本發(fā)明屬于生物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及兩種對(duì)N⁶甲基腺嘌呤(m⁶A)敏感的連接酶，以及基于該連接酶建立的連接-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)定量檢測(cè)RNA中m⁶A百分比含量的方法。

背景技術(shù)：

隨著抗體-高通量測(cè)序方法的發(fā)展，科學(xué)家揭示了m⁶A在生物體內(nèi)重要的生物功能，然而m⁶A的作用機(jī)制還不是很清楚。為了更好的研究m⁶A的作用機(jī)制，建立簡(jiǎn)便、快速、靈敏、具有單堿基分辨率的特定位點(diǎn)m⁶A分析檢測(cè)方法具有重要的意義。

由于m⁶A和腺嘌呤(A)具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，精確定位m⁶A的位點(diǎn)具有挑戰(zhàn)性。目前存在的m⁶A的分析方法大部分是高通量測(cè)序法，這些方法大部分只能給出m⁶A在RNA上的大概位置，而不能給出m⁶A的精確位點(diǎn)。特異位點(diǎn)裂解-同位素標(biāo)記-連接輔助的薄層色譜法(SCARLET)的發(fā)現(xiàn)，使得特定位點(diǎn)的m⁶A的定位分析變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，然而此方法不僅過程復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，還用到了同位素，使得它的應(yīng)用受到了限制。2007年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)相比A，m⁶A對(duì)G有一定的識(shí)別能力，如果m⁶A的識(shí)別序列對(duì)應(yīng)的堿基為G時(shí)可以在一定程度上抑制T4 DNA連接酶的連接活性。然而此方法的靈敏度較低，它并沒有被廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于為T3 DNA連接酶和T4 RNA連接酶2提供一種在RNA上m⁶A百分比含量的定量分析中的新應(yīng)用。

解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案由下述步驟組成：

1、根據(jù)含有待測(cè)位點(diǎn)的RNA序列設(shè)計(jì)合成左探針、右探針，其中左探針是DNA探針，其從5′端到3′端依次為檢測(cè)識(shí)別區(qū)、PCR引物區(qū)，且其序列的5′端修飾磷酸基團(tuán)，右探針是DNA探針，其從5′端到3′端依次為PCR引物區(qū)、檢測(cè)識(shí)別區(qū)，所述左探針和右探針的檢測(cè)識(shí)別區(qū)是與含有待測(cè)位點(diǎn)的RNA序列互補(bǔ)的8～40個(gè)堿基序列。

2、將步驟1左探針、右探針的檢測(cè)識(shí)別區(qū)與含有待測(cè)位點(diǎn)的RNA序列雜交，然后加入連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。

3、以步驟2的連接產(chǎn)物為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，并加入SUPER Green I熒光染料，實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光曲線計(jì)算出待測(cè)位點(diǎn)A的含量。

4、在待測(cè)位點(diǎn)附近選擇一個(gè)不含m⁶A的位點(diǎn)作為參比位點(diǎn)，根據(jù)含有參比位點(diǎn)的RNA序列按照步驟1設(shè)計(jì)合成左探針、右探針。

5、將步驟4左探針、右探針的檢測(cè)識(shí)別區(qū)與含有參比位點(diǎn)的RNA雜交，然后通過連接酶將左探針和右探針連接起來。

6、以步驟5的連接產(chǎn)物為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，并加入SUPER Green I熒光染料，實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光曲線計(jì)算出參比位點(diǎn)A的含量。

7、根據(jù)步驟6計(jì)算出的參比位點(diǎn)A的含量減去步驟3計(jì)算出的待測(cè)位點(diǎn)A的含量，得到待測(cè)位點(diǎn)m⁶A的含量，待測(cè)位點(diǎn)m⁶A的含量除以待測(cè)位點(diǎn)A和m⁶A的總和，就得到m⁶A的百分比含量。

上述步驟1和4中，優(yōu)選右探針是3′端修飾兩個(gè)RNA堿基的DNA探針。

上述步驟1和4中，進(jìn)一步優(yōu)選左探針和右探針的檢測(cè)識(shí)別區(qū)是與含有待測(cè)位點(diǎn)的RNA序列互補(bǔ)的10～20個(gè)堿基序列。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)T3 DNA連接酶和T4 RNA連接酶2對(duì)m⁶A敏感，與A相比，m⁶A可以抑制T3 DNA連接酶和T4 RNA連接酶2的連接活性，基于該特性，以RNA(含的A的RNA和含有m⁶A的RNA)為模板，建立了基于連接-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)定量測(cè)定m⁶A百分比含量的方法。該方法首先確定RNA上的待測(cè)位點(diǎn)(待測(cè)位點(diǎn)是腺嘌呤，可能含有部分N⁶甲基腺嘌呤，當(dāng)待測(cè)位點(diǎn)是m⁶A時(shí)，連接酶T3 DNA連接酶或T4 RNA連接酶2的連接活性被抑制，左探針和右探針不會(huì)被連接；當(dāng)待測(cè)位點(diǎn)是A時(shí)，連接酶會(huì)將左探針和右探針連接起來)，用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量該待測(cè)位點(diǎn)A的含量，其次在該RNA的待測(cè)位點(diǎn)附近選擇一個(gè)不含m⁶A的A位點(diǎn)作為參比位點(diǎn)，用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量該參比位點(diǎn)A的含量，然后用參比為點(diǎn)A的含量減去待測(cè)位點(diǎn)A的含量得到待測(cè)位點(diǎn)m⁶A的含量，用待測(cè)位點(diǎn)m⁶A的含量除以待測(cè)位點(diǎn)A和m⁶A的總和，即可得到該待測(cè)位點(diǎn)m⁶A的百分比含量。

本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性好，能夠用于信使RNA(mRNA)，長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNA)，核糖體RNA(rRNA)，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)和小RNA(microRNA)等RNA中的m⁶A的百分比含量測(cè)定，為m⁶A生物功能的研究和其在癌癥中作用的研究提供了新的方法。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1中基于連接-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)定量檢測(cè)MALAT1 2577位點(diǎn)m⁶A百分比含量的原理示意圖。

圖2是實(shí)施例1中不同濃度的RNA2577-A及85ng HeLa poly A⁺RNA的MALAT1 2577位點(diǎn)A的熒光強(qiáng)度隨著循環(huán)次數(shù)變化的實(shí)時(shí)熒光曲線圖。

圖3是實(shí)施例1中C_T值隨著RNA2577-A濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖4是實(shí)施例1中不同濃度RNA2488-A及85ng HeLa poly A⁺RNA的MALAT1 2577位點(diǎn)A的熒光強(qiáng)度隨著循環(huán)次數(shù)變化的實(shí)時(shí)熒光曲線圖。

圖5是實(shí)施例1中C_T值隨著RNA2488-A濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖6是實(shí)施例2中不同濃度RNA2577-A及106ng HCT116poly A⁺RNA的MALAT1 2577位點(diǎn)A熒光強(qiáng)度隨著循環(huán)次數(shù)變化的實(shí)時(shí)熒光曲線圖。

圖7是實(shí)施例2中C_T值隨著RNA2577-A濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖8是實(shí)施例2中不同濃度RNA2488-A及106ng HCT116poly A⁺RNA的MALAT1 2488位點(diǎn)A熒光強(qiáng)度隨著循環(huán)次數(shù)變化的熒光曲線圖。

圖9是實(shí)施例2中C_T值隨著RNA2488-A濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖10是用連接酶區(qū)分A和m⁶A的原理示意圖。

圖11是相同濃度的RNA2577-A和RNA2577-m⁶A熒光強(qiáng)度隨著循環(huán)次數(shù)變化的實(shí)時(shí)熒光曲線圖。

圖12是基于相同濃度的RNA2577-A和RNA2577-m⁶A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物的凝膠電泳圖。

圖13是相同濃度的RNA2577-A和RNA2577-m⁶A熒光強(qiáng)度隨著循環(huán)次數(shù)變化的實(shí)時(shí)熒光曲線圖。

圖14是基于相同濃度的RNA2577-A和RNA2577-m⁶A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物的凝膠電泳圖。

圖15是相同濃度的RNA2577-A和RNA2577-m⁶A熒光強(qiáng)度隨著循環(huán)次數(shù)變化的實(shí)時(shí)熒光曲線圖。

圖16是基于相同濃度的RNA2577-A和RNA2577-m⁶A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物的凝膠電泳圖。

圖17是相同濃度的RNA2577-A和RNA2577-m⁶A熒光強(qiáng)度隨著循環(huán)次數(shù)變化的實(shí)時(shí)熒光曲線圖。

圖18是基于相同濃度的RNA2577-A和RNA2577-m⁶A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物的凝膠電泳圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1

T3 DNA連接酶在檢測(cè)HeLa細(xì)胞中長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNA，MALAT1)2577位點(diǎn)m⁶A含量的應(yīng)用，檢測(cè)原理如圖1所示，具體檢測(cè)方法如下：

1、根據(jù)含有MALAT1的2577位點(diǎn)的RNA序列(RNA2577-A)5'-CUUAAUGUUUUUGCAUUGGACUUUGAGUUAAGAUUAUUUUUUAAAUCCUGAGGACUAGCAUUAAUUGAC-3'(畫下劃線的堿基是2577位點(diǎn)，在HeLa細(xì)胞中MALAT1的2577位點(diǎn)一部分是A，一部分為m⁶A)設(shè)計(jì)合成左探針(Ligase L2)和右探針(Ligase R2)，其中Ligase L2的堿基序列為5'-po₄CCAATGCAAAAA-3'(畫下劃線的部分為檢測(cè)識(shí)別區(qū)、斜體部分為PCR引物區(qū)，由寶生物工程(大連)有限公司提供)，Ligase R2的堿基序列為5'-CTTAACTCAAArGrU-3'(畫下劃線的部分為檢測(cè)識(shí)別區(qū)、斜體部分為PCR引物區(qū)，由寶生物工程(大連)有限公司提供)。

2、在200μL離心管中加入1.0μL水、1.0μL 200 nM Ligase L2水溶液和1.0μL 200nM Ligase R2水溶液、1.0μL 5×的T3 DNA連接酶反應(yīng)緩沖溶液(330mM Tris-HCl、50mM MgCl₂、5 mM二硫蘇糖醇、5mM腺嘌呤核苷三磷酸、37.5％聚乙二醇PEG6000，pH＝7.6，25℃)、1.0μL不同濃度RNA2577-A水溶液或1.0μL 85 ng/μL HeLa的poly A⁺RNA水溶液(同時(shí)作空白對(duì)比實(shí)驗(yàn)，空白是加入1.0μL水來代替RNA2577-A)，混合均勻，作為溶液A。在200μL離心管中加入3.9μL水、1.0μL 5×的T3 DNA連接酶反應(yīng)緩沖溶液(330mM Tris-HCl、50mM MgCl₂、5mM二硫蘇糖醇、5mM腺嘌呤核苷三磷酸，pH＝7.6，25℃)、0.1μL 9unit/μL T3 DNA連接酶，混合均勻，作為溶液B。將溶液A放入PCR儀中，85℃加熱3min，使RNA2577-A、Ligase L2和Ligase R2變性，再降溫至35℃孵育10min，使Ligase L2和Ligase R2與RNA2577-A充分雜交，然后加入溶液B，35℃孵育15min進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后立即放在冰上。

3、取步驟2中2.0μL連接反應(yīng)產(chǎn)物加入到8.0μL聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)混合溶液中，其中PCR反應(yīng)混合溶液由5.2μL滅菌水、0.2μL 2.5unit/μL JumpStart^TM Taq DNA聚合酶、1.0μL 10×JumpStart^TM Taq DNA聚合酶緩沖溶液(100mMTris-HCl，pH＝8.3，500mM KCl，15mM MgCl₂，0.01％(w/v)明膠)、1.0μL 2.5mM脫氧核苷三磷酸(dNTP)水溶液、0.2μL 10μM正向引物(5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3'，由寶生物工程(大連)有限公司提供)水溶液、0.2μL 10μM反向引物(5'-ATCACCGACTGCCCATAGAG-3'，由寶生物工程(大連)有限公司提供)水溶液、0.2μL SUPER Green I(20×)熒光染料組成，混合均勻后立刻放到Step One實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)中(Applied Biosystems，美國(guó))，在94℃下加熱2min，然后進(jìn)行45個(gè)熱循環(huán)，每個(gè)熱循環(huán)94℃20s、60℃30s；同步監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，間隔1個(gè)循環(huán)采集一次實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度信號(hào)，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)RNA2577-A的實(shí)時(shí)熒光曲線，繪制檢測(cè)RNA2577-A的C_T值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))與RNA2577-A濃度對(duì)數(shù)值的線性關(guān)系曲線，結(jié)果如圖3所示，并由此曲線公式計(jì)算出HeLa細(xì)胞中MALAT1的2577位點(diǎn)A的量。

從圖2可以看出，隨著RNA2577-A濃度的增加PCR反應(yīng)速度逐漸加快，也就是說隨著RNA2577-A濃度的增加，基于連接反應(yīng)產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物越多，且不同濃度梯度之間可以相互區(qū)分，同時(shí)，從圖3可以看出，C_T值與RNA2577-A濃度的對(duì)數(shù)值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)方程式為C_T＝-8.65-3.07lgC_RNA2577-A，相關(guān)系數(shù)R²＝0.998。據(jù)此線性相關(guān)方程可以計(jì)算出85ng HeLa poly A⁺RNA中MALAT1的2577位點(diǎn)A的量為0.721amol。

4、在MALAT1的2577位點(diǎn)附近選擇一個(gè)不含m⁶A的2488A位點(diǎn)作為參比位點(diǎn)，根據(jù)含有MALAT1的2488位點(diǎn)的RNA序列(RNA2488-A)5'-UAGAAGAAUUUGGAAGGCCUUAAAUAUAGUAGCUUAGUUUGAAAAAUGUGAAGG-3'(畫下劃線的堿基是2488位點(diǎn)，此堿基只能為A)設(shè)計(jì)合成左探針(Ligase L1)和右探針(Ligase R1)。Ligase L1的堿基序列為5'-po₄ATATTTAAGG-3'(畫下劃線的部分為檢測(cè)識(shí)別區(qū)、斜體部分為PCR引物區(qū)，由寶生物工程(大連)有限公司提供)；Ligase R1的堿基序列為5'-AACTAAGCTArCrU-3'(畫下劃線的部分為檢測(cè)識(shí)別區(qū)、斜體部分為PCR引物區(qū)，由寶生物工程(大連)有限公司提供)。

5、在200μL離心管中加入1.0μL水、1.0μL 200nM Ligase L1水溶液和1.0μL 200nM Ligase R1水溶液、1μL5×的T3 DNA連接酶反應(yīng)緩沖溶液(330mM Tris-HCl、50mM MgCl₂、5mM二硫蘇糖醇、5mM腺嘌呤核苷三磷酸、37.5％聚乙二醇PEG6000，pH＝7.6，25℃)、1.0μL不同濃度RNA2488-A水溶液或1.0μL 85ng/uL HeLa的poly A⁺RNA水溶液(同時(shí)作空白對(duì)比實(shí)驗(yàn)，空白是加入1.0μL水來代替RNA2488-A)，混合均勻，作為溶液A′。在200μL離心管中加入3.9μL水、1μL 5×的T3 DNA連接酶反應(yīng)緩沖溶液(330mM Tris-HCl、50mM MgCl₂、5mM二硫蘇糖醇、5mM腺嘌呤核苷三磷酸，pH＝7.6，25℃)、0.1μL 9unit/μL T3 DNA連接酶，混合均勻，作為溶液B′。將溶液A′放入PCR儀中，85℃加熱3min，使RNA2488-A、Ligase L1和Ligase R1變性，再降溫至35℃孵育10min，使Ligase L1和Ligase R1與RNA2488-A充分雜交，然后加入溶液B′，35℃孵育15min進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后立即放在冰上。

6、取步驟5中2.0μL連接反應(yīng)產(chǎn)物加入到8.0μL PCR反應(yīng)混合溶液中進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中PCR反應(yīng)混合溶液與步驟3中相同，混合均勻后立刻放到Step One實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)中(Applied Biosystems，美國(guó))，在94℃下加熱2min，然后進(jìn)行45個(gè)熱循環(huán)，每個(gè)熱循環(huán)94℃20s、60℃30s；同步監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，間隔1個(gè)循環(huán)采集一次實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度信號(hào)，結(jié)果如圖4所示。根據(jù)RNA2488-A的實(shí)時(shí)熒光曲線，繪制檢測(cè)RNA2488-A的C_T值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))與RNA2488-A濃度對(duì)數(shù)值的線性關(guān)系曲線，結(jié)果如圖5所示，并由此曲線公式計(jì)算出HeLa細(xì)胞中MALAT1的2488位點(diǎn)A的量。

從圖4中可以看出，隨著RNA2488-A濃度的增加PCR反應(yīng)速度逐漸加快，也就是說隨著RNA2488-A濃度的增加，基于連接反應(yīng)產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物越多，且不同濃度梯度之間可以相互區(qū)分，同時(shí)，從圖5中可以看出，C_T值與RNA2488-A的濃度的對(duì)數(shù)值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)方程式為C_T＝-6.95-3.22lgC_RNA2488-A，相關(guān)系數(shù)R²＝0.997。據(jù)此線性相關(guān)方程可以計(jì)算出85ng HeLa poly A⁺RNA中MALAT1的2488位點(diǎn)含A的量為3.79amol。

7、根據(jù)步驟6計(jì)算出的HeLa poly A⁺RNA中MALAT1的2488位點(diǎn)A的含量(3.79amol)減去步驟3計(jì)算出的HeLa poly A⁺RNA中MALAT1的2577位點(diǎn)A的含量(0.721amol)，得到2577位點(diǎn)m⁶A的含量為3.07amol，2577位點(diǎn)m⁶A的含量除以2577位點(diǎn)A和m⁶A的總和，得到HeLa poly A⁺RNA中MALAT1的m⁶A的百分比含量為80.9％。

實(shí)施例2

T3 DNA連接酶在檢測(cè)HCT116細(xì)胞中長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNA，MALAT1)2577位點(diǎn)m⁶A含量的應(yīng)用，具體檢測(cè)方法如下：

利用實(shí)施例1中針對(duì)RNA2577-A設(shè)計(jì)的探針Ligase L2和Ligase R2檢測(cè)HCT116細(xì)胞中長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNA，MALAT1)2577位點(diǎn)A含量，檢測(cè)方法是用106ng/μL HCT116的poly A⁺RNA替代HeLa的poly A⁺RNA，其他實(shí)驗(yàn)步驟與實(shí)施例1相同，并分別測(cè)量其實(shí)時(shí)熒光曲線，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。根據(jù)RNA2577-A的實(shí)時(shí)熒光曲線，繪制檢測(cè)RNA2577-A的C_T值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))與RNA2577-A濃度對(duì)數(shù)值的線性關(guān)系曲線，結(jié)果如圖7所示，并由此曲線公式計(jì)算出HCT116細(xì)胞中MALAT1的2577位點(diǎn)腺嘌呤(A)的量。

從圖6中可以看出，隨著RNA2577-A濃度的增加PCR反應(yīng)速度逐漸加快，也就是說隨著RNA2577-A濃度的增加，基于連接反應(yīng)產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物越多，且不同濃度梯度之間可以相互區(qū)分，同時(shí)，從圖7中可以看出，C_T值與RNA2577-A的濃度的對(duì)數(shù)值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)方程式為C_T＝-9.22-3.07lgC_RNA2577-A，相關(guān)系數(shù)R²＝0.998。據(jù)此線性相關(guān)方程可以計(jì)算出106ng/μL HCT116poly A⁺RNA中MALAT1的2577位點(diǎn)含A的量為0.605amol。

利用實(shí)施例1中針對(duì)RNA2488-A設(shè)計(jì)的探針Ligase L1和Ligase R1檢測(cè)HCT116細(xì)胞中長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNA，MALAT1)2488位點(diǎn)A含量，檢測(cè)方法是用106ng/μL HCT116的poly A⁺RNA替代HeLa的poly A⁺RNA，其他實(shí)驗(yàn)步驟與實(shí)施例1相同，并分別測(cè)量其實(shí)時(shí)熒光曲線，結(jié)果如圖8所示。根據(jù)RNA2488-A的實(shí)時(shí)熒光曲線，繪制檢測(cè)RNA2488-A的C_T值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))與RNA2488-A濃度對(duì)數(shù)值的線性關(guān)系曲線，結(jié)果如圖9所示，并由此曲線公式計(jì)算出HCT116細(xì)胞中MALAT1的2488位點(diǎn)A的量。

從圖8中可以看出，隨著RNA2488-A濃度的增加PCR反應(yīng)速度逐漸加快，也就是說隨著RNA2488-A濃度的增加，基于連接反應(yīng)產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物越多，且不同濃度梯度之間可以相互區(qū)分，同時(shí)，從圖9中可以看出，C_T值與RNA2488-A的濃度的對(duì)數(shù)值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)方程式為C_T＝-7.42-3.13lgC_RNA2488-A，相關(guān)系數(shù)R²＝0.997。據(jù)此線性相關(guān)方程可以計(jì)算出106ng HCT116poly A⁺RNA中MALAT1的2488位點(diǎn)含A的量為1.59amol。

根據(jù)計(jì)算出的2488位點(diǎn)A的含量(1.59 amol)減去計(jì)算出的2577位點(diǎn)A的含量(0.605amol)，得到2577位點(diǎn)m⁶A的含量為0.985amol，2577位點(diǎn)m⁶A的含量除以2577位點(diǎn)A和m⁶A的總和，得到HCT116細(xì)胞中MALAT1的2577位點(diǎn)m⁶A的百分比含量為61.9％。

為了證明T3 DNA連接酶和T4 RNA連接酶2能用于檢測(cè)特定位點(diǎn)m⁶A的含量，發(fā)明人進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)室研究試驗(yàn)，試驗(yàn)原理如圖10所示，具體試驗(yàn)情況如下：

1、3'端修飾兩個(gè)RNA堿基的DNA探針作為右探針時(shí)，用T3 DNA連接酶區(qū)分m⁶A和A

(1)根據(jù)含有MALAT1的2577位點(diǎn)的RNA序列5'-CUUAAUGUUUUUGCAUUGGACUUUGAGUUAAGAUUAUUUUUUAAAUCCUGAGGACUAGCAUUAAUUGAC-3'(RNA2577-A，畫下劃線的堿基是2577位點(diǎn))和5'-CUUAAUGUUUUUGCAUUGGm⁶ACUUUGAGUUAAGAUUAUUUUUUAAAUCCUGAGGACUAGCAUUAAUUGAC-3'(RNA2577-m⁶A，畫下劃線的堿基是2577位點(diǎn))設(shè)計(jì)合成左探針(Ligase L2)和右探針(Ligase R2)。Ligase L2的堿基序列為5'-po₄CCAATGCAAAAA-3'(畫下劃線的部分為檢測(cè)識(shí)別區(qū)、斜體部分為PCR引物區(qū)，由寶生物工程(大連)有限公司提供)；Ligase R2的序列為5'-CCTTAACTCAAArGrU-3'(畫下劃線的部分為檢測(cè)識(shí)別區(qū)、斜體部分為PCR引物區(qū)，由寶生物工程(大連)有限公司提供)。

(2)在200μL離心管中加入1.0μL水、1.0μL 200nM Ligase L2水溶液和1.0μL 200nM Ligase R2水溶液、1.0μL 5×的T3 DNA連接酶反應(yīng)緩沖溶液(330mM Tris-HCl、50mM MgCl₂、5mM二硫蘇糖醇、5mM腺嘌呤核苷三磷酸，37.5％聚乙二醇PEG6000，pH＝7.6，25℃)、1.0μL 200pM RNA2577-A水溶液或1.0μL 200pM RNA2577-m⁶A水溶液(同時(shí)作空白對(duì)比實(shí)驗(yàn)，空白是加入水來代替RNA2577-A水溶液或RNA2577-m⁶A水溶液)，混合均勻，作為溶液A。在200μL離心管中加入3.9μL水、1.0μL 5×的T3 DNA連接酶反應(yīng)緩沖溶液(330mM Tris-HCl、50mM MgCl₂、5mM二硫蘇糖醇、5mM腺嘌呤核苷三磷酸，pH＝7.6，25℃)、0.1μL 9unit/μL T3 DNA連接酶，混合均勻，作為溶液B。將溶液A放入PCR儀中，85℃加熱3min，使RNA2577-A或RNA2577-m⁶A與Ligase L2、Ligase R2變性，再降溫至35℃孵育10min，使Ligase L2和Ligase R2與RNA2577-A或RNA2577-m⁶A充分雜交，再向溶液A中加入溶液B，35℃孵育15min進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后立即放在冰上。

(3)取步驟(2)中2.0μL連接反應(yīng)產(chǎn)物加入到8.0μL聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)混合溶液中進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中PCR反應(yīng)混合溶液由5.2μL滅菌水、0.2μL 2.5unit/μL JumpStart^TMTaq DNA聚合酶、1.0μL 10×JumpStart^TM Taq DNA聚合酶緩沖溶液(100mM Tris-HCl，pH＝8.3，500mM KCl，15mM MgCl₂，0.01％(w/v)明膠)、1.0μL 2.5mM脫氧核苷三磷酸(dNTP)水溶液、0.2μL 10μM正向引物(5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTC-3'，由寶生物工程(大連)有限公司提供)水溶液、0.2μL 10μM反向引物(5'-ATCACCGACTGCCCATAGAG-3'，由寶生物工程(大連)有限公司提供)水溶液、0.2μL SUPER Green I(20×)熒光染料組成，混合均勻后立刻放到Step One實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)中(Applied Biosystems，美國(guó))，94℃下加熱2min，然后進(jìn)行45個(gè)熱循環(huán)，每個(gè)熱循環(huán)94℃20s、60℃30s；同步監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，間隔1個(gè)循環(huán)采集一次實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度信號(hào)，結(jié)果如圖11所示。當(dāng)RNA2577-A的熒光信號(hào)達(dá)到4萬左右時(shí)，停止PCR擴(kuò)增，把PCR的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，結(jié)果如圖12所示。

從圖11中可以看出，RNA2577-A和RNA2577-m⁶A的濃度相同時(shí)，RNA2577-A和RNA2577-m⁶A的C_T相差5.0個(gè)循環(huán)數(shù)，也就說明了基于RNA2577-m⁶A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物要比基于RNA2577-A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物少。從圖12中可以看出，基于RNA2577-m⁶A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物比基于RNA2577-A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物少，假設(shè)基于RNA2577-A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物的量為100％，基于RNA2577-m⁶A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物的量大約為2.56％。這證明T3 DNA連接酶對(duì)m⁶A敏感，m⁶A可以基本完全抑制T3 DNA連接酶連接以RNA為模板的3'端修飾兩個(gè)RNA堿基的DNA探針。

2、DNA探針作為右探針時(shí)，用T3 DNA連接酶區(qū)分m⁶A和A

將上述試驗(yàn)1中的Ligase R2替換為L(zhǎng)igase R2-D(堿基序列為5'-CTTAACTCAAAGT-3')，200pM RNA2577-A水溶液替換為20nM RNA2577-A水溶液；200pM RNA2577-m⁶A水溶液替換為20nM RNA2577-m⁶A水溶液。用T3 DNA連接酶區(qū)分RNA2577-A和RNA2577-m⁶A，實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度信號(hào)結(jié)果如圖13所示，把PCR聚合產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，結(jié)果如圖14所示。

從圖13中可以看出，RNA2577-A和RNA2577-m⁶A的濃度相同時(shí)，RNA2577-A和RNA2577-m⁶A的C_T相差3.6個(gè)循環(huán)數(shù)，也就說明了基于RNA2577-m⁶A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物要比基于RNA2577-A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物少。從圖14中可以看出，基于RNA2577-m⁶A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物比基于RNA2577-A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物少，假設(shè)基于RNA2577-A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物的量為100％，基于RNA2577-m⁶A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物的量大約為24.5％。這證明當(dāng)右探針完全為DNA時(shí)，T3 DNA連接酶對(duì)m⁶A具有一定的敏感，m⁶A可以大部分抑制T3 DNA連接酶連接以RNA為模板的DNA探針。

3、3'端修飾兩個(gè)RNA堿基的DNA探針作為右探針時(shí)，用T4 RNA連接酶2區(qū)分m⁶A和A

將上述試驗(yàn)1中的T3 DNA連接酶替換為T4 RNA連接酶2，5×的T3 DNA連接酶緩沖溶液替換為5×的T4 RNA連接酶2緩沖溶液(250mM Tris-HCl、10mM MgCl₂、5mM二硫蘇糖醇、2mM腺嘌呤核苷三磷酸，pH＝75，25℃)，連接反應(yīng)條件為37℃孵育30min，200pM RNA2577-A水溶液替換為20nM RNA2577-A水溶液；200pM RNA2577-m⁶A水溶液替換為20nM RNA2577-m⁶A水溶液。其他步驟與試驗(yàn)1相同，實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度信號(hào)結(jié)果如圖15所示，把PCR聚合產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，結(jié)果如圖16所示。

從圖15中可以看出，RNA2577-A和RNA2577-m⁶A的濃度相同時(shí)，RNA2577-A和RNA2577-m⁶A的C_T相差2.4個(gè)循環(huán)數(shù)，也就說明了基于RNA2577-m⁶A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物要比基于RNA2577-A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物少。從圖16中可以看出，基于RNA2577-m⁶A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物比基于RNA2577-A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物少，假設(shè)基于RNA2577-A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物的量為100％，基于RNA2577-m⁶A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物的量大約為30.5％。這證明當(dāng)右探針為L(zhǎng)igase R2時(shí)，T4 RNA連接酶2對(duì)m⁶A具有一定的敏感，m⁶A可以大部分抑制T4 RNA連接酶2連接以RNA為模板的3'修飾兩個(gè)RNA堿基的DNA探針。

4、DNA探針作為右探針時(shí)，用T4 RNA連接酶2區(qū)分m⁶A和A

將上述試驗(yàn)3中的Ligase R2替換為L(zhǎng)igase R2-D(堿基序列為5'-CTTAACTCAAAGT-3')，用T4 RNA連接酶2區(qū)分RNA2577-A和RNA2577-m⁶A，實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度信號(hào)結(jié)果如圖17所示，把PCR聚合產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，結(jié)果如圖18所示。

從圖17中可以看出，RNA2577-A和RNA2577-m⁶A的濃度相同時(shí)，RNA2577-A和RNA2577-m⁶A的C_T相差2.3個(gè)循環(huán)數(shù)，也就說明了基于RNA2577-m⁶A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物要比基于RNA2577-A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物少。從圖18中可以看出，基于RNA2577-m⁶A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物比基于RNA2577-A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物少，假設(shè)基于RNA2577-A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物的量為100％，基于RNA2577-m⁶A產(chǎn)生的PCR聚合產(chǎn)物的量大約為32.1％。這證明當(dāng)右探針為L(zhǎng)igase R2-D時(shí)，T4 RNA連接酶2對(duì)m⁶A具有一定的敏感，m⁶A可以大部分抑制T4 RNA連接酶2連接以RNA為模板的DNA探針。

核 苷 酸 或 氨 基 酸 序 列 表

[0001]

序 列 表

<110> 陜西師范大學(xué)

<120> T3 DNA連接酶和T4 RNA連接酶2在檢測(cè)N6甲基腺嘌呤中的應(yīng)用

<160> 12

<210> 1

<211> 69

<212> RNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> RNA 2577-A序列

<400> 1

CUUAAUGUUUUUGCAUUGGACUUUGAGUUAAGAUUAUUUUUUAAAUCCUGAGGACUAGCAUUAAUUGAC 69

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> 根據(jù)待測(cè)RNA 2577-A序列設(shè)計(jì)的探針Ligase L2，以用作連接反應(yīng)構(gòu)建DNA模板

<400> 2

CCAATGCAAAAACTCTATGGGCAGTCGGTGAT 32

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> 根據(jù)待測(cè)RNA 2577-A序列設(shè)計(jì)的探針Ligase R2，以用作連接反應(yīng)構(gòu)建DNA模板

<400> 3

CCATCTCATCCCTGCGTGTCCTTAACTCAAArGrU 33

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> FP，作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增反應(yīng)正向引物

<400> 4

CCATCTCATCCCTGCGTGTC 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> RP，作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增反應(yīng)反向引物

<400> 5

ATCACCGACTGCCCATAGAG 20

<210> 6

<211> 54

<212> RNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223>RNA 2488-A序列

<400> 6

UAGAAGAAUUUGGAAGGCCUUAAAUAUAGUAGCUUAGUUUGAAAAAUGUGAAGG 54

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> 根據(jù)待測(cè)RNA 2488-A序列設(shè)計(jì)的探針Ligase L1，以用作連接反應(yīng)構(gòu)建DNA模板

<400> 7

ATATTTAAGGCTCTATGGGCAGTCGGTGAT 30

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> 根據(jù)待測(cè)RNA 2488-A序列設(shè)計(jì)的探針Ligase R1，以用作連接反應(yīng)構(gòu)建DNA模板

<400> 8

CCATCTCATCCCTGCGTGTCAACTAAGCTArCrU 32

<210> 9

<211> 69

<212> RNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> RNA 2577-m6A序列

<400> 9

CUUAAUGUUUUUGCAUUGGm6ACUUUGAGUUAAGAUUAUUUUUUAAAUCCUGAGGACUAGCAUUAAUUGAC 69

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<223> 根據(jù)待測(cè)RNA 2577-A序列設(shè)計(jì)的探針Ligase R2-D，以用作連接反應(yīng)構(gòu)建DNA模板

<400> 10

CCATCTCATCCCTGCGTGTCCTTAACTCAAAGT 33