Poriacocos)菌株ZJ2替換成保藏編號(hào)為CGMCCNO.6660的茯苓菌株，其它與實(shí)施例9相同。實(shí)施例12與實(shí)施例9相比，將液體種子培養(yǎng)基替換成實(shí)施例3的液體種子培養(yǎng)基，其它與實(shí)施例9相同。實(shí)施例13與實(shí)施例9相比，將液體種子培養(yǎng)基替換成實(shí)施例2的液體種子培養(yǎng)基，其它與實(shí)施例9相同。對比例11與實(shí)施例9相比，將液體種子培養(yǎng)基替換成對比例1的液體種子培養(yǎng)基，其它與實(shí)施例9相同。對比例12與實(shí)施例9相比，將液體種子培養(yǎng)基替換成對比例2的液體種子培養(yǎng)基，其它與實(shí)施例9相同。對比例13與實(shí)施例9相比，將液體種子培養(yǎng)基替換成對比例3的液體種子培養(yǎng)基，其它與實(shí)施例9相同。對比例14與實(shí)施例9相比，將液體種子培養(yǎng)基替換成對比例4的液體種子培養(yǎng)基，其它與實(shí)施例9相同。對比例15與實(shí)施例9相比，將液體種子培養(yǎng)基替換成對比例5的液體種子培養(yǎng)基，其它與實(shí)施例9相同。實(shí)施例14與實(shí)施例9相比，將液體發(fā)酵培養(yǎng)基替換成實(shí)施例6的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其它與實(shí)施例9相同。實(shí)施例15與實(shí)施例9相比，將液體發(fā)酵培養(yǎng)基替換成實(shí)施例5的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其它與實(shí)施例9相同。對比例16與實(shí)施例9相比，將液體發(fā)酵培養(yǎng)基替換成對比例6的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其它與實(shí)施例9相同。對比例17與實(shí)施例9相比，將液體發(fā)酵培養(yǎng)基替換成對比例7的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其它與實(shí)施例9相同。對比例18與實(shí)施例9相比，將液體發(fā)酵培養(yǎng)基替換成對比例8的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其它與實(shí)施例9相同。對比例19與實(shí)施例9相比，將液體發(fā)酵培養(yǎng)基替換成對比例9的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其它與實(shí)施例9相同。對比例20與實(shí)施例9相比，將液體發(fā)酵培養(yǎng)基替換成對比例10的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其它與實(shí)施例9相同。對比例21與實(shí)施例9相比，將液體種子培養(yǎng)基替換為CN102199543A中公開的種子培養(yǎng)基，具體為：葡萄糖20g/L、酵母浸膏4g/L、蛋白胨5g/L、K2HPO41g/L、MgSO4.7H2O0.5g/L，初始pH5.5，蒸餾水1L，其它與實(shí)施例9相同。對比例22與實(shí)施例9相比，將液體發(fā)酵培養(yǎng)基替換為CN102199543A中公開的液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，具體為：葡萄糖20g，酵母浸膏3.5g，蛋白胨4.5g，K2HPO41g，MgSO4.7H2O0.5g，初始pH5.5，蒸餾水1L，其它與實(shí)施例9相同。對比例23與實(shí)施例9相比，將液體種子培養(yǎng)基替換為CN103627695A中公開的培養(yǎng)基，具體為：馬尾松浸液1.0％-4.0％，馬鈴薯水煮液15％-20％，葡萄糖0.8-1.2％，其它與實(shí)施例9相同。對比例24與實(shí)施例9相比，將液體發(fā)酵培養(yǎng)基替換為CN103627695A中公開的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，具體為：馬尾松浸液1.0％-4.0％，微晶纖維0.8％-3.5％，葡萄糖1.0％-3.5％，甘油0.01％-0.05％，硫酸銨0.1％-0.4％，硫酸鎂0.1％-0.3％，氫氧化鉀0.02％-0.06％，磷酸0.02％-0.05％，pH5.5，其它與實(shí)施例9相同。將實(shí)施例8-15和對比例11-24得到的茯苓菌絲體(干重)和茯苓酸進(jìn)行含量測定，其結(jié)果如表1所示。表1菌絲體/g/L茯苓酸/％菌絲體/g/L茯苓酸/％實(shí)施例812.90.371實(shí)施例1412.00.375實(shí)施例914.80.384實(shí)施例1513.70.366實(shí)施例1013.90.360對比例1611.00.301實(shí)施例1114.20.355對比例174.70.399實(shí)施例1212.30.370對比例1812.20.390實(shí)施例1310.90.351對比例194.20.272對比例1112.10.322對比例204.00.387對比例127.60.330對比例2111.00.311對比例139.20.347對比例227.60.363對比例147.10.350對比例237.00.334對比例156.80.368對比例2413.10.387通過表1可以看出，與對比例11-15相比，實(shí)施例9中的液體種子培養(yǎng)基通過添加馬尾松浸提物、纖維素和復(fù)合維生素B，三者產(chǎn)生了協(xié)同增效作用，相比采用馬尾松浸提物、纖維素和復(fù)合維生素B中的單一組分或采用任意兩種的組合，其均提高了菌絲體干重和茯苓酸含量；與對比例16-20相比，實(shí)施例9中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基通過添加馬尾松浸提物、纖維素和復(fù)合維生素B，三者產(chǎn)生了協(xié)同增效作用，相比采用馬尾松浸提物、纖維素和復(fù)合維生素B中的單一組分或采用任意兩種的組合，其同樣提高了菌絲體干重和茯苓酸含量。另外，通過表1還可以看出，與對比例11-24分別相比，實(shí)施例9中的液體種子培養(yǎng)基與液體發(fā)酵培養(yǎng)基二者組合后也產(chǎn)生了協(xié)同作用，相比采用單一的液體種子培養(yǎng)基或液體發(fā)酵培養(yǎng)基，其能最大程度地提高了茯苓菌絲生物量，增加了茯苓酸含量，并將發(fā)酵周期縮短至7天。綜上所述，經(jīng)本發(fā)明方法得到的發(fā)酵液中茯苓菌絲生物量(干重)可達(dá)14.8g/L以上，茯苓酸產(chǎn)量達(dá)到0.384％以上；發(fā)酵周期可縮短至7天；可解決利用松樹兜來栽培茯苓菌核對野生松林資源的破壞，而且為將來茯苓藥食用價(jià)值的綜合開發(fā)和工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)和提供技術(shù)保障；同時(shí)，本發(fā)明工藝簡單、有效、發(fā)酵周期短，在工業(yè)化生產(chǎn)中具有應(yīng)用價(jià)值，可成功實(shí)現(xiàn)明顯提高表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。申請人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征才能實(shí)施。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。SEQUENCELISTING<110>懷化學(xué)院<120>一種提高茯苓液體發(fā)酵菌絲體中茯苓酸產(chǎn)量的方法<130>2016<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1613<212>DNA<213>人工合成<400>1ggcttatcgagggaggcagaggacctccgcgaattcaaggagggcaggactccgctagca60gggcggctgcggccccttggccgtcctcgcgtaaggttgggctaacgtgtccggtcggag120tgggttcaaggcacacgttgtaacgacacgcgtgtgatgccctcacgtaacccagtcgag180ccctgtgtggatcgcgcggaagatgctgtccggtgagcgaagccaatcgcgacccgggcc240ggcctgttcggaggcaagcagctatccgttagtgtgaagccgataacgacccagtccggc300gtgttaagccgaacacgactcggtcggacctgtgagtcttgtaaggcccttcggcttgcg360tccgcctctatggccgccgtcgtgggggacgacattctctcttgaactcggaaaaccgga420cgccctcccattcatggaggagagagggccgtctaagacccgcttggcttgacctgttgc480accgtctacagccatcttccgagtgtgtgcaatgggagagaacgaagcccgcgattgggg540aattcgagatgccctcccatttattggggcgtggggaggtttgtgtactcccagaccagc600tccgagtcgtgccgccgtctactaccacagacctttgtctgagaccgctggccgatgccg660tcgagcacgtcacaagtcatcctcgaattcacatccgtccgtctatgacgggcgcggccc720actacggacgtgagagttcgttaacacgggtcgcgagcgtccgttaacacgggcgtgagc780gtccgttacggtaccgtctttctcgatagacaaagccctttggcaccccttcacatacca840cacccgtgcacctattgccgcggtgcaaggcccacgttcggtccttccgcgcgtgtgaag900ccctctgcccgcggcgcccttacaaaccccataatgtcagaacgttgtcccgatataaca960atgaaagagtttaataacaactctcagcgacggatctcttggctctcgcatcgatgaaga1020acgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaatccagtgaatcatcgaacctttg1080aacgcaccttgcgcccctcggtattccgaggagcatgcctgtttgagcgtcgcggaaccc1140tcaactccgtccgcctttgttggggcgggctcggagcttggaattggaggccctttgccg1200cgcctttcccttctacgatccgtagaccgggggtggccgcgcggctcctcccaaacgcat1260tagcccggaccggattgaaaagggaaccatcggaccggcgtcgataggggcgttcgcgcc1320cacgtcaacgccgttgaacgggaaccctagaaatcgttaaggtcggcttctaaaaggcgc1380gtctcgtcgggggcgggtcggatggacaaacagattagagcggatcgaaaaagtacctcg1440atgtgaggagtttgtaggttccaccccgatagccgttatagacggaatgccacagtgggc1500ggggaccgctccgaaaggaagagggaaaataaaagatctcgactccggtttggcgtccct1560cctccctccgccgtctcgaggcgtcagaaacccttgacctcagatcaggcagg1613當(dāng)前第1頁1 2 3