本發(fā)明屬于藻類培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種富硒小球藻的異樣與自養(yǎng)結(jié)合的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
小球藻是一種重要的微藻資源，具有極其豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和優(yōu)良的醫(yī)療保健作用。含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、色素、多不飽和脂肪酸等,營(yíng)養(yǎng)全面,是水產(chǎn)及畜牧養(yǎng)殖理想的飼料原料。其蛋白質(zhì)含量50％～67％，其中含有人體所必須的20種氨基酸、多種維生素和微量元素，以及亞麻酸、亞油酸、類胡蘿卜素等成分。小球藻中富含CGF(小球藻生長(zhǎng)因子)，能迅速恢復(fù)養(yǎng)殖動(dòng)物機(jī)體造成的損傷。小球藻中含有的生物活性物質(zhì)糖蛋白、多糖體以及高達(dá)13％的核酸等物質(zhì)具有顯著的抑瘤抗癌、增強(qiáng)免疫及抗病毒感染的活性。
在水產(chǎn)養(yǎng)殖上，單細(xì)胞的小球藻可直接作為海水魚育苗的水質(zhì)調(diào)節(jié)以及輪蟲、鹵蟲等海水魚育苗活餌料的培育餌料，也可以用于海水魚、海參、對(duì)蝦等的餌料添加劑，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
除了在水產(chǎn)養(yǎng)殖的應(yīng)用，小球藻因其含有動(dòng)物生長(zhǎng)所需的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素、蝦青素、纖維素等四十多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，現(xiàn)在作為飼料或飼料添加劑被廣泛應(yīng)用于牲畜(如豬、雞等)的飼養(yǎng)中，在動(dòng)物飼料中添加小球藻能明顯的提高動(dòng)物的免疫力、成活率和產(chǎn)量，并能促進(jìn)動(dòng)物采食、提高生長(zhǎng)速度和減少疾病。尤其可替代目前飼養(yǎng)動(dòng)物所用的抗生素、抗菌素等藥品，免除使用激素類物質(zhì)作為飼料所造成的藥物殘留。
目前國(guó)內(nèi)對(duì)小球藻的培養(yǎng)的主要是跑道式養(yǎng)殖池或袋式光合培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方式受氣候條件(溫度、光照等)的影響比較大，而且易受敵害(輪蟲、纖毛蟲等)的侵襲，養(yǎng)殖產(chǎn)量低且難以穩(wěn)定等。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提出一種富硒小球藻的培養(yǎng)方法。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種富硒小球藻的培養(yǎng)方法，包括步驟如下：
(1)以小球藻為發(fā)酵藻種進(jìn)行種子活化
活化培養(yǎng)條件為：搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速80～200r/min、接種量5～10％、pH 6.5～7.5、溫度為27～35℃、時(shí)間48～72h；種子活化分為三級(jí)，從低到高依照發(fā)酵所需量進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；
(2)將活化后的藻種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)
發(fā)酵條件為：通光通氣、pH 6.5～7.5、接種量5～10％、培養(yǎng)溫度27～35℃、攪拌轉(zhuǎn)速50～200r/min、培養(yǎng)時(shí)間90～120h。
所述活化培養(yǎng)基的組份：葡萄糖10～20g/L、檸檬酸0.002g/L、檸檬酸鐵銨0.002g/L、Na2‐EDTA 0.0008g/L、K2HPO4 0.1g/L、MgSO4 0.03g/L、CaCL2·2H2O 0.03g/L、Na2CO30.01g/L、NaNO3 1～2g/L、微量元素溶液1mL/L。
微量元素溶液配方為每升含有：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.04947g。
所述培養(yǎng)基配置需將葡萄糖與其他組份分開，115℃滅菌15分鐘，冷卻后混合使用。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組份：葡萄糖10～40g/L、檸檬酸0.002～0.01g/L、檸檬酸鐵銨0.002～0.01g/L、Na2‐EDTA 0.0008～0.0015g/L、K2HPO4 0.1～0.2g/L、MgSO4 0.03～0.04g/L、CaCL2·2H2O 0.03～0.04g/L、Na2CO3 0.01～0.03g/L、NaNO3 1～2g/L、亞硒酸鈉2mg/L、微量元素溶液1mL/L。
微量元素溶液配方為每升含有：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.04947g。
所述步驟(2)中發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，定時(shí)取樣測(cè)定葡萄糖濃度，及時(shí)補(bǔ)加葡萄糖，通過補(bǔ)加葡萄糖的方式使發(fā)酵液中葡萄糖濃度不低于15g/L，并且48小時(shí)后增開光源。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：
1、本發(fā)明對(duì)培養(yǎng)基的配方及發(fā)酵條件進(jìn)行了改進(jìn)，并且通過添加光源及發(fā)酵補(bǔ)糖的方式為提高小球藻的產(chǎn)量提供了基礎(chǔ)條件。
2、本發(fā)明通過在發(fā)酵培養(yǎng)基添加2mg/L的亞硒酸鈉來達(dá)到小球藻內(nèi)富硒的效果,小球藻硒濃度為66ug/g左右。
3、使用本發(fā)明方法后，富硒小球藻的藻體數(shù)顯著提高，干重達(dá)到4.59g/L以上，比優(yōu)化前的0.4729g/L至少提高了9.7倍，顯著的提高了產(chǎn)量。為提高富硒小球藻的工業(yè)化發(fā)酵和相關(guān)營(yíng)養(yǎng)品的開發(fā)提供了必要條件。
具體實(shí)施方式
以下對(duì)本發(fā)明實(shí)施做進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。小球藻Chlorella sorokiniana NK‐01來源于南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。
一種富硒小球藻的培養(yǎng)方法，包括步驟如下：
(1)以小球藻Chlorella sorokiniana NK‐01為發(fā)酵藻種進(jìn)行種子活化
其中，活化培養(yǎng)基的組份：葡萄糖10～20g/L、檸檬酸0.002g/L、檸檬酸鐵銨0.002g/L、Na2‐EDTA 0.0008g/L、K2HPO4 0.1g/L、MgSO4 0.03g/L、CaCL2·2H2O 0.03g/L、Na2CO3 0.01g/L、NaNO3 1～2g/L、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液配方(1L)：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.04947g；
活化培養(yǎng)條件為：搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速80～200r/min、接種量5～10％、pH 6.5～7.5、溫度為27～35℃、時(shí)間48～72h；
種子活化分為三級(jí)：一級(jí)種子活化、二級(jí)種子活化、三級(jí)種子活化，從低到高依照接種量進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
培養(yǎng)基配置需將葡萄糖與其他組份分開，115℃滅菌15分鐘，冷卻后混合使用。
(2)將三級(jí)活化后的藻種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)
其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組份包括：葡萄糖10～40g/L、檸檬酸0.002～0.01g/L、檸檬酸鐵銨0.002～0.01g/L、Na2‐EDTA 0.0008～0.0015g/L、K2HPO4 0.1～0.2g/L、MgSO4 0.03～0.04g/L、CaCL2·2H2O 0.03～0.04g/L、Na2CO3 0.01～0.03g/L、NaNO3 1～2g/L、亞硒酸鈉2mg/L、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液配方(1L)：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.049g；
發(fā)酵條件為：通光通氣、pH 6.5～7.5、接種量5～10％、培養(yǎng)溫度27～35℃、攪拌轉(zhuǎn)速100～200r/min、培養(yǎng)時(shí)間90～120h。
發(fā)酵過程中定時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛?，及時(shí)補(bǔ)加葡萄糖，且48后增開光源。
培養(yǎng)基配置需將葡萄糖與其他組份分開，115℃滅菌15分鐘，冷卻后混合使用。
實(shí)例1 50L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)
(1)種子活化：
種子活化采用的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件：葡萄糖10g/L、檸檬酸0.002g/L、檸檬酸鐵銨0.002g/L、Na2‐EDTA 0.0008g/L、K2HPO4 0.1g/L、MgSO4 0.03g/L、CaCL2·2H2O 0.03g/L、Na2CO3 0.01g/L、NaNO3 1g/L、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液配方(1L)：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.049g；
活化條件：pH 6.5、溫度27℃、時(shí)間48h、接種量5％。
活化為三級(jí)種子活化，逐級(jí)放大：從低到高每級(jí)裝液量分別為：50mL(100mL三角瓶)，75mL(250mL三角瓶)，1500mL(5000mL三角瓶)；搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100r/min；總活化時(shí)間為6d。
培養(yǎng)基滅菌需將葡萄糖與其他組份分別進(jìn)行，葡萄糖經(jīng)單獨(dú)滅菌冷卻后加入到已滅菌的其他組份中。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)：
發(fā)酵過程采用的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件：葡萄糖10g/L、檸檬酸0.002g/L、檸檬酸鐵銨0.002g/L、Na2‐EDTA 0.0008g/L、K2HPO4 0.1g/L、MgSO4 0.03g/L、CaCL2·2H2O 0.03g/L、Na2CO3 0.01g/L、NaNO3 1g/L、亞硒酸鈉2mg/L、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液配方(1L)：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.049g；
發(fā)酵條件：pH 6.5、培養(yǎng)溫度27℃、接種量5％、攪拌轉(zhuǎn)速150r/min、通氣量2m3/h，培養(yǎng)時(shí)間90h。
50L發(fā)酵罐，經(jīng)空消及實(shí)消后，將活化好的小球藻接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵液總體積為30L。
發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的實(shí)消需將葡萄糖與其他組份分開滅菌，冷卻后混合于發(fā)酵罐中。
發(fā)酵過程分為前48h無光源和后42h增開光源。
發(fā)酵過程中每隔12h取樣測(cè)定發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛?，通過補(bǔ)加葡萄糖使發(fā)酵液中葡萄糖濃度不低于15g/L。
培養(yǎng)結(jié)束時(shí)富硒小球藻干重為4.59g/L，小球藻內(nèi)硒濃度為68mg/Kg。
實(shí)例2 500L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)
(1)種子活化：
種子活化采用的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件：葡萄糖15g/L、檸檬酸0.002g/L、檸檬酸鐵銨0.002g/L、Na2‐EDTA 0.0008g/L、K2HPO4 0.1g/L、MgSO4 0.03g/L、CaCL2·2H2O 0.03g/L、Na2CO3 0.01g/L、NaNO3 1.5g/L、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液配方(1L)：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.049g；
培養(yǎng)條件：pH值7.0、溫度30℃、時(shí)間48h、接種量8％。
活化過程分為三級(jí)，逐級(jí)擴(kuò)大，從低到高每級(jí)裝液量為：160mL(250mL三角瓶)，2000mL(5000mL三角瓶)，24L(50L發(fā)酵罐)；一級(jí)和二級(jí)種子活化為搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100r/min；三級(jí)為50L發(fā)酵罐培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150r/min，通氣量1.5m3/h,總活化時(shí)間為6d。
培養(yǎng)基滅菌需將葡萄糖與其他組份分別進(jìn)行，葡萄糖經(jīng)單獨(dú)滅菌冷卻后加入到已滅菌的其他組份中。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)：
將活化好的小球藻轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵罐體積為500L，裝液量為300L。
發(fā)酵培養(yǎng)基成份及培養(yǎng)條件：葡萄糖25g/L、檸檬酸0.006g/L、檸檬酸鐵銨0.006g/L、Na2‐EDTA 0.001g/L、K2HPO4 0.15g/L、MgSO4 0.035g/L、CaCL2·2H2O 0.036g/L、Na2CO30.02g/L、NaNO3 1.5g/L、亞硒酸鈉2mg/L、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液配方(1L)：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.049g；
發(fā)酵條件：pH 7.0、溫度30℃、接種量8％、攪拌轉(zhuǎn)速150r/min、通氣量5m3/h，培養(yǎng)時(shí)間105h。
500L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌為不含葡萄糖的其它發(fā)酵培養(yǎng)基組份，葡萄糖經(jīng)在50L發(fā)酵罐中單獨(dú)滅菌冷卻后加入到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中。
發(fā)酵過程分為前48h無光源和48h后增開光源。
發(fā)酵過程每隔12h取樣測(cè)定發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛?，通過補(bǔ)加葡萄糖的方式使發(fā)酵液中葡萄糖濃度不低于15g/L。
培養(yǎng)結(jié)束時(shí)富硒小球藻干重為4.82g/L，小球藻內(nèi)硒濃度為66mg/Kg。
實(shí)例3 5000L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)
(1)種子活化：
種子活化采用的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件：葡萄糖20g/L、檸檬酸0.002g/L、檸檬酸鐵銨0.002g/L、Na2‐EDTA 0.0008g/L、K2HPO4 0.1g/L、MgSO4 0.03g/L、CaCL2·2H2O 0.03g/L、Na2CO3 0.01g/L、NaNO3 2g/L、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液配方(1L)：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.049g；
培養(yǎng)條件：pH值7.5、溫度35℃、時(shí)間72h、接種量10％。
活化過程分為三級(jí)，逐級(jí)擴(kuò)大，從低到高每級(jí)裝液量為：3000mL(5000mL三角瓶)，30L(50L發(fā)酵罐)，300L(500L發(fā)酵罐)；一級(jí)種子活化為搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100r/min；二級(jí)為50L發(fā)酵罐培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150r/min，通氣量1.5m3/h，三級(jí)為500L發(fā)酵罐培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150r/min，通氣量3m3/h，總活化時(shí)間為6d。
培養(yǎng)基滅菌需將葡萄糖與其他組份分別進(jìn)行，葡萄糖經(jīng)單獨(dú)滅菌冷卻后加入到已滅菌的其他組份中。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)：
將活化好的小球藻轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵罐體積為5000L，裝液量為3000L。
發(fā)酵培養(yǎng)基成份及培養(yǎng)條件：葡萄糖40g/L、檸檬酸0.01g/L、檸檬酸鐵銨0.01g/L、Na2‐EDTA 0.0015g/L、K2HPO4 0.2g/L、MgSO4 0.04g/L、CaCL2·2H2O 0.04g/L、Na2CO3 0.03g/L、NaNO3 2g/L、亞硒酸鈉2mg/L、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液配方(1L)：H3BO3 2.86g、MnCL2·4H2O 1.81g、ZnSO4·7H2O 0.222g、NaMoO4·2H2O 0.39g、CuSO4·5H2O 0.079g、Co(NO3)2·6H2O 0.049g；
發(fā)酵條件：pH 7.5、溫度35℃、接種量10％、攪拌轉(zhuǎn)速70r/min、通氣量50m3/h，培養(yǎng)時(shí)間120h。
發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌為不含葡萄糖的其它發(fā)酵培養(yǎng)基組份，葡萄糖經(jīng)在500L發(fā)酵罐中單獨(dú)滅菌冷卻后加入到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中。
發(fā)酵過程分為前48h無光源和48h后增開光源。
發(fā)酵過程每隔12h取樣測(cè)定發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛?，通過補(bǔ)加葡萄糖的方式使發(fā)酵液中葡萄糖濃度不低于15g/L。
培養(yǎng)結(jié)束時(shí)富硒小球藻干重為4.74g/L，小球藻內(nèi)硒濃度為71mg/Kg。
上述三個(gè)實(shí)例中小球藻干重測(cè)定方法為：發(fā)酵結(jié)束后取100mL發(fā)酵液置入離心管中，依次離心、清水洗滌三次后，去除上清留沉淀，置于80℃烘箱中烘干稱重，每次進(jìn)行3個(gè)平行。