本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)化的方法，特別是涉及一種使用磺酰脲類除草劑水解酶基因作為選擇標(biāo)記物的轉(zhuǎn)化方法及植物培育方法。

背景技術(shù)：

乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase，以下稱為“ALS”)存在于植物生長過程中，它能以高度專一性和極高的催化效率催化丙酮酸為乙酰乳酸，從而導(dǎo)致支鏈氨基酸的生物合成。亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸是植物體內(nèi)3種必需的支鏈氨基酸，而ALS不僅是催化亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸生物合成過程中的關(guān)鍵酶，其活性也受產(chǎn)物纈氨酸和異亮氨酸的反饋調(diào)節(jié)。

ALS抑制劑是一類已知的除草劑，其通過抑制植物體內(nèi)的ALS活性而阻止植物體內(nèi)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成受到破壞，從而使植物細胞的有絲分裂停止于G1階段的S期(DNA合成期)和G2階段的M期，干擾了DNA的合成，細胞因此不能完成有絲分裂，導(dǎo)致植物組織失綠、黃化，植株生長受抑，最終達到殺死生物個體的目的。

ALS抑制劑包括磺酰脲類除草劑、咪唑啉酮類除草劑、三唑并嘧啶類除草劑、嘧啶基硫代苯甲酸類除草劑或磺酰氨基-羰基-三唑啉酮類除草劑等。已知的對上述ALS抑制劑具有抗性或耐受性的植物包含的編碼ALS的基因中含有至少一個核苷酸突變，其導(dǎo)致ALS至少一個氨基酸改變，當(dāng)至少一種ALS抑制劑存在時，突變后的ALS展示出更高的活性，從而使該植物顯示出對ALS抑制劑具有抗性或耐受性。

如上所述，已報道了大量對ALS抑制劑具有抗性的ALS及其編碼基因，但由于作用于ALS的除草劑靶標(biāo)單一，連續(xù)使用易產(chǎn)生抗藥性。已鑒定了磺酰脲類除草劑水解酶可以降解噻吩磺隆，如果在植物轉(zhuǎn)化過程中能以磺酰脲類除草劑水解酶基因作為選擇標(biāo)記物，則可以為培育具有耐受除草劑性狀的植物提供新的選擇，但至今沒有在植物轉(zhuǎn)化過程中使用磺酰脲類除草劑水解酶基因作為選擇標(biāo)記物的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種使用磺酰脲類除草劑水解酶基因作為選擇標(biāo)記物的轉(zhuǎn)化方法，有效克服現(xiàn)有技術(shù)ALS抑制劑靶標(biāo)單一，連續(xù)使用易產(chǎn)生抗藥性等技術(shù)缺陷，為培育具有耐受除草劑性狀的植物提供新的選擇。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種選擇轉(zhuǎn)化的植物細胞的方法，包括：

使用含有目標(biāo)基因和編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因的重組載體，轉(zhuǎn)化植物細胞；

在ALS抑制劑的存在下經(jīng)過兩個篩選培養(yǎng)期培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化后的植物細胞，以編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因作為選擇性標(biāo)記；

選擇未被殺死和/或未被抑制的植物細胞。

進一步地，所述轉(zhuǎn)化植物細胞為通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)過程轉(zhuǎn)化植物細胞。

更進一步地，所述植物細胞為大豆細胞。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述ALS抑制劑包括磺酰脲類化合物、咪唑啉酮類化合物、三唑并嘧啶類化合物、嘧啶基硫代苯甲酸類化合物或磺酰氨基-羰基-三唑啉酮類化合物。

具體地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆、甲嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、噻吩磺隆、芐嘧磺隆、甲磺隆、胺苯磺隆或氯嘧磺隆。

可選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時，第一篩選培養(yǎng)期的第一篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為0.5-1mg/L。

可選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時，第二篩選培養(yǎng)期的第二篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為3-15mg/L。

優(yōu)選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時，第一篩選培養(yǎng)期的第一篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為0.5mg/L，第二篩選培養(yǎng)期的第二篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為7mg/L。

優(yōu)選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時，第一篩選培養(yǎng)期的第一篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為0.75mg/L，第二篩選培養(yǎng)期的第二篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為7mg/L。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述磺酰脲類除草劑水解酶包含：(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或(c)與SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種由農(nóng)桿菌介導(dǎo)且以編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因作為選擇性標(biāo)記來制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括：

制備至少包括能被農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化的植物細胞的外植體；

將至少包括所述外植體中所述植物細胞的區(qū)域接觸至少包含編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因的農(nóng)桿菌菌株；

在ALS抑制劑的存在下經(jīng)過兩個篩選培養(yǎng)期培養(yǎng)所述外植體；

選擇未被殺死和/或未被抑制的轉(zhuǎn)化植物細胞；

所述轉(zhuǎn)化植物細胞再生成植物。

進一步地，所述植物細胞為大豆細胞。

更進一步地，所述外植體為有子葉的外植體、半粒種子外植體或半胚胎種子外植體。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述ALS抑制劑包括磺酰脲類化合物、咪唑啉酮類化合物、三唑并嘧啶類化合物、嘧啶基硫代苯甲酸類化合物或磺酰氨基-羰基-三唑啉酮類化合物。

具體地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆、甲嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、噻吩磺隆、芐嘧磺隆、甲磺隆、胺苯磺隆或氯嘧磺隆。

可選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時，第一篩選培養(yǎng)期的第一篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為0.5-1mg/L。

可選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時，第二篩選培養(yǎng)期的第二篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為3-15mg/L。

優(yōu)選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時，第一篩選培養(yǎng)期的第一篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為0.5mg/L，第二篩選培養(yǎng)期的第二篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為7mg/L。

優(yōu)選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時，第一篩選培養(yǎng)期的第一篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為0.75mg/L，第二篩選培養(yǎng)期的第二篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為7mg/L。

所述轉(zhuǎn)化植物細胞再生成植物具體為所述轉(zhuǎn)化植物細胞在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)分化成植物，所述分化培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為0.1-2mg/L。

可選地，所述農(nóng)桿菌菌株還包括賦予除草劑耐受性的基因和/或昆蟲抗性的基因。

可選地，所述賦予除草劑耐受性的基因編碼如下除草劑耐受性蛋白質(zhì)：5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦氧化還原酶、草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、草甘膦脫羧酶、草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶、α酮戊二酸依賴性雙加氧酶、麥草畏單加氧酶、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶、乙酰乳酸合酶、細胞色素類蛋白質(zhì)和/或原卟啉原氧化酶。

可選地，所述昆蟲抗性的基因包括Cry類基因或Vip類基因。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述磺酰脲類除草劑水解酶包含：(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或(c)與SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)化大豆的方法，包括：

大豆種子萌發(fā)后去除一片子葉和第一片真葉，獲得帶有一片子葉的裸露分生組織；

所述帶有一片子葉的裸露分生組織接種到含有細胞分裂素的預(yù)處理培養(yǎng)基上進行預(yù)處理；

包含編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因的農(nóng)桿菌菌株侵染所述預(yù)處理后的分生組織塊；

侵染后的所述分生組織塊經(jīng)過兩個篩選培養(yǎng)期的含有ALS抑制劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因作為選擇性標(biāo)記；

選擇未被殺死和/或未被抑制的植物細胞。

進一步地，所述細胞分裂素為1mg/L 6-芐基腺嘌呤和2mg/L玉米素的任意一種或任意組合。

更進一步地，所述預(yù)處理培養(yǎng)基還包括乙酰丁香酮。

可選地，所述轉(zhuǎn)化大豆的方法還包括所述預(yù)處理后的分生組織塊創(chuàng)傷后進行超聲波處理2-4分鐘。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述ALS抑制劑包括磺酰脲類化合物、咪唑啉酮類化合物、三唑并嘧啶類化合物、嘧啶基硫代苯甲酸類化合物或磺酰氨基-羰基-三唑啉酮類化合物。

具體地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆、甲嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、噻吩磺隆、芐嘧磺隆、甲磺隆、胺苯磺隆或氯嘧磺隆。

可選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時，第一篩選培養(yǎng)期的第一篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為0.5-1mg/L。

可選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時，第二篩選培養(yǎng)期的第二篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為3-15mg/L。

優(yōu)選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時，第一篩選培養(yǎng)期的第一篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為0.5mg/L，第二篩選培養(yǎng)期的第二篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為7mg/L。

優(yōu)選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時，第一篩選培養(yǎng)期的第一篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為0.75mg/L，第二篩選培養(yǎng)期的第二篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為7mg/L。

進一步地，所述農(nóng)桿菌菌株還包括賦予除草劑耐受性的基因和/或昆蟲抗性的基因。

可選地，所述賦予除草劑耐受性的基因編碼如下除草劑耐受性蛋白質(zhì)：5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦氧化還原酶、草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、草甘膦脫羧酶、草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶、α酮戊二酸依賴性雙加氧酶、麥草畏單加氧酶、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶、乙酰乳酸合酶、細胞色素類蛋白質(zhì)和/或原卟啉原氧化酶。

可選地，所述昆蟲抗性的基因包括Cry類基因或Vip類基因。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述磺酰脲類除草劑水解酶包含：(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或(c)與SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的大豆植物的方法，包括：

大豆種子萌發(fā)后去除一片子葉和第一片真葉，獲得帶有一片子葉的裸露分生組織；

所述帶有一片子葉的裸露分生組織接種到含有細胞分裂素的預(yù)處理培養(yǎng)基上進行預(yù)處理；

包含編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因的農(nóng)桿菌菌株侵染所述預(yù)處理后的分生組織塊；

侵染后的所述分生組織塊與所述農(nóng)桿菌菌株共培養(yǎng)；

經(jīng)過兩個篩選培養(yǎng)期在含有ALS抑制劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并以編碼磺酰脲類除草劑水解酶的基因作為選擇性標(biāo)記選擇轉(zhuǎn)化的抗性組織；

轉(zhuǎn)化的抗性組織再生為大豆植物。

進一步地，所述細胞分裂素為1mg/L 6-芐基腺嘌呤和2mg/L玉米素的任意一種或任意組合。

更進一步地，所述預(yù)處理培養(yǎng)基還包括乙酰丁香酮。

可選地，所述轉(zhuǎn)化大豆的方法還包括所述預(yù)處理后的分生組織塊創(chuàng)傷后進行超聲波處理2-4分鐘。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述ALS抑制劑包括磺酰脲類化合物、咪唑啉酮類化合物、三唑并嘧啶類化合物、嘧啶基硫代苯甲酸類化合物或磺酰氨基-羰基-三唑啉酮類化合物。

具體地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆、甲嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、噻吩磺隆、芐嘧磺隆、甲磺隆、胺苯磺隆或氯嘧磺隆。

可選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時，第一篩選培養(yǎng)期的第一篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為0.5-1mg/L。

可選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時，第二篩選培養(yǎng)期的第二篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為3-15mg/L。

優(yōu)選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時，第一篩選培養(yǎng)期的第一篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為0.5mg/L，第二篩選培養(yǎng)期的第二篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為7mg/L。

優(yōu)選地，所述磺酰脲類化合物為苯磺隆時，第一篩選培養(yǎng)期的第一篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為0.75mg/L，第二篩選培養(yǎng)期的第二篩選培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為7mg/L。

所述轉(zhuǎn)化的抗性組織再生為大豆植物具體為所述轉(zhuǎn)化的抗性組織在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)分化成大豆植物，所述分化培養(yǎng)基中苯磺隆的濃度為0.1-2mg/L。

進一步地，所述農(nóng)桿菌菌株還包括賦予除草劑耐受性的基因和/或昆蟲抗性的基因。

可選地，所述賦予除草劑耐受性的基因編碼如下除草劑耐受性蛋白質(zhì)：5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、草甘膦氧化還原酶、草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、草甘膦脫羧酶、草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶、α酮戊二酸依賴性雙加氧酶、麥草畏單加氧酶、4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶、乙酰乳酸合酶、細胞色素類蛋白質(zhì)和/或原卟啉原氧化酶。

可選地，所述昆蟲抗性的基因包括Cry類基因或Vip類基因。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述磺酰脲類除草劑水解酶包含：(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或(c)與SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明中的克隆基因、表達盒、載體(例如質(zhì)粒)、蛋白和蛋白片段、以及轉(zhuǎn)化的細胞核植物均可使用標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)。

本發(fā)明可用于在植物中表達任何目的基因。目的基因可以是耐除草劑基因、抗病基因或抗蟲基因，或者是選擇或評價標(biāo)記，并含有植物可操作的啟動子、編碼區(qū)和終止子區(qū)。耐除草劑基因包括對咪唑啉酮或磺酰脲除草劑耐受的AHAS基因、對草丁膦除草劑耐受的pat或bar基因、對草甘膦除草劑耐受的EPSPS基因，對2,4-D除草劑耐受的AAD基因，對HPPD抑制劑耐受的HPPD基因等?？共』虬股睾铣擅富?，例如硝吡咯菌素合成酶基因，植物來源的抗性基因等。抗蟲基因包括蘇云金芽孢桿菌殺蟲基因。目的基因也可以編碼與生物化學(xué)途徑有關(guān)的酶，該酶的表達可改變食物、飼料、營養(yǎng)藥和/或藥物生產(chǎn)中重要的性狀。目的基因可以位于質(zhì)粒上。適合本發(fā)明使用的質(zhì)粒可以含有一個以上目的基因和/或農(nóng)桿菌可含有帶有不同目的基因的不同質(zhì)粒。

本發(fā)明中所述植物可以為大豆，所述“大豆”是指Glycine max，所述方法是以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的目的基因傳輸?shù)酱蠖辜毎?，之后再生為轉(zhuǎn)化的大豆植物為基礎(chǔ)的。本發(fā)明的方法獨立于栽培品種。

本發(fā)明中所述“選擇性標(biāo)記”是指這樣的基因或多核苷酸，其表達允許鑒別已經(jīng)用含有所述基因或多核苷酸DNA構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化的細胞。選擇性標(biāo)記可以提供對毒性化合物的抗性，例如對抗生素、除草劑等。

本發(fā)明中“乙酰乳酸合酶或乙酰乳酸合成酶(ALS)”是指具有根據(jù)IUBMB酶命名法EC2.2.1.6定義的活性的酶。酶催化兩個丙酮酸分子之間的反應(yīng)，產(chǎn)生2-乙酰乳酸和CO₂。酶需要二磷酸硫胺素，并且還可以稱為乙酰羥酸合酶(AHAS)。

本發(fā)明中“ALS抑制劑”是指抑制野生型ALS蛋白質(zhì)的化合物，對含有野生型ALS的細胞是毒性的。此類化合物包括已知的除草劑，主要包括磺酰脲類、咪唑啉酮類、三唑并嘧啶類、嘧啶基硫代苯甲酸類或磺酰氨基-羰基-三唑啉酮類化合物。

可以在本發(fā)明中使用的磺酰脲類化合物包括：1)苯基磺酰脲類，包括氯嘧磺隆、氟嘧磺隆、3-(4-乙基-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-1-(2,3-二氫-1,1-二氧代-2-甲基苯并[b]噻吩-7-磺酰基)-脲、3-(4-乙氧基-6-乙基-1,3,5-三嗪-2-基)-1-(2,3-二氫-1,1-二氧代-2-甲基苯并[b]噻吩-7-磺?；?-脲、苯磺隆、甲磺隆、氯磺隆、醚苯磺隆和甲嘧磺隆；2)噻吩基磺酰脲類，如噻吩磺隆；3)吡唑基磺酰脲類，包括吡嘧磺隆和甲基3-氯代-5-(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基氨基甲?；被酋?-1-甲基-吡唑-4-羧酸酯；4)砜肼衍生物，包括酰嘧磺隆和結(jié)構(gòu)類似物；5)吡啶基磺酰脲基，包括煙嘧磺隆和DPX-E 9636；6)苯氧基磺酰脲類。

本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。

本發(fā)明中所述的“植物繁殖體”包括但不限于植物有性繁殖體和植物無性繁殖體。所述植物有性繁殖體包括但不限于植物種子；所述植物無性繁殖體是指植物體的營養(yǎng)器官或某種特殊組織，其可以在離體條件下產(chǎn)生新植株；所述營養(yǎng)器官或某種特殊組織包括但不限于根、莖和葉，例如：以根為無性繁殖體的植物包括草莓和甘薯等；以莖為無性繁殖體的植物包括甘蔗和馬鈴薯(塊莖)等；以葉為無性繁殖體的植物包括蘆薈和秋海棠等。

本發(fā)明中所述“抗性”是可遺傳的，并允許植物在除草劑對給定植物進行一般除草劑有效處理的情況下生長和繁殖。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認可的，即使植物受到除草劑處理的一定損傷程度明顯，植物仍可被認為“抗性”。本發(fā)明中術(shù)語“耐性”或“耐受性”比術(shù)語“抗性”更廣泛，并包括“抗性”，以及特定植物具有的抵抗除草劑誘導(dǎo)的各種程度損傷的提高的能力，而在同樣的除草劑劑量下一般導(dǎo)致相同基因型野生型植物損傷。

本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細胞中編碼蛋白質(zhì)或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認識到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。

本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補，反之亦然。由于DNA在植物中復(fù)制產(chǎn)生了DNA的其它互補鏈。這樣，本發(fā)明包括對序列表中示例的多核苷酸及其互補鏈的使用。本領(lǐng)域常使用的“編碼鏈”指與反義鏈結(jié)合的鏈。為了在體內(nèi)表達蛋白質(zhì)，典型將DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄為一條mRNA的互補鏈，它作為模板翻譯出蛋白質(zhì)。mRNA實際上是從DNA的“反義”鏈轉(zhuǎn)錄的?！坝辛x”或“編碼”鏈有一系列密碼子(密碼子是三個核苷酸，一次讀三個可以產(chǎn)生特定氨基酸)，其可作為開放閱讀框(ORF)閱讀來形成目的蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明還包括與示例的DNA有相當(dāng)功能的RNA。

本發(fā)明中多核苷酸或核酸分子或其片段在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明磺酰脲類除草劑水解酶基因雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴增方法都可以用于鑒定本發(fā)明磺酰脲類除草劑水解酶基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進行特異性雜交。本發(fā)明中，如果兩個核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說這兩個核酸分子彼此間能夠進行特異性雜交。如果兩個核酸分子顯示出完全的互補性，則稱其中一個核酸分子是另一個核酸分子的“互補物”。本發(fā)明中，當(dāng)一個核酸分子的每一個核苷酸都與另一個核酸分子的對應(yīng)核苷酸互補時，則稱這兩個核酸分子顯示出“完全互補性”。如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在至少常規(guī)的“低度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子為“最低程度互補”。類似地，如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在常規(guī)的“高度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子具有“互補性”。從完全互補性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴(yán)格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補鏈發(fā)生特異性雜交。促進DNA雜交的適合的嚴(yán)格條件，例如，大約在45℃條件下用6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50℃條件下用2.0×SSC洗滌，這些條件對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴(yán)格條件的約2.0×SSC、50℃到高度嚴(yán)格條件的約0.2×SSC、50℃。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴(yán)格條件的室溫約22℃，升高到高度嚴(yán)格條件的約65℃。溫度條件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個保持不變而另一個變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本發(fā)明所述嚴(yán)格條件可為在6×SSC、0.5％SDS溶液中，在65℃下與本發(fā)明磺酰脲類除草劑水解酶的核苷酸序列發(fā)生特異性雜交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。

因此，具有除草劑耐受性活性并在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明磺酰脲類除草劑水解酶的核苷酸序列雜交的序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40％-50％同源，大約60％、65％或70％同源，甚至至少大約75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同源性。

本發(fā)明提供功能蛋白質(zhì)?！肮δ芑钚浴?或“活性”)在本發(fā)明中指本發(fā)明用途的蛋白質(zhì)/酶(單獨或與其它蛋白質(zhì)組合)具有降解除草劑的能力。產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的植物優(yōu)選產(chǎn)生“有效量”的蛋白質(zhì)，從而在用除草劑處理植物時，蛋白質(zhì)表達的水平足以給予植物對除草劑(若無特別說明則為一般用量)完全或部分的抗性或耐性?？梢砸酝ǔ⑺腊兄参锏挠昧俊⒄５拇筇镉昧亢蜐舛仁褂贸輨?。優(yōu)選地，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物和植物細胞優(yōu)選具有磺酰脲類除草劑的抗性或耐性，即轉(zhuǎn)化的植物和植物細胞能在有效量的磺酰脲類除草劑存在下生長。

本發(fā)明中所述的基因和蛋白質(zhì)不但包括特定的示例序列，還包括保存了所述特定示例的蛋白質(zhì)的除草劑耐受性活性特征的部分和/片段(包括與全長蛋白質(zhì)相比在內(nèi)和/或末端缺失)、變體、突變體、取代物(有替代氨基酸的蛋白質(zhì))、嵌合體和融合蛋白。所述“變體”或“變異”是指編碼同一蛋白或編碼有除草劑抗性活性的等價蛋白的核苷酸序列。所述“等價蛋白”是指與權(quán)利要求的蛋白具有相同或基本相同的除草劑耐受性的生物活性的蛋白。

本發(fā)明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達的序列)，前述序列的長度可存在變化，但長度足以確保(編碼)蛋白質(zhì)為除草劑耐受性蛋白質(zhì)。

由于遺傳密碼子的豐余性，多種不同的DNA序列可以編碼相同的氨基酸序列。產(chǎn)生這些編碼相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)水平內(nèi)。這些不同的DNA序列包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但實質(zhì)上不影響除草劑耐受性活性的序列，亦包括保留除草劑耐受性活性的片段。

本發(fā)明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選這種氨基酸變化為：小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常約1-30個氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個殘基長。

保守取代的實例是在下列氨基酸組內(nèi)發(fā)生的取代：堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定活性的那些氨基酸取代在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hill在1979年紐約學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)出版的《Protein》中進行了描述。最常見的互換有Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thu/Ser，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly，以及它們相反的互換。

對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見地，這種取代可以在對分子功能起重要作用的區(qū)域之外發(fā)生，而且仍產(chǎn)生活性多肽。對于由本發(fā)明的多肽，其活性必需的并因此選擇不被取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變進行鑒定(如參見，Cunningham和Wells，1989，Science244：1081-1085)。后一技術(shù)是在分子中每一個帶正電荷的殘基處引入突變，檢測所得突變分子的除草劑抗性活性，從而確定對該分子活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點也可以通過其三維結(jié)構(gòu)的分析來測定，這種三維結(jié)構(gòu)可由核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)或光親和標(biāo)記等技術(shù)測定(參見，如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol 224:899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBS Letters 309：59-64)。

本發(fā)明中，編碼磺酰脲類除草劑水解酶的氨基酸序列包括但不限于本發(fā)明序列表中涉及的序列，與其具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列類似性/相同性典型的大于60％，優(yōu)選的大于75％，更優(yōu)選的大于80％，甚至更優(yōu)選的大于90％，并且可以大于95％。也可以根據(jù)更特定的相同性和/或類似性范圍定義本發(fā)明的優(yōu)選的多核苷酸和蛋白質(zhì)。例如與本發(fā)明示例的序列有49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相同性和/或類似性。

本發(fā)明中所述調(diào)控序列包括但不限于啟動子、轉(zhuǎn)運肽、終止子、增強子、前導(dǎo)序列、內(nèi)含子以及其它可操作地連接到所述磺酰脲類除草劑水解酶基因的調(diào)節(jié)序列。

所述啟動子為植物中可表達的啟動子，所述的“植物中可表達的啟動子”是指確保與其連接的編碼序列在植物細胞內(nèi)進行表達的啟動子。植物中可表達的啟動子可為組成型啟動子。指導(dǎo)植物內(nèi)組成型表達的啟動子的示例包括但不限于，來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子、玉米Ubi啟動子、水稻GOS2基因的啟動子等。備選地，植物中可表達的啟動子可為組織特異的啟動子，即該啟動子在植物的一些組織內(nèi)如在綠色組織中指導(dǎo)編碼序列的表達水平高于植物的其他組織(可通過常規(guī)RNA試驗進行測定)，如PEP羧化酶啟動子。備選地，植物中可表達的啟動子可為創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子或指導(dǎo)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的表達模式的啟動子是指當(dāng)植物經(jīng)受機械或由昆蟲啃食引起的創(chuàng)傷時，啟動子調(diào)控下的編碼序列的表達較正常生長條件下有顯著提高。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子的示例包括但不限于，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因(pinⅠ和pinⅡ)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動子。

所述轉(zhuǎn)運肽(又稱分泌信號序列或?qū)蛐蛄?是指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物到特定的細胞器或細胞區(qū)室，對受體蛋白質(zhì)來說，所述轉(zhuǎn)運肽可以是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉(zhuǎn)運肽序列靶向葉綠體，或者利用‘KDEL’保留序列靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或者利用大麥植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。

所述前導(dǎo)序列包含但不限于，小RNA病毒前導(dǎo)序列，如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū))；馬鈴薯Y病毒組前導(dǎo)序列，如MDMV(玉米矮縮花葉病毒)前導(dǎo)序列；人類免疫球蛋白質(zhì)重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)(BiP)；苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白質(zhì)mRNA的不翻譯前導(dǎo)序列(AMV RNA4)；煙草花葉病毒(TMV)前導(dǎo)序列。

所述增強子包含但不限于，花椰菜花葉病毒(CaMV)增強子、玄參花葉病毒(FMV)增強子、康乃馨風(fēng)化環(huán)病毒(CERV)增強子、木薯脈花葉病毒(CsVMV)增強子、紫茉莉花葉病毒(MMV)增強子、夜香樹黃化曲葉病毒(CmYLCV)增強子、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)和花生褪綠線條花葉病毒(PCLSV)增強子。

對于單子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，玉米hsp70內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子、Adh內(nèi)含子1、蔗糖合酶內(nèi)含子或水稻Act1內(nèi)含子。對于雙子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，CAT-1內(nèi)含子、pKANNIBAL內(nèi)含子、PIV2內(nèi)含子和“超級泛素”內(nèi)含子。

所述終止子可以為在植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號序列，包括但不限于，來源于農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于蛋白酶抑制劑Ⅱ(pinⅡ)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信號序列和來源于α-微管蛋白(α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信號序列。

本發(fā)明中所述“有效連接”表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對相連序列來說需要的功能。在本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將啟動子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子控制和調(diào)控。當(dāng)感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達時“有效連接”表示：啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實現(xiàn)編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實現(xiàn)編碼的蛋白的表達時，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結(jié)，并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關(guān)系是符合讀碼框的?？梢浴坝行нB接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表達功能的序列(即基因表達元件，例如啟動子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點和/或轉(zhuǎn)錄終止子)、提供DNA轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點特異性重組酶識別位點、整合酶識別位點)、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標(biāo)記物、生物合成基因)、提供可計分標(biāo)記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點特異性重組序列)和提供復(fù)制功能的序列(即細菌的復(fù)制起點、自主復(fù)制序列、著絲粒序列)。

本發(fā)明中所述“宿主細胞”是指在宿主細胞基因組中，或者在獨立于宿主細胞的基因組而自主復(fù)制的染色體外載體中含有目標(biāo)重組核酸的細胞。宿主細胞可以是任何細胞類型。

本發(fā)明中所述“轉(zhuǎn)化”是指將DNA引入細胞，從而DNA以染色體外元件或染色體整合體形式維持在細胞內(nèi)。

多核苷酸可以被整合到宿主細胞的基因組中，或者存在于在宿主細胞內(nèi)自主復(fù)制的載體上。

本發(fā)明中，將外源DNA導(dǎo)入植物，如將編碼所述磺酰脲類除草劑水解酶的基因或表達盒或重組載體導(dǎo)入植物細胞，常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。

能使用不同農(nóng)桿菌菌株，包括但不限于根癌農(nóng)桿菌和毛根農(nóng)桿菌。優(yōu)選使用可轉(zhuǎn)化態(tài)菌株，合適根癌農(nóng)桿菌菌株包括菌株A208、菌株EHA101、LBA4404。合適毛根農(nóng)桿菌包括菌株K599?？赊D(zhuǎn)化態(tài)農(nóng)桿菌載體的構(gòu)建為本領(lǐng)域所熟知的。

在選擇劑存在的情況下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物細胞。優(yōu)選地，用磺酰脲類除草劑水解酶(SULE)基因轉(zhuǎn)化，并且轉(zhuǎn)化的基因在磺酰脲類除草劑存在的情況下培養(yǎng)。在含有磺酰脲類除草劑為選擇劑的培養(yǎng)基中，SULE基因轉(zhuǎn)化的植物細胞選擇性生長。

含有異源核酸(即含有按照本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的細胞或組織)的轉(zhuǎn)基因植物以及通過該轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子和后代是本發(fā)明所涉及的。將轉(zhuǎn)化的細胞培養(yǎng)成有用栽培品種的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。植物組織體外培養(yǎng)技術(shù)和整個植株再生技術(shù)也是公知的。相應(yīng)的，所述“種子”包括這些轉(zhuǎn)化植物的種子以及轉(zhuǎn)化植物后代產(chǎn)生的種子。所述“植物”不僅包括轉(zhuǎn)化和再生的植物，還包括通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化和再生植物的后代。

可以從本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物中篩選成功的轉(zhuǎn)化植物。為了開發(fā)改良的植物和種子品系，可以持續(xù)地篩選和選擇本發(fā)明再生植物的種子和子代植物以使轉(zhuǎn)基因和整合的核酸序列持續(xù)存在。因此，可以將所需要的轉(zhuǎn)基因核酸序列移入(即漸滲或交配)其它的遺傳品系如某些原種或商業(yè)上有用的品系或品種中。漸滲目的基因進入遺傳植物品系的方法可通過本領(lǐng)域公知的多種技術(shù)來實現(xiàn)，包括通過傳統(tǒng)的育種、原生質(zhì)體融合、細胞核轉(zhuǎn)移以及染色體轉(zhuǎn)移。育種方法和技術(shù)也是本領(lǐng)域公知的。根據(jù)本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因植物和自交系可用于生產(chǎn)商業(yè)上有價值的雜交植物和農(nóng)作物。

本發(fā)明提供了一種使用磺酰脲類除草劑水解酶基因作為選擇標(biāo)記物的轉(zhuǎn)化方法，具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明首次提出在植物轉(zhuǎn)化過程中以磺酰脲類除草劑水解酶基因作為選擇標(biāo)記物，不僅為選擇轉(zhuǎn)化細胞提供了新的方法，也為培育具有耐受除草劑性狀的植物提供新的選擇。

2、建立新的篩選體系。本發(fā)明采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，獲得了磺酰脲類除草劑作為選擇劑時有效的篩選濃度范圍，并獲得了對ALS抑制劑具有耐受性的轉(zhuǎn)基因植株。

3、轉(zhuǎn)化效率高。本發(fā)明經(jīng)過二次不同濃度選擇劑的篩選，其后代獲得陽性植株的比例顯著升高，轉(zhuǎn)化效率可高達4％。

4、商業(yè)價值高?；酋ｋ孱惓輨閮?nèi)吸型除草劑，本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因植株對磺酰脲類除草劑的抗性較高，且其后代能穩(wěn)定遺傳，可直接開發(fā)成抗磺酰脲類作物用于產(chǎn)品的開發(fā)。

下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的詳細描述。

附圖說明

圖1為本發(fā)明轉(zhuǎn)化大豆的方法的重組克隆載體DBN01-T構(gòu)建流程圖；

圖2為本發(fā)明轉(zhuǎn)化大豆的方法的重組表達載體DBN100954構(gòu)建流程圖；

圖3為本發(fā)明轉(zhuǎn)化大豆的方法的轉(zhuǎn)化大豆組織的效果圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例進一步說明本發(fā)明使用磺酰脲類除草劑水解酶基因作為選擇標(biāo)記物的轉(zhuǎn)化方法的技術(shù)方案。

第一實施例、重組表達載體的構(gòu)建及重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

1、構(gòu)建含有目的基因的重組克隆載體

將SULE核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T(Promega，Madison，USA，CAT：A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM-T載體說明書進行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構(gòu)建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；f1表示噬菌體f1的復(fù)制起點；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；T7為T7RNA聚合酶啟動子；SULE為磺酰脲類除草劑水解酶基因核苷酸序列(SEQ ID NO:1)；MCS為多克隆位點)。

然后將重組克隆載體DBN01-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞(Transgen，Beijing，China，CAT：CD501)，其熱激條件為：50μl大腸桿菌T1感受態(tài)細胞、10μl質(zhì)粒DNA(重組克隆載體DBN01-T)，42℃水浴30秒；37℃振蕩培養(yǎng)1小時(100rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)，在表面涂有IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37℃條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒：將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心1min，去上清液，沉淀菌體用100μl冰預(yù)冷的溶液I(25mM Tris-HCl，10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)懸浮；加入200μl新配制的溶液II(0.2M NaOH，1％SDS(十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III(3M醋酸鉀，5M醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min；于溫度4℃、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70％的乙醇洗滌后晾干；加入30μl含RNase(20μg/ml)的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)溶解沉淀；于溫度37℃下水浴30min，消化RNA；于溫度-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取的質(zhì)粒經(jīng)ApaI和EcoRV酶切鑒定后，對陽性克隆進行測序驗證，結(jié)果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的SULE基因序列為序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2、構(gòu)建含有目的基因的重組表達載體

用限制性內(nèi)切酶SpeI和SalI分別酶切重組克隆載體DBN01-T和表達載體DBNBC-01(載體骨架：pCAMBIA2301(CAMBIA機構(gòu)可以提供))，將切下的SULE基因序列插到表達載體DBNBC-01的SpeI和SalI位點之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達載體DBN100954，其構(gòu)建流程如圖2所示(Kan：卡那霉素基因；RB：右邊界；pr35S：花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子(SEQ ID NO:3)；SULE：磺酰脲類除草劑水解酶基因核苷酸序列(SEQ ID NO:1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)；t35S：花椰菜花葉病毒35S基因的終止子(SEQ ID NO:4)；LB：左邊界)。

將重組表達載體DBN100954用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞，其熱激條件為：50μl大腸桿菌T1感受態(tài)細胞、10μl質(zhì)粒DNA(重組表達載體DBN100954)，42℃水浴30秒；37℃振蕩培養(yǎng)1小時(200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上于溫度37℃條件下培養(yǎng)12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37℃條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SpeI和SalI酶切后鑒定，并將陽性克隆進行測序鑒定，結(jié)果表明重組表達載體DBN100954在SpeI和SalI位點間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即SULE核苷酸序列。

3、重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達載體DBN100954用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404(Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為：100μL農(nóng)桿菌LBA4404、3μL質(zhì)粒DNA(重組表達載體)；置于液氮中10分鐘，37℃溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28℃、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶ApaLI和EcoRV酶切后進行酶切驗證，結(jié)果表明重組表達載體DBN100954結(jié)構(gòu)完全正確。

第二實施例、轉(zhuǎn)基因大豆植株的獲得

大豆種子消毒：取完全干透的成熟大豆種子(中黃13)放在培養(yǎng)皿中，數(shù)量約占培養(yǎng)皿的1/3。將其放在通風(fēng)櫥的干燥器中，干燥器中放置250ml大燒杯，里面裝有120ml次氯酸鈉。沿著燒杯壁逐滴加入6ml濃鹽酸，關(guān)閉干燥器并密封蓋好，同時關(guān)閉通風(fēng)櫥的玻璃，使大豆種子暴露于通風(fēng)櫥內(nèi)的氯氣中滅菌3小時；蓋好培養(yǎng)皿蓋后將其拿出搖晃2-3分鐘。重復(fù)上述過程一次，并將裝有大豆種子的培養(yǎng)皿放置通風(fēng)櫥過夜滅菌。

大豆種子萌發(fā)：將消毒后的大豆種子15粒接種在大豆萌發(fā)培養(yǎng)基(B5鹽3.1g/L，B5維他命，蔗糖20g/L，瓊脂8g/L，pH5.6)上進行萌發(fā)，培養(yǎng)條件為：溫度25±1℃，光周期為16/8h，大豆種子的種臍一側(cè)插入培養(yǎng)基，接種后用保鮮膜將培養(yǎng)皿包好。

在本實施例的萌發(fā)培養(yǎng)基中，B5鹽還可以為N6鹽(濃度為3.95g/L)或MS鹽(濃度為4.3g/L)，蔗糖的濃度可以為5-100g/L；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進行任意組合，但以所述萌發(fā)培養(yǎng)基(B5鹽3.1g/L，B5維他命，蔗糖20g/L，瓊脂8g/L，pH5.6)為優(yōu)選。

預(yù)處理外植體：萌發(fā)1天后，去除1片子葉和第1片真葉，將該裸露的分生組織接種到含有細胞分裂素的預(yù)處理培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、B5維他命、蔗糖20g/L、瓊脂8g/L、2-嗎啉乙磺酸(MES)4g/L、玉米素(ZT)2mg/L、6-芐基腺嘌呤(6-BAP)1mg/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L，pH5.3)，在此步驟中加入了細胞分裂素，使分生組織區(qū)的細胞處于活躍狀態(tài)，同時在培養(yǎng)基還加入了AS，預(yù)處理2-5天，優(yōu)選為3天，將預(yù)處理后的分生組織塊用解剖刀的刀背進行創(chuàng)傷(至少3刀，優(yōu)選為5刀)，創(chuàng)傷后進行超聲波處理2-5分鐘，優(yōu)選為3分鐘。

在本實施例的預(yù)處理培養(yǎng)基中，MS鹽還可以為N6鹽(濃度為3.95g/L)或B5鹽(濃度為3.1g/L)，蔗糖的濃度可以為5-100g/L，MES的濃度可以為0.1-5g/L，ZT的濃度可以為0.1-5mg/L，6-BAP的濃度可以為0.1-5g/L，AS的濃度可以為10-50mg/L；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進行任意組合，但以所述預(yù)處理培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、B5維他命、蔗糖20g/L、瓊脂8g/L、MES4g/L、ZT 2mg/L、6-BAP 1mg/L、AS 40mg/L，pH5.3)為優(yōu)選。

農(nóng)桿菌菌液的制備：將農(nóng)桿菌菌株從-80℃冰箱中取出，挑取含有DBN100954的農(nóng)桿菌單菌落，用槍頭在加有卡那霉素(Kanamycin)的固體YP培養(yǎng)板(酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂8g、卡那霉素25mg/L，pH7.0)上劃線，在28℃黑暗條件下培養(yǎng)2-3天。刮取YP培養(yǎng)板上的菌斑，在新的YP培養(yǎng)板上再培養(yǎng)1天；刮取培養(yǎng)3-4天的菌落，放入裝有30ml侵染液(即侵染培養(yǎng)基(MS鹽2.15g/L、B5維他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、AS 40mg/L、MES 4g/L、ZT 2mg/L，pH5.3))的50ml離心管中，不斷搖晃以使菌體完全稀釋在侵染液中，將稀釋好的農(nóng)桿菌菌液倒入裝有150ml侵染液的250ml玻璃瓶(滅菌)中，定容，將農(nóng)桿菌菌液的濃度調(diào)整為OD₆₆₀＝0.5-0.8，待用。

在本實施例的侵染培養(yǎng)基中，MS鹽還可以為N6鹽(濃度為3.95g/L)或B5鹽(濃度為3.1g/L)，蔗糖的濃度可以為5-100g/L，葡萄糖的濃度可以為5-100g/L，AS的濃度可以為10-50mg/L，MES的濃度可以為0.1-5g/L，ZT的濃度可以為0.1-5mg/L；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進行任意組合，但以所述侵染培養(yǎng)基(MS鹽2.15g/L、B5維他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、AS 40mg/L、MES 4g/L、ZT 2mg/L，pH5.3)為優(yōu)選。

農(nóng)桿菌侵染大豆分生組織塊：將農(nóng)桿菌菌液(10-15ml)接觸上述超聲波處理后的大豆分生組織塊的子葉節(jié)組織一起放置至少3小時，優(yōu)選為5小時；侵染結(jié)束后將農(nóng)桿菌菌液吸出，并用濾紙將附著在大豆分生組織塊上的農(nóng)桿菌菌液徹底吸干。

農(nóng)桿菌與大豆分生組織塊共培養(yǎng)：將吸干農(nóng)桿菌菌液的分生組織塊轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、B5維他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、MES 4g/L、ZT 2mg/L、瓊脂8g/L，pH5.6)上，培養(yǎng)基中放置一張濾紙，并且子葉近軸面向上，每皿15粒，在22℃恒溫暗培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)2-5天，優(yōu)選為3天。

在本實施例上述共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，蔗糖的濃度可以為5-100g/L，葡萄糖的濃度可以為5-100g/L，MES的濃度可以為0.1-5g/L，ZT的濃度可以為0.1-5mg/L；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進行任意組合，但以所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS鹽4.3g/L、B5維他命、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、MES 4g/L、ZT 2mg/L、瓊脂8g/L，pH5.6)為優(yōu)選。

大豆分生組織塊的恢復(fù)：將共培養(yǎng)后的分生組織塊的伸長的胚軸切掉，然后將切掉胚軸后的分生組織塊轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基(B5鹽3.1g/L、B5維他命、MES 1g/L、蔗糖30g/L、ZT 2mg/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素150mg/L、谷氨酸100mg/L、天冬氨酸100mg/L，pH5.6)上，恢復(fù)2-5天，優(yōu)選為3天，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細胞提供恢復(fù)期。

在本實施例上述恢復(fù)培養(yǎng)基中，MES的濃度可以為0.1-5g/L，蔗糖的濃度可以為5-100g/L，ZT的濃度可以為0.1-5mg/L，頭孢霉素100-300mg/L，谷氨酸50-200mg/L，天冬氨酸50-200mg/L；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進行任意組合，但以所述恢復(fù)培養(yǎng)基(B5鹽3.1g/L、B5維他命、MES 1g/L、蔗糖30g/L、ZT 2mg/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素150mg/L、谷氨酸100mg/L、天冬氨酸100mg/L，pH5.6)為優(yōu)選。

大豆分生組織塊的篩選：

(1)第一篩選培養(yǎng)期：恢復(fù)期結(jié)束后，將分生組織塊轉(zhuǎn)移到第一篩選培養(yǎng)基(B5鹽3.1g/L、B5維他命、MES 1g/L、蔗糖30g/L、6-BAP 1mg/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素150mg/L、谷氨酸100mg/L、天冬氨酸100mg/L、苯磺隆0.5-1.0mg/L，pH5.6)上，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細胞選擇性生長，在溫度24℃、光周期(光/暗)16:8的條件下篩選培養(yǎng)2周。

(2)第二篩選培養(yǎng)期：將第一篩選培養(yǎng)期后的分生組織塊轉(zhuǎn)移到第二篩選培養(yǎng)基(B5鹽3.1g/L、B5維他命、MES 1g/L、蔗糖30g/L、6-BAP 1mg/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素150mg/L、谷氨酸100mg/L、天冬氨酸100mg/L、苯磺隆3-15mg/L，pH5.6)上，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細胞選擇性生長，在溫度24℃、光周期(光/暗)16:8的條件下篩選培養(yǎng)2周。

將分生組織塊轉(zhuǎn)移到第一篩選培養(yǎng)基(苯磺隆0.5-1.0mg/L)和/或第二篩選培養(yǎng)基(苯磺隆3-15mg/L)上進行1或2次苯磺隆耐受性篩選，18種處理的具體信息如表1所示(帶“/”的為僅進行1次苯磺隆耐受性篩選)，每個處理進行篩選的結(jié)果如表2所示。

表1、對大豆分生組織塊進行18種不同篩選處理的具體信息

在本實施例上述第一篩選培養(yǎng)基和第二篩選培養(yǎng)基中，B5鹽還可以為N6鹽(濃度為3.95g/L)或MS鹽(濃度為4.3g/L)，MES的濃度可以為0.1-5g/L，蔗糖的濃度可以為5-100g/L，6-BAP的濃度可以為0.1-5mg/L，頭孢霉素100-300mg/L，谷氨酸50-200mg/L，天冬氨酸50-200mg/L；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進行任意組合，但以所述第一篩選培養(yǎng)基和第二篩選培養(yǎng)基(除苯磺隆外的其它成分：B5鹽3.1g/L、B5維他命、MES 1g/L、蔗糖30g/L、6-BAP 1mg/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素150mg/L、谷氨酸100mg/L、天冬氨酸100mg/L，pH5.6)為優(yōu)選。

大豆抗性組織塊再生成植物：分別將上述18種篩選處理后的抗性組織塊從第二篩選培養(yǎng)基中取出，切掉其上死去的組織和附著在上面的子葉，將抗性組織塊轉(zhuǎn)移到(斜插入)B5分化培養(yǎng)基(B5鹽3.1g/L、B5維他命、MES 1g/L、蔗糖30g/L、ZT 1mg/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素150mg/L、谷氨酸50mg/L、天冬氨酸50mg/L、赤霉素1mg/L、生長素1mg/L、苯磺隆0.1-2mg/L，pH5.6)上，在溫度24℃、光周期(光/暗)16:8的條件下培養(yǎng)分化3周直到抗性組織塊(轉(zhuǎn)化的細胞)再生成植物；

在本實施例上述B5分化培養(yǎng)基中，MES的濃度可以為0.1-5g/L，蔗糖的濃度可以為5-100g/L，ZT的濃度可以為0.1-5mg/L，頭孢霉素100-300mg/L，谷氨酸50-200mg/L、天冬氨酸50-200mg/L，赤霉素0.1-5mg/L，生長素0.1-5mg/L；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進行任意組合，但以所述B5分化培養(yǎng)基(除苯磺隆外的其它成分：B5鹽3.1g/L、B5維他命、MES 1g/L、蔗糖30g/L、ZT 1mg/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素150mg/L、谷氨酸50mg/L、天冬氨酸50mg/L、赤霉素1mg/L、生長素1mg/L，pH5.6)為優(yōu)選。

將上述18種處理分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到B5生根培養(yǎng)基(B5鹽3.1g/L、B5維他命、MES 1g/L、蔗糖30g/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素150mg/L、吲哚-3-丁酸(IBA)1mg/L，pH5.6)上，在25℃下培養(yǎng)至約10cm高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實。在溫室中，每天于26℃下培養(yǎng)16小時，再于20℃下培養(yǎng)8小時，可以獲得轉(zhuǎn)基因植株。

在本實施例上述B5生根培養(yǎng)基中，MES的濃度可以為0.1-5g/L，蔗糖的濃度可以為5-100g/L，頭孢霉素100-300mg/L，IBA的濃度可以為0.1-5mg/L；上述成分均可以在其濃度范圍內(nèi)進行任意組合，但以所述B5生根培養(yǎng)基(B5鹽3.1g/L、B5維他命、2-嗎啉乙磺酸(MES)1g/L、蔗糖30g/L、瓊脂8g/L、頭孢霉素150mg/L、吲哚-3-丁酸(IBA)1mg/L，pH5.6)為優(yōu)選。

在本實施例中，除苯磺隆外，其它均采用優(yōu)選方案。

第三實施例、用TaqMan驗證轉(zhuǎn)入SULE核苷酸序列的大豆植株

分別取上述18種篩選處理后的轉(zhuǎn)入SULE核苷酸序列的大豆植株的葉片約100mg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組DNA，通過Taqman探針熒光定量PCR方法檢測SULE基因的拷貝數(shù)。同時以野生型大豆植株作為對照，按照上述方法進行檢測分析。實驗設(shè)3次重復(fù)，取平均值。

檢測SULE基因拷貝數(shù)的具體方法如下：

步驟11、分別取上述18種篩選處理后的轉(zhuǎn)入SULE核苷酸序列的大豆植株和野生型大豆植株的葉片各100mg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個樣品取3個重復(fù)；

步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA，具體方法參考其產(chǎn)品說明書；

步驟13、用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度；

步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80-100ng/μl；

步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過鑒定已知拷貝數(shù)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，以野生型大豆植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復(fù)，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是：

以下引物和探針用來檢測SULE核苷酸序列：

引物1：TGGGAGAGGAAGGGGTAACAT，如序列表中SEQ ID NO:5所示；

引物2：TATCTCTCACCCAGGCACCTT，如序列表中SEQ ID NO:6所示；

探針1：ACGGACCTTTCGGACAGTTGGAGGA，如序列表中SEQ ID NO:7所示；

PCR反應(yīng)體系為：

所述50×引物/探針混合物包含1mM濃度的每種引物各45μl，100μM濃度的探針50μl和860μl 1×TE緩沖液，并且在4℃，貯藏在琥珀試管中。

PCR反應(yīng)條件為：

利用SDS2.3軟件(Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)。

實驗結(jié)果表明，SULE核苷酸序列整合到所檢測的大豆植株的染色體組中，18種篩選處理的實驗結(jié)果如表2和圖3所示。

表2、18種篩選處理的實驗結(jié)果

由表2可得，在轉(zhuǎn)化過程的篩選階段，經(jīng)過一次篩選的再生組織(篩選處理1、6、11、12、16和17)，其后代獲得的陽性植株率較低，甚至不能獲得陽性植株，轉(zhuǎn)化效率在2％以下；經(jīng)過兩次篩選，在相同的篩選濃度培養(yǎng)基(篩選處理2、10和18)上培養(yǎng)后，其后代獲得的陽性植株率較低，但仍能獲得陽性植株，轉(zhuǎn)化效率在1％左右；在梯度篩選濃度培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，其后代獲得的陽性植株率較高，轉(zhuǎn)化效率在3％以上，尤以篩選處理4和8為佳，轉(zhuǎn)化效率分別為4.57％和4.29％。

綜上所述，本發(fā)明首次提出在植物轉(zhuǎn)化過程中以磺酰脲類除草劑水解酶基因作為選擇標(biāo)記物，為培育具有耐受除草劑性狀的植物提供新的選擇；本發(fā)明采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，獲得了磺酰脲類除草劑作為選擇劑時有效的篩選濃度范圍，并獲得了對ALS抑制劑具有耐受性的轉(zhuǎn)基因植株；本發(fā)明經(jīng)過二次不同濃度選擇劑的篩選，其后代獲得陽性植株的比例顯著升高，平均轉(zhuǎn)化效率可高達4％；同時本發(fā)明使用磺酰脲類除草劑水解酶基因作為選擇標(biāo)記物的轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因植株商業(yè)價值高、抗性好且遺傳穩(wěn)定。

最后所應(yīng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司

北京大北農(nóng)生物科技集團股份有限公司

<120> 使用磺酰脲類除草劑水解酶基因作為選擇標(biāo)記物的轉(zhuǎn)化方法

<130> DBNBC114

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1110

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 磺酰脲類除草劑水解酶基因核苷酸序列

<400> 1

atggagactg ataacgtgga actcgcccaa tctaagagaa aggtggtgct ggctgaacaa 60

gggtcatttt acataggggg taggactgtt actggtcctg gcaagtttga tccatccaaa 120

cctgtgatac cctacagtaa cgaaggagca acattctata ttaaccaaat gtatgttaac 180

ttccaggccc cagtgagacc taggggactt ccattggttt tctggcatgg aggtggcttg 240

actggtcaca tctgggagtc tacacctgac ggcagacccg ggtttcaaac cctcttcgtt 300

caggataggc ataccgtgta cactattgac caacctggga gaggaagggg taacatccca 360

acttttaacg gacctttcgg acagttggag gaagagagta ttgttaacac tgtgacagga 420

aattcttcaa aggaaggtgc ctgggtgaga gataggcttg gccctgctcc cgggcaattt 480

ttcgagaact ctcagtttcc tagaggctat gaagacaatt actttaagga gatgggattc 540

agcccatcta tatccagtga tgaaattgtt gacgctgttg tgaaactcgt gacccatatt 600

ggtccttgtg ttctggtgac tcactcagca tccggcgttc ttgggatgag agtggctaca 660

cacgcaaaga atgttagggg aattgtggcc tatgaaccag ctacctcaat cttccccaag 720

ggaaaagttc cagagatacc acctctcgct gataagaaaa gccaaatctt tcccccattc 780

gaaatacagg agtcttactt taagaaactt gccaagattc caatccaatt tgttttcgga 840

gataacatcc ccaagaatcc aaaatcagca tattggttcc tggactggtg gagagtgaca 900

agatacgcac atagtctcag cctggaggcc ataaacaaat tggggggaca agcttccctt 960

ttggatcttc ctactgcagg attgagaggt aatacacact ttcccttcac cgataggaac 1020

aatgttcagg tggcttctct cctgtcagac tttctgggta aacacggtct ggatcaaaat 1080

gagagcaaac tcgccgccgc cctggaatga 1110

<210> 2

<211> 369

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 磺酰脲類除草劑水解酶基因氨基酸序列

<400> 2

Met Glu Thr Asp Asn Val Glu Leu Ala Gln Ser Lys Arg Lys Val Val

1 5 10 15

Leu Ala Glu Gln Gly Ser Phe Tyr Ile Gly Gly Arg Thr Val Thr Gly

20 25 30

Pro Gly Lys Phe Asp Pro Ser Lys Pro Val Ile Pro Tyr Ser Asn Glu

35 40 45

Gly Ala Thr Phe Tyr Ile Asn Gln Met Tyr Val Asn Phe Gln Ala Pro

50 55 60

Val Arg Pro Arg Gly Leu Pro Leu Val Phe Trp His Gly Gly Gly Leu

65 70 75 80

Thr Gly His Ile Trp Glu Ser Thr Pro Asp Gly Arg Pro Gly Phe Gln

85 90 95

Thr Leu Phe Val Gln Asp Arg His Thr Val Tyr Thr Ile Asp Gln Pro

100 105 110

Gly Arg Gly Arg Gly Asn Ile Pro Thr Phe Asn Gly Pro Phe Gly Gln

115 120 125

Leu Glu Glu Glu Ser Ile Val Asn Thr Val Thr Gly Asn Ser Ser Lys

130 135 140

Glu Gly Ala Trp Val Arg Asp Arg Leu Gly Pro Ala Pro Gly Gln Phe

145 150 155 160

Phe Glu Asn Ser Gln Phe Pro Arg Gly Tyr Glu Asp Asn Tyr Phe Lys

165 170 175

Glu Met Gly Phe Ser Pro Ser Ile Ser Ser Asp Glu Ile Val Asp Ala

180 185 190

Val Val Lys Leu Val Thr His Ile Gly Pro Cys Val Leu Val Thr His

195 200 205

Ser Ala Ser Gly Val Leu Gly Met Arg Val Ala Thr His Ala Lys Asn

210 215 220

Val Arg Gly Ile Val Ala Tyr Glu Pro Ala Thr Ser Ile Phe Pro Lys

225 230 235 240

Gly Lys Val Pro Glu Ile Pro Pro Leu Ala Asp Lys Lys Ser Gln Ile

245 250 255

Phe Pro Pro Phe Glu Ile Gln Glu Ser Tyr Phe Lys Lys Leu Ala Lys

260 265 270

Ile Pro Ile Gln Phe Val Phe Gly Asp Asn Ile Pro Lys Asn Pro Lys

275 280 285

Ser Ala Tyr Trp Phe Leu Asp Trp Trp Arg Val Thr Arg Tyr Ala His

290 295 300

Ser Leu Ser Leu Glu Ala Ile Asn Lys Leu Gly Gly Gln Ala Ser Leu

305 310 315 320

Leu Asp Leu Pro Thr Ala Gly Leu Arg Gly Asn Thr His Phe Pro Phe

325 330 335

Thr Asp Arg Asn Asn Val Gln Val Ala Ser Leu Leu Ser Asp Phe Leu

340 345 350

Gly Lys His Gly Leu Asp Gln Asn Glu Ser Lys Leu Ala Ala Ala Leu

355 360 365

Glu

<210> 3

<211> 530

<212> DNA

<213> Cauliflower mosaic virus

<400> 3

ccatggagtc aaagattcaa atagaggacc taacagaact cgccgtaaag actggcgaac 60

agttcataca gagtctctta cgactcaatg acaagaagaa aatcttcgtc aacatggtgg 120

agcacgacac gcttgtctac tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg 180

caattgagac ttttcaacaa agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag 240

ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc 300

attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg 360

gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc 420

aagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt 480

cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt ggagaggaca 530

<210> 4

<211> 195

<212> DNA

<213> Cauliflower mosaic virus

<400> 4

ctgaaatcac cagtctctct ctacaaatct atctctctct ataataatgt gtgagtagtt 60

cccagataag ggaattaggg ttcttatagg gtttcgctca tgtgttgagc atataagaaa 120

cccttagtat gtatttgtat ttgtaaaata cttctatcaa taaaatttct aattcctaaa 180

accaaaatcc agtgg 195

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物1

<400> 5

tgggagagga aggggtaaca t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物2

<400> 6

tatctctcac ccaggcacct t 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探針1

<400> 7

acggaccttt cggacagttg gagga 25