本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種山牡荊抗腫瘤化合物的研究方法。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是一種嚴(yán)重危害人類健康和生命的疾病，也是世界醫(yī)學(xué)界的重大難題。2008年，全球惡性腫瘤患者1270萬(wàn)人，死亡人數(shù)高達(dá)760萬(wàn)。世界范圍內(nèi)因惡性腫瘤死亡的人數(shù)，比艾滋病、瘧疾和結(jié)核病加起來(lái)還要多。如果不采取有效措施，預(yù)計(jì)到2030年，每年將出現(xiàn)2600萬(wàn)新增惡性腫瘤病例，死亡人數(shù)將達(dá)到1700萬(wàn)。我國(guó)每年惡性腫瘤的發(fā)病人數(shù)約為200萬(wàn)，死亡人數(shù)超過(guò)140萬(wàn)，并有逐年上升的趨勢(shì)。攻克惡性腫瘤難關(guān)已成為醫(yī)藥工作者和化學(xué)工作者當(dāng)務(wù)之急的任務(wù)。

近年來(lái)中藥及其有效成分抗腫瘤研究工作取得了一系列的成果，從植物中得到的抗腫瘤成分主要包括生物堿類、萜類、黃酮類、植物多糖類、多酚類、有機(jī)酸類和木脂素類等化合物。當(dāng)今國(guó)際上常用的抗腫瘤植物藥和輔助化療的中藥主要包括紫杉醇、喜樹堿、長(zhǎng)春花堿、白藜蘆醇、鬼臼毒素等。這些植物藥基本上已用于所有種類的癌癥的治療或輔助治療，如紫杉醇已用于喉癌、卵巢癌，黃芪等用于肝癌、五加多糖用于胃癌，魔芋用于腹水腫瘤，山豆根等用于治療消化道癌等。

目前，世界上對(duì)抗腫瘤藥用植物的研究工作已經(jīng)涉及300余科植物，從植物中篩選出的抗癌活性成分已達(dá)617萬(wàn)種。美國(guó)國(guó)立癌癥研究所自1957年以來(lái)，每年篩選出1500-5000中植物提取物的抗癌活性成分。中國(guó)的中醫(yī)藥具有2500多年的歷史，它們?cè)谥委煾鞣N疑難雜癥中顯現(xiàn)出了神奇的療效。但我國(guó)對(duì)植物有效成分的提取分離工作開展較晚，目前約對(duì)3000余種(占我國(guó)植物總數(shù)的10％左右)植物進(jìn)行了有效成分的研究工作，發(fā)現(xiàn)不足300種植物有效成分具有抗癌活性，研究較多的有200余種。因此，我們必須加大對(duì)中醫(yī)藥的研究力度和深度，力爭(zhēng)從植物中獲得毒性低而抗腫瘤作用顯著的新衍生物。

牡荊屬植物Vitex是馬鞭草科喬木或灌木，全世界約250種，主要分布于熱帶和溫帶地區(qū)。我國(guó)有14種，7變種，3變型，主要分布在長(zhǎng)江以南地區(qū)，少數(shù)種類在西北、東北、華北等地也有分布。牡荊屬植物含有多種化學(xué)成分，迄今從該屬植物中獲得的天然產(chǎn)物類型有黃酮類、二帖類、甾類、環(huán)烯醚萜類、三萜類、苯丙素類、倍半萜類等?，F(xiàn)代藥理研究表明，本屬植物所含成分具有多種藥理活性，如抗腫瘤、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎作用、保肝作用、抗氧化作用、抗菌作用、殺蟲作用以及呼吸系統(tǒng)活性等。國(guó)內(nèi)外許多研究機(jī)構(gòu)對(duì)牡荊屬的抗腫瘤作用具有濃厚的興趣，抗腫瘤活性成為該屬植物目前研究的熱點(diǎn)之一。該屬植物提取物可以通過(guò)多種途徑抑制腫瘤增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮抗腫瘤活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)，而提出的一種山牡荊抗腫瘤化合物的研究方法。

一種山牡荊抗腫瘤化合物的研究方法，包括以下步驟；

S1：探索山牡荊有效成分的最佳提取方法，應(yīng)用傳統(tǒng)提取方法、超聲波提取方法、微波提取方法和超臨界流體萃取提取方法分別對(duì)山牡荊有效成分進(jìn)行提取，選取最佳的提取方法；

S2：對(duì)山牡荊中的有效成分進(jìn)行分離和純化，采用有效的分離方法對(duì)山牡荊中的有效成分進(jìn)行分離制備；

S3：將分離出的山牡荊有效成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，利用化學(xué)手段和現(xiàn)代儀器技術(shù)對(duì)分離得到的山牡荊各成分進(jìn)行鑒定；

S4：篩選對(duì)山牡荊最敏感的腫瘤細(xì)胞和有效的抗腫瘤藥物濃度，并進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，配制不同濃度的山牡荊提取物，進(jìn)行山牡荊體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，篩選對(duì)山牡荊和單葉蔓荊最為敏感的腫瘤細(xì)胞和有效的抗腫瘤藥物濃度，并用最敏感的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有效成分抗腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，確定抗腫瘤活性成分的抗腫瘤效果；

S5：進(jìn)行活體抗腫瘤實(shí)驗(yàn)；

S6：對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，發(fā)掘山牡荊抗腫瘤化合物，以活性較好的化合物作為先導(dǎo)化合物，通過(guò)進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化，考察分子中各結(jié)構(gòu)片段對(duì)抗腫瘤活性的影響，并利用化學(xué)手段，結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)及構(gòu)效關(guān)系研究，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，合成大量化合物，結(jié)合活性評(píng)價(jià)，發(fā)掘抗腫瘤效果好的山牡荊化合物。

優(yōu)選的，所述山牡荊中有效成分的分離方法采用色譜分離法，所述色譜分離法包括高效液相制備色譜、中壓制備液相色譜和逆流色譜。

優(yōu)選的，所述活體抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的具體方法為：選用對(duì)山牡荊抗腫瘤成分最敏感的腫瘤細(xì)胞構(gòu)建小鼠腫瘤模型，將山牡荊和單葉蔓荊抗腫瘤成分的高、中、低三個(gè)劑量設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，以生理鹽水為空白組進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，定期監(jiān)測(cè)小鼠皮下瘤體生長(zhǎng)情況并對(duì)動(dòng)物進(jìn)行生存觀察，觀察結(jié)束后，處死小鼠并取動(dòng)物腫瘤及相關(guān)臟器組織進(jìn)行HE、免疫組化及凋亡染色，分析動(dòng)物有無(wú)系統(tǒng)性損害。

本發(fā)明提出的一種山牡荊抗腫瘤化合物的研究方法，能夠?qū)ι侥登G的有效成分進(jìn)行提取和分離，系統(tǒng)的研究山牡荊活性成分的化學(xué)多樣性，探索山牡荊的抗腫瘤活性成分，發(fā)掘山牡荊抗腫瘤化合物，并為研究新型抗腫瘤藥物提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解說(shuō)。

本發(fā)明提出的一種山牡荊抗腫瘤化合物的研究方法，包括以下步驟；

S1：探索山牡荊有效成分的最佳提取方法，應(yīng)用傳統(tǒng)提取方法、超聲波提取方法、微波提取方法和超臨界流體萃取提取方法分別對(duì)山牡荊有效成分進(jìn)行提取，選取最佳的提取方法；

S2：對(duì)山牡荊中的有效成分進(jìn)行分離和純化，采用有效的分離方法對(duì)山牡荊中的有效成分進(jìn)行分離制備；

S3：將分離出的山牡荊有效成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，利用化學(xué)手段和現(xiàn)代儀器技術(shù)對(duì)分離得到的山牡荊各成分進(jìn)行鑒定；

S4：篩選對(duì)山牡荊最敏感的腫瘤細(xì)胞和有效的抗腫瘤藥物濃度，并進(jìn)行抗腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，配制不同濃度的山牡荊提取物，進(jìn)行山牡荊體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，篩選對(duì)山牡荊和單葉蔓荊最為敏感的腫瘤細(xì)胞和有效的抗腫瘤藥物濃度，并用最敏感的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有效成分抗腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，確定抗腫瘤活性成分的抗腫瘤效果；

S5：進(jìn)行活體抗腫瘤實(shí)驗(yàn)；

S6：對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，發(fā)掘山牡荊抗腫瘤化合物，以活性較好的化合物作為先導(dǎo)化合物，通過(guò)進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化，考察分子中各結(jié)構(gòu)片段對(duì)抗腫瘤活性的影響，并利用化學(xué)手段，結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)及構(gòu)效關(guān)系研究，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，合成大量化合物，結(jié)合活性評(píng)價(jià)，發(fā)掘抗腫瘤效果好的山牡荊化合物。

本發(fā)明中，所述山牡荊中有效成分的分離方法采用色譜分離法，所述色譜分離法包括高效液相制備色譜、中壓制備液相色譜和逆流色譜。

本發(fā)明中，所述活體抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的具體方法為：選用對(duì)山牡荊抗腫瘤成分最敏感的腫瘤細(xì)胞構(gòu)建小鼠腫瘤模型，將山牡荊和單葉蔓荊抗腫瘤成分的高、中、低三個(gè)劑量設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，以生理鹽水為空白組進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，定期監(jiān)測(cè)小鼠皮下瘤體生長(zhǎng)情況并對(duì)動(dòng)物進(jìn)行生存觀察，觀察結(jié)束后，處死小鼠并取動(dòng)物腫瘤及相關(guān)臟器組織進(jìn)行HE、免疫組化及凋亡染色，分析動(dòng)物有無(wú)系統(tǒng)性損害。

按照本發(fā)明提出的方法對(duì)山牡荊進(jìn)行提取和分離，得到二十多個(gè)單體化合物，其中主要有以下幾種：

其中，1為紫花牡荊素；

2為β-谷甾醇；

3為胡蘿卜甾醇；

4為ro tundifuran；

5為3,5-O-雙咖啡酰基奎寧酸；

6為3-羥基-9-苯丁酮-4-氧-葡萄糖苷；

7為7-羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-2-羥甲基-6-甲氧基-1,2二氫-3-萘甲醛；

8為vitrofolal C；

9為木犀草素；

10為mussaenosidic acid；

11為turkesterone；

12為vitexifolin E；

13為4,5,7,3’,4’,5’-六羥基-6,8-二甲氧基二氫黃酮醇。

對(duì)以上化合物進(jìn)行初步活性測(cè)試，測(cè)試結(jié)果表明：紫花牡荊素對(duì)人胃癌SGC27901細(xì)胞和人肝癌Hep G2細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用(0.15μg/ml濃度時(shí)，抑制率分別為75％和60％)，ro tundifuran和木犀草素對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞有明顯的抑制作用(0.30μg/ml濃度時(shí)，抑制率分別為80％和65％)，3,5-O-雙咖啡?；鼘幩釋?duì)人肝癌Hep G2細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制作用(0.50μg/ml濃度時(shí)，抑制率為55％)。

本發(fā)明提出的一種山牡荊抗腫瘤化合物的研究方法，能夠?qū)ι侥登G的有效成分進(jìn)行提取和分離，系統(tǒng)的研究山牡荊活性成分的化學(xué)多樣性，探索山牡荊的抗腫瘤活性成分，發(fā)掘山牡荊抗腫瘤化合物，并為研究新型抗腫瘤藥物提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。