本發(fā)明涉及一種與大豆光周期調(diào)控相關(guān)基因GmRAV1的應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

一般來說，屬于短日照植物像大豆、水稻等植物其生長發(fā)育對光周期反應(yīng)非常敏感，這一特性嚴(yán)重阻礙大豆品種的適應(yīng)性，限制大豆播種范圍，影響產(chǎn)量水平的有效發(fā)揮。通?？s短日照時間促進(jìn)大豆、水稻等植物開花，生育期縮短。相反增加日照時間抑制大豆開花，生育期延長。因此，由北向南(生育期間日照時間由長變短)引種會加速成熟，生育期變短，產(chǎn)量降低，限制產(chǎn)量性狀的發(fā)揮。相反，由南向北引種，會延長生育期，不能正常成熟。這一特性嚴(yán)重阻礙大豆品種及其他對光周期反應(yīng)敏感的植物品種的跨區(qū)種植，如大豆品種的適應(yīng)范圍較窄，南北不宜大幅度調(diào)種，需要眾多光周期反應(yīng)各不相同的品種類型，分別適應(yīng)各種不同的生態(tài)條件，因此改變像大豆這樣的植物的光周期敏感性對這些植物品種改良十分重要。

據(jù)已報道至少有7個基因座位影響大豆的開花和成熟時間，將這些基因座位稱為E系列，大豆中大多數(shù)顯性E等位基因?qū)﹂L日照光周期敏感且抑制開花，在自然光照長度下，顯性等位基因不同程度地推遲開花(Cober et al.,1996a)。大豆的E等位基因似乎與擬南芥中參與短日照條件下開花抑制途徑的光穩(wěn)定的光敏色素基因phyB、phyD和phyE功能相似(Devlin et al.,1998)。大豆的光周期敏感性控制開花時間和成熟的性狀可能由主效QTL控制和幾個微效QTL所修飾。有10個大豆開花時間基因已定位在連鎖圖譜上(Tasma and Shoemaker,2003)，其中包括4個光周期相關(guān)基因(PHYA、PHYB、CRY2和CCA1)，5個開花時間基因(FCA、DET1、COL1、COL2和LD)和1個花分生組織特性基因(AP2)。

在現(xiàn)有常規(guī)育種中，通過雜交選擇早熟品種或晚熟品種，或通過輻射和化學(xué)試劑進(jìn)行誘變等常規(guī)方法進(jìn)行品種改良所需時間較長，并且不能預(yù)計后代中突變的程度或方向的弱點，用這些基因進(jìn)行品種改良是一種相對于傳統(tǒng)方法而言特別有效并且簡單可靠的方法。

另一方面，大豆的遺傳轉(zhuǎn)化研究受到世界各國的普遍重視，大豆組織培養(yǎng)有一定的難度，是公認(rèn)的難轉(zhuǎn)化的作物，其主要原因是從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織分化再生植株困難，盡管許多研究者致力于優(yōu)化大豆的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，但是大豆轉(zhuǎn)化的頻率仍然很低，受基因型限制，重復(fù)性很差。建立良好的受體系統(tǒng)是實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的先決條件。因此，鑒定新的大豆芽再生相關(guān)基因，通過轉(zhuǎn)基因方法提高不同基因型大豆品種的轉(zhuǎn)化效率，創(chuàng)制高再生的大豆品種，從而提高大豆的遺傳轉(zhuǎn)化效率是育種的另一個重要目標(biāo)。同時，控制植株的株型也是大豆育種中設(shè)計產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。但現(xiàn)有技術(shù)中缺少能夠有效控制植株株型的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種大豆GmRAV1基因在控制植物生育期和生長過程的應(yīng)用，所采取的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明所提供的基因和蛋白質(zhì)，命名為GmRAV1，來源于大豆(Glycine max(L.)Merrill.)東農(nóng)42。將該基因序列(GmRAV1)轉(zhuǎn)入要改良的大豆或其他雙子葉植物和單子葉植物中，進(jìn)行基因沉默，使植物表現(xiàn)出植株高大，分枝多,葉色濃綠，莖間距增大，早花，早熟，光周期不敏感或光周期敏感性降低的特征；或使基因過量表達(dá)表現(xiàn)出不定芽再生能力增強(qiáng)的特征，并將這種方法用于培育和改良植物的廣適性或再生能力的新品種。

本發(fā)明的目的在于提供大豆GmRAV1基因在控制植物生育期和生長過程中的應(yīng)用。

所述GmRAV1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，編碼區(qū)編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

優(yōu)選地，所述應(yīng)用具體是在在控制植物光周期敏感性過程中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述應(yīng)用是將GmRAV1基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞后，通過沉默GmRAV1基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)控制植物的光周期敏感性。

所述應(yīng)用的步驟如下：

1)將含有GmRAV1基因的編碼區(qū)或啟動子序列的片段與植物RNAi干涉表達(dá)載體進(jìn)行連接，構(gòu)建植物RNAi表達(dá)載體；

2)將步驟1)所得的植物RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到植物細(xì)胞中，獲得植物RNAi表達(dá)載體的細(xì)胞；

3)篩選步驟2)中所得植物RNAi表達(dá)載體的細(xì)胞中的表達(dá)沉默的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，培育并獲得轉(zhuǎn)GmRAV1基因的植株。

優(yōu)選地，步驟1)所述GmRAV1基因的編碼區(qū)，核苷酸序序列為SEQ ID NO.1中第270-1421位；所述啟動子，是CaMSV35啟動子。

優(yōu)選地，另外一種應(yīng)用方法是在增強(qiáng)植物不定芽再生能力過程中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，上述應(yīng)用是將GmRAV1基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，通過過表達(dá)GmRAV1基因來增強(qiáng)植物的不定芽生長能力。

所述應(yīng)用的步驟如下：

1)將含有GmRAV1基因的編碼區(qū)序列與表達(dá)載體進(jìn)行連接，構(gòu)建植物表達(dá)載體；

2)將步驟1)所得的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到植物細(xì)胞中，獲得含有植物表達(dá)載體的植物細(xì)胞；

3)篩選步驟2)所得的植物細(xì)胞，培育并獲得過表達(dá)GmRAV1基因的植物。

優(yōu)選地，所述過表達(dá)，是在外加細(xì)胞分裂素和在長日照條件下促進(jìn)GmRAV1基因的過表達(dá)。

優(yōu)選地，另外一種應(yīng)用方法是在控制植株株型過程中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，上述應(yīng)用方法的步驟如下：

1)將GmRAV1基因轉(zhuǎn)入到植株中獲得，轉(zhuǎn)GmRAV1基因植株；

2)通過調(diào)節(jié)GmRAV1基因的表達(dá)量和表油菜素內(nèi)脂epiBL的使用量調(diào)節(jié)植株的株型。

更優(yōu)選地，所述表油菜素內(nèi)脂epiBL的使用量，在MS固體培養(yǎng)基中的添加量為10mmol/L。

在本發(fā)明的方法中，可利用GmRAV1基因作為目的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，其中可以任何一種啟動子例如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、Ubiquitin啟動子或其它啟動子，該表達(dá)載體中必要時可包括增強(qiáng)子，不論是轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子。所用的表達(dá)載體可使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體等。轉(zhuǎn)化方法可包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法或其它方法。

在本發(fā)明的方法中，可利用GmRAV1基因作為目的基因構(gòu)建植物RNAi載體，所用的表達(dá)載體可使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體等。轉(zhuǎn)化方法可包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法或其它方法。

本發(fā)明的GmRAV1基因的受體植物包括單子葉和雙子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、大豆、棉花、蔬菜等，用于抑制表達(dá)提高作物產(chǎn)量和加速作物成熟，或用于RNAi基因沉默降低植物光周期敏感性。

本發(fā)明提供了鑒定大豆中光周期控制開花時間和成熟的性狀相關(guān)的GmRAV1基因并同時確定該基因在大豆根、莖和葉的生長發(fā)育過程中起何種作用的方法。

本發(fā)明獲得的有益效果如下：

本發(fā)明提供的GmRAV1基因(植物基因組數(shù)據(jù)庫phytozome(網(wǎng)址為：https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)的登錄號為Glyma01g22260.1)及蛋白不但可以在調(diào)節(jié)植物光周期過程中進(jìn)行應(yīng)用，同時發(fā)明人還首次發(fā)現(xiàn)，通過過表達(dá)該基因可以增強(qiáng)植物的芽再生能力，提高植物的分裂再生能力。在LD和SD下GmRAV-i(GmRAV基因沉默)大豆植株與對照相比植株明顯高大，莖細(xì)弱，節(jié)間距大，節(jié)數(shù)相差不大，根短，葉片小，說明該基因?qū)ηo的發(fā)育有抑制作用，在LD和SD下擬南芥rav突變體植株與對照相比植株對光周期敏感性明顯降低，在SD和LD下開花時間相似，擬南芥rav突變體植株與對照相比在LD和SD下開花早。

本發(fā)明提供了與SD相比LD誘導(dǎo)該基因在大豆葉片中的表達(dá)，從而使得大豆在長日照下這些營養(yǎng)器官中該基因豐度的上調(diào)抑制了其葉和莖的生長，使得大豆呈現(xiàn)葉片濃綠且大，根長的特征，由于葉片中GmRAV1的表達(dá)對日長作出反應(yīng)，GmRAV1mRNA的豐度在LD下比SD下高，LD促進(jìn)GmRAV1的表達(dá)而抑制大豆開花，SD抑制GmRAV1的表達(dá)而促進(jìn)大豆開花。

本發(fā)明提供了該基因是細(xì)胞分裂素(6-BA、2-ip等)促進(jìn)細(xì)胞分裂、抑制根和下胚軸伸長途徑中的促進(jìn)因子，細(xì)胞分裂素促進(jìn)該基因表達(dá)，添加細(xì)胞分裂素，轉(zhuǎn)GmRAV1基因植株下胚軸和根縮短的幅度比對照大，生長比對照慢，葉片濃綠，分枝多，表明GmRAV1的表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)胞分裂素的效應(yīng)，外源施加細(xì)胞分裂素使得GmRAV-i轉(zhuǎn)基因大豆對細(xì)胞分裂素的響應(yīng)不敏感，轉(zhuǎn)基因大豆株高增高的幅度顯著低于對照大豆株高增高的幅度。

附圖說明

圖1為利用ClustalX(1.83)軟件進(jìn)行多重序列比對將GmRAV1基因與植物中同源基因氨基酸序列比較結(jié)果。

圖2 Real-time RT-PCR分析GmRAV1基因組織特異性表達(dá)變化；

(其中，黑柱代表短日照，白柱代表長日照)。

圖3 Real-time RT-PCR分析長日照(16h/8h光/暗)(LD)、短日照(8h/16h光/暗)(SD)下DN42大豆中GmRAV1基因的生物鐘晝夜節(jié)律表達(dá)規(guī)律；

(圖中，a)為大豆GmRAV1基因在LD和SD下基因的表達(dá)分析，b)GmRAV1基因的LD48h后轉(zhuǎn)移至LL(連續(xù)光照)節(jié)律表達(dá)，c)GmRAV1基因的LD48h后轉(zhuǎn)移至DD(連續(xù)黑暗)節(jié)律表達(dá)，d)GmRAV1基因的SD48h后轉(zhuǎn)移至LL(連續(xù)光照)節(jié)律表達(dá)，e)GmRAV1基因的SD48h后轉(zhuǎn)移至DD(連續(xù)黑暗)節(jié)律表達(dá))。

圖4植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-GmRAV1的質(zhì)粒圖譜。

圖5植物表達(dá)載體pJawoh18-GmRAV1的質(zhì)粒圖譜。

圖6長日照(16h/8h光/暗)(LD)下種于土中45天的DN50、GmRAV1-ox、GmRAV-i大豆苗。

圖7不同日照條件下DN42、GmRAV-i和X DN42大豆苗的生長情況；

(a)長日照(16h/8h光/暗)(LD)和短日照(8h/16h光/暗)(SD)下種于土中1個月的DN50和GmRAV-i大豆苗；(b)長日照(16h/8h光/暗)(LD)和短日照(8h/16h光/暗)(SD)下種于土中1個月的DN42和GmRAV-i、X DN42大豆苗。

圖8哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)轉(zhuǎn)基因基地種植的大豆苗。

圖9施加不同濃度生長分離素后不同植物細(xì)胞的再生情況；

(a)向B₅培養(yǎng)基中外源施加不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA后3種大豆的再生情況；(b)向MS培養(yǎng)基中外源施加不同濃度的細(xì)胞分裂素2-ip后4種擬南芥的再生情況。

圖10添加不同細(xì)胞分離素植物根的生長情況；

(a)向B5培養(yǎng)基中外源施加不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA后3種大豆根和下胚軸的生長情況；(b)向B5培養(yǎng)基中外源施加不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA后3種大豆根和下胚軸的長度圖；；(c)向MS培養(yǎng)基中外源施加不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA后4種垂直培養(yǎng)的擬南芥的根長情況；(d)向MS培養(yǎng)基中外源施加不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA后4種垂直培養(yǎng)的擬南芥的根長統(tǒng)計圖。

圖11 Real-time RT-PCR分析外源施加6-BA(100μmol 6-BA)和未施加6-BA(0μmol 6-BA)的DN42大豆中GmRAV1基因的表達(dá)規(guī)律。

圖12施加不同濃度epiBL對植株胚軸長度的影響；

(a)長日照(16h/8h光/暗)(LD)下向MS培養(yǎng)基中施加不同濃度的epiBL后的Col-0、rav、GmRAV1-ox擬南芥的實際生長情況；(b)長日照(16h/8h光/暗)(LD)下向MS培養(yǎng)基中施加不同濃度的epiBL后的Col-0、rav、GmRAV1-ox擬南芥的下胚軸長度柱形圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。

以下實施例中所用材料、試劑、儀器和方法，未經(jīng)特殊說明，均為本領(lǐng)域中的常規(guī)材料、試劑、儀器和方法，均可通過商業(yè)渠道獲得。

實施例1：GmRAV1基因的克隆和序列分析

以大豆葉片轉(zhuǎn)錄RNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以該cDNA為PCR反應(yīng)模板，獲得全長ORF區(qū)的基因DNA序列。該大豆推測的GmRAV1轉(zhuǎn)錄因子DNA全序列為1757bp，ORF為1155bp，編碼384個氨基酸，含有AP2/B3結(jié)構(gòu)域(見序列表SEQ ID NO.1中第270-1421位)，序列在植物基因組數(shù)據(jù)庫phytozome(網(wǎng)址為：https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)的登錄號為Glyma01g22260.1。同源序列比較發(fā)現(xiàn)(圖1)，該序列與菜豆(Phaseolus vulgaris)(XM_007143739)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)(XM_003591774)RAV1同源性分別為50.20％和42.34％，與玉米(Zea mays)(NM_001148270)同源性為47.07％。

實施例2：Real-time RT-PCR分析日長和生物鐘晝夜節(jié)律對GmRAV1基因表達(dá)的影響

大豆DN42培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱25℃，250mol m^-2sec^-1白光，長日照(16h/8h光/暗)(LD)條件下生長出苗后第20天(定為0d)，一部分轉(zhuǎn)移到短日照(SD)光周期下(8h/16h光/暗)生長，待轉(zhuǎn)移后的0、3、6、9、12、15、18、21、24d，同時對LD和SD葉片取材，液氮速凍，-80℃保存，提取RNA，按照SYBR(R)ExScriptTM RT-PCR Kit的程序進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。GmRAV1擴(kuò)增片斷為144bp，大豆看家基因Actin4(AF049106)擴(kuò)增片斷為214bp，其引物如下：GmRAV1正義引物：GGTGTAGTGGCATAGTGGC，反義引物：

TAAGAAGGGGAGAAGCTAGA；Actin4正義引物：GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT，反義引物：GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA。結(jié)果如圖2和圖3所示。

實施例3：植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-GmRAV1的構(gòu)建、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié)和花絮侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥

以大豆葉片轉(zhuǎn)錄RNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以該cDNA為PCR反應(yīng)模板，獲得全長ORF區(qū)的基因DNA序列。該大豆推測的GmRAV1轉(zhuǎn)錄因子DNA全序列為1757bp，ORF為1155bp，以Bgl II和BstE II為酶切位點，設(shè)計克隆引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件為94℃5min；38個循環(huán)：94℃30s，58℃30s，72℃1min；72℃10min；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，按照OMEGA Gel Extraction Kit的說明進(jìn)行回收DNA片斷，連接用TaKaRa的pMD18-T載體，根據(jù)連接時插入的基因和連接載體的摩爾比為3：1，計算插入基因片段和連接載體的用量，16℃溫浴16h。將連接產(chǎn)物5ul轉(zhuǎn)化50ul某公司的大腸桿菌感受態(tài)TOP10中，37℃倒置培養(yǎng)12-16h，挑取單克隆，用LB液體培養(yǎng)基(50mg/L Kan)搖菌、保存菌種，將單克隆培養(yǎng)出來的菌液送交到華大生物公司測序，鑒定陽性克隆。將包含陽性克隆的大腸桿菌菌種搖菌，用OMEGA Plasmid Mini Kit提取質(zhì)粒，用Fermentas公司的限制性內(nèi)切酶Bgl II和BstE II按照1:1的比例，在Fermentas公司的Buffer O的環(huán)境中酶切質(zhì)粒，同時用Fermentas公司的限制性內(nèi)切酶Bgl II和BstE II按照1:1的比例，在Fermentas公司的Buffer O的環(huán)境中酶切pCAMBIA3301質(zhì)粒,將酶切片段進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，按照OMEGA Gel Extraction Kit的說明進(jìn)行回收DNA片斷，連接用TaKaRa的T4連接酶和相對應(yīng)的T4連接10X Buffer，按插入DNA的目標(biāo)片段與載體的DNA片段摩爾比為3:1或1:1的比例建立連接體系，16℃溫浴16h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。將連接產(chǎn)物5ul轉(zhuǎn)化50ul某公司的大腸桿菌感受態(tài)TOP10中，37℃倒置培養(yǎng)12-16h，挑取單克隆，用LB液體培養(yǎng)基(50mg/L Kan)搖菌、保存菌種，用Fermentas公司的限制性內(nèi)切酶Bgl II和BstE II按照1:1的比例，在Fermentas公司的Buffer O的環(huán)境中雙酶切鑒定和PCR鑒定兩種方法陽性克隆。其克隆引物如下：GmRAV1正義引物：AGATCTATGGATGCAATTAGTTGCC；反義引物：GGTCACCCTACAAAGCACCAATAAT。制備農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞：從YEP平板(25mg/L Rif、50mg/L Str)上挑取新鮮的EHA105單菌落接種于含50mg/L Str和25mg/L Rif的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃，220rpm振蕩培養(yǎng)過夜24～36h，取2mL過夜活化的對數(shù)生長期的菌液，接種于50mL液體YEP中，繼續(xù)培養(yǎng)OD600至0.4～0.6左右，轉(zhuǎn)入冰預(yù)冷無菌離心管，冰浴30min，4℃，4000rpm離心10min，棄上清液，用10mL冰預(yù)冷0.05M CaCl₂懸浮菌體，冰浴30分鐘，4℃，4000rpm離心10min，棄上清液，用2mL冰預(yù)冷0.05M CaCl₂重懸菌體，將制備好的感受態(tài)細(xì)胞放置于冰上，24～48h內(nèi)使用轉(zhuǎn)化效率最高，也可按每管100μL分裝于無菌管中，加入甘油使終濃度為15％后置于-70℃保存。凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌：取2μL純化的質(zhì)粒DNA，加入到含有100μL根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，輕輕混勻，冰浴30min，于液氮中速凍2min，迅速置37℃水浴熱激5min，再迅速冰浴2min，加入500μL YEP無抗生素的液體培養(yǎng)基于28℃，100rpm輕輕振蕩培養(yǎng)3～5h復(fù)蘇，從該培養(yǎng)物中取50-200μL菌液均勻涂布在含有適當(dāng)抗生素的YEP固體培養(yǎng)基(50mg/L Str，25mg/L Rif和50mg/L Kan)表面，28℃倒置培養(yǎng)1～2d，挑取白色單菌落在含有適當(dāng)抗生素的YEP液體培養(yǎng)基(50mg/L Str，25mg/L Rif和50mg/L Kan)中培養(yǎng)，PCR鑒定陽性克隆。得到的農(nóng)桿菌pCAMBIA3301-GmRAV1(圖4)載體轉(zhuǎn)化子即可用于植物的轉(zhuǎn)化。

農(nóng)桿菌菌液制備：挑取含有pCAMBIA3301-GmRAV1重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落接種于含利福平50mg/L、鏈霉素25mg/L、卡納霉素50mg/L的5mL YEB液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm培養(yǎng)48h。吸取1ml菌液接種于50ml新鮮的上述YEB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，將菌液于5000rpm的離心機(jī)中離心15min，富集菌體后用等量的液體CCM培養(yǎng)基重懸。

大豆種子滅菌：氯氣滅菌法。選取飽滿無菌斑的種子，放入通風(fēng)廚的干燥器內(nèi)，在干燥器的小燒杯內(nèi)倒入96ml次氯酸鈉，快速加入4ml濃鹽酸后迅速蓋緊。大豆在其反映產(chǎn)生的氯氣中滅菌16h后置于超凈臺內(nèi)通風(fēng)30min，密封備用。

大豆種子萌發(fā)：將滅菌后的種子種臍向下種于萌發(fā)培養(yǎng)基(GM)中，每瓶種8-10粒，在23℃、16h光照/8h黑暗條件下萌發(fā)4-5天。

大豆子葉節(jié)的制備：取出無菌苗，選取萌發(fā)充分的植株，去掉種皮，于子葉下端5mm處將下胚軸切掉，沿下胚軸中線將兩片子夜切開，去除真葉，得到子葉節(jié)外植體。,用解剖刀在子葉與胚軸交接處直徑約3mm的范圍內(nèi)劃3-5刀。經(jīng)過此番操作,每棵無菌苗可得到2個用于轉(zhuǎn)化的子葉節(jié)外植體。

大豆侵染與共培養(yǎng)：將制備好的外植體放入侵染液中100rpm，震蕩培養(yǎng)30min后取出用無菌紙將外植體表面多余的侵染液吸干，倒置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3天。

大豆叢生芽的誘導(dǎo)及篩選：將暗培養(yǎng)完的子葉節(jié)外植體用清水與液體芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基各清洗3遍，用無菌紙將子葉節(jié)表面的液體吸干，以與培養(yǎng)基表面45度角斜插在恢復(fù)培養(yǎng)基上進(jìn)行芽誘導(dǎo)。將誘導(dǎo)7天的叢生芽轉(zhuǎn)移至含有8mg/LPPT的篩選培養(yǎng)基中，每7天繼代一次，篩選20天。

大豆砧木的準(zhǔn)備：提前5天將東農(nóng)50種于蛭石中，待其子葉微微展開真葉，選取真葉不超過子葉2/3的幼苗，用解剖刀將其真葉完全去掉然后沿莖軸線將下胚軸切出一條0.8mm-10mm的創(chuàng)口。

大豆接穗的準(zhǔn)備：經(jīng)過篩選的叢生芽，去掉周圍死去組織，垂直于叢生芽表面切下，將叢生芽切成上部為3-7mm，下部長約5-8mm具有完整維管束的楔子形。

大豆的嫁接：將接穗豎直放入砧木切口中，叢生芽面與子葉節(jié)齊平，用封口膜包好，栽移到塑料缽中。將嫁接好的植株放入一較深的盒中，外套保鮮膜，適當(dāng)密封，保持低溫高濕的生長環(huán)境，一周后待幼苗完全恢復(fù)可揭膜煉苗。

大豆轉(zhuǎn)化子的鑒定：將嫁接大豆收取的種子種植于土壤中，觀察其生長狀態(tài)與對照相比是否有差異，并采用小量法提取其新鮮葉片的DNA，根據(jù)重組質(zhì)粒的DNA序列，最后選取該重組質(zhì)粒上的35S啟動子序列和GmRAV1基因序列，設(shè)計特異性引物，以DNA為模板，按照EasyTaq DNA Polymerase說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下：正義引物：5'TATCCTTCGCAAGACCCTTCCTC 3'，反義引物：5'ACGACGAAGCCATAGTGGTTTGC3'，產(chǎn)物大小為740bp。

農(nóng)桿菌菌液制備：挑取含有pCAMBIA3301-GmRAV1重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落接種于含利福平50mg/L、鏈霉素25mg/L、卡納霉素50mg/L的5mL YEB液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm培養(yǎng)48h。吸取1ml菌液接種于50ml新鮮的上述YEB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，將菌液于5000rpm的離心機(jī)中離心10min，棄上清，沉淀懸浮于二分之一體積的滲透培養(yǎng)基(0.22％MS，5％蔗糖，0.02％silwet L-77)中。

擬南芥種子滅菌：10％NaClO滅菌法：選取飽滿的擬南芥種子4℃春化3d后，放于1.5EP管中，向其中加入10％的NaClO溶液，渦旋震蕩7-10min，使種子充分與溶液接觸，充分消毒，再用無菌水沖洗3～4次。

擬南芥種子萌發(fā)：將滅菌后的種子種于含2％蔗糖的萌發(fā)培養(yǎng)基(MS)中，每板種約100粒種子，在22℃、8h光照/16h黑暗條件下萌發(fā)7天。

擬南芥的移苗：將土與蛭石按照1:1混合后，裝盆，從下方澆水使其充分浸濕，將培養(yǎng)基中的苗移入其中，注意不要傷根。用保鮮膜包住擬南芥苗，放置在在22℃、16h光照/8h黑暗條件下生長7天，揭去保鮮膜。

擬南芥的侵染與轉(zhuǎn)化：花絮侵染法：將重懸的含有pCAMBIA3301-GmRAV1重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液倒在小瓷盤中。將培養(yǎng)擬南芥的缽體橫倒在瓷盤邊，將剛露白且未開放的花浸泡在懸浮液中浸泡30s。取出植株，橫放在塑料膜上，用保鮮膜蓋在上面以保持濕度，并在保鮮膜上再覆蓋一層不透光的紙。放在恒溫室暗培養(yǎng)24h。第二天揭開紙和保鮮膜，豎直培養(yǎng)。4～5d后，根據(jù)擬南芥的生長情況繼續(xù)浸染一到二次。培養(yǎng)3～4周，待種子成熟后，收取種子，干燥器中存放。

擬南芥轉(zhuǎn)化子的鑒定：將侵染后的擬南芥收取的種子4℃春化3d后種植于萌發(fā)培養(yǎng)基MS(5mg/L Kan)中，22℃±2℃光照培養(yǎng)7d-10d后，選取生長狀態(tài)良好，葉色濃綠的擬南芥，移于土中，22℃±2℃長日照光照培養(yǎng)，待其長大后，采用小量法提取其新鮮葉片的DNA，根據(jù)重組質(zhì)粒的DNA序列，最后選取該重組質(zhì)粒上的35S啟動子序列和GmRAV1基因序列，設(shè)計特異性引物，以DNA為模板，按照EasyTaq DNA Polymerase說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下：正義引物：5'TATCCTTCGCAAGACCCTTCCTC 3'，反義引物：5'ACGACGAAGCCATAGTGGTTTGC 3'，產(chǎn)物大小為740bp。選取部分轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行半定量RT-PCR分析，結(jié)果表明GmRAV1-ox株系中外源基因GmRAV1基因已經(jīng)整合到大豆基因組中，在轉(zhuǎn)錄水平上轉(zhuǎn)GmRAV1基因大豆與非轉(zhuǎn)基因大豆相比GmRAV1過量表達(dá)，信號非常強(qiáng)。

實施例4：植物RNAi表達(dá)載體pJawoh l8-GmRAV1的構(gòu)建和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié)

根據(jù)NCBI上公布的GmRAV1基因序列，選擇ORF內(nèi)的基因序列設(shè)計干涉目的片段，以GmRAV1基因的全長序列為模板，設(shè)計引物。根據(jù)Gateway技術(shù)說明書，擴(kuò)增333bp的特異性干涉片段，通過BP反應(yīng)，重組構(gòu)建入門載體(entry clone),然后入門載體再與RNAi表達(dá)載體pJawohl8通過LR反應(yīng)，得到含有目的基因的RNAi載體(destination vector)。PCR擴(kuò)增片段的條件為94℃5min；38個循環(huán)：94℃30s，55℃30s，72℃1min；72℃10min；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，按照OMEGA Gel Extraction Kit的說明進(jìn)行回收DNA片斷，根據(jù)Gateway技術(shù)說明書確定BP反應(yīng)體系，進(jìn)行BP反應(yīng)，取2μL BP反應(yīng)產(chǎn)物至一離心管中，置于冰上，小心向其中加入100μL感受態(tài)細(xì)胞，輕彈管底混勻，冰浴30min，42℃水浴熱激90s(不要搖動)，立即置于冰上2min，向離心管中加入200μL LB液，37℃，150rpm振蕩培養(yǎng)45min，置于冰上，分別取菌液涂布于含有Amp(100mg/L)的LB平板上，37℃正放1h待菌液完全被平板吸收后倒置過夜培養(yǎng)12h-16h，挑取白色單菌落，接種于5mL含有Amp(100mg/L)的LB液體培養(yǎng)基，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)12-16h，培養(yǎng)基明顯變渾濁后，取0.5mL菌液加入0.5mL無菌30％甘油至終濃度為15％，-80℃保存菌種。取2μL菌液做PCR擴(kuò)增，將有擴(kuò)增產(chǎn)物且片段大小正確的克隆進(jìn)行測序。取測序結(jié)果正確的陽性克隆菌液提取質(zhì)粒作為入門載體克隆，紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒的濃度和純度。以GmRAV-attB-Fi和GmRAV-attB-Ri為引物，經(jīng)過BP反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化菌液為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，.取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。根據(jù)Gateway技術(shù)說明書確定LR反應(yīng)體系，進(jìn)行LR反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物按照BP反應(yīng)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法轉(zhuǎn)化，將全部轉(zhuǎn)化細(xì)胞均勻涂布在含有50mg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12-16h后，挑取單菌落接種于含有50mg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，然后取2μL菌液做PCR擴(kuò)增，將有擴(kuò)增產(chǎn)物且片段大小正確的克隆進(jìn)行測序。并進(jìn)行菌液PCR檢測。將植物入門載體pDONR201-GmRAV質(zhì)粒用SmaI單酶切，植物表達(dá)載體pJawoh18-GmRAV質(zhì)粒(圖5)用HindIII單酶切，取6-10μL產(chǎn)物電泳檢測。檢測陽性克隆送交上海英駿公司測序。擴(kuò)增干涉片段的引物序列如下：正義引物：GmRAV-attB-Fi 5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACGCCGTCACCAACTTCA-3’，反義引物：GmRAV-attB-Ri

5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTGCTGCTTCGGTATCACTAA-3’。制備農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞：從YEP平板(50mg/L Str和25mg/L Rif)上挑取新鮮的EHA105單菌落接種于含50mg/L Str和25mg/L Rif的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃，220rpm振蕩培養(yǎng)過夜24～36h，取2mL過夜活化的對數(shù)生長期的菌液，接種于50mL液體YEP中，繼續(xù)培養(yǎng)OD600至0.4～0.6左右，轉(zhuǎn)入冰預(yù)冷無菌離心管，冰浴30min，4℃，4000rpm離心10min，棄上清液，用10mL冰預(yù)冷0.05M CaCl2懸浮菌體，冰浴30分鐘，4℃，4000rpm離心10min，棄上清液，用2mL冰預(yù)冷0.05M CaCl2重懸菌體，將制備好的感受態(tài)細(xì)胞放置于冰上，24～48h內(nèi)使用轉(zhuǎn)化效率最高，也可按每管100μL分裝于無菌管中，加入甘油使終濃度為15％后置于-70℃保存。凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌：取2μL純化的質(zhì)粒DNA，加入到含有100μL根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，輕輕混勻，冰浴30min，于液氮中速凍2min，迅速置37℃水浴熱激5min，再迅速冰浴2min，加入500μL YEP無抗生素的液體培養(yǎng)基于28℃，100rpm輕輕振蕩培養(yǎng)3～5h復(fù)蘇，從該培養(yǎng)物中取50-200μL菌液均勻涂布在含有適當(dāng)抗生素的YEP固體培養(yǎng)基(50mg/L Str，25mg/L Rif和100mg/L Amp)表面，28℃倒置培養(yǎng)1～2d，挑取白色單菌落在含有適當(dāng)抗生素的YEP液體培養(yǎng)基(50mg/L Str，25mg/L Rif和100mg/L Amp)中培養(yǎng)，PCR鑒定陽性克隆。得到的農(nóng)桿菌pJawoh18-GmRAV1載體轉(zhuǎn)化子即可用于植物的轉(zhuǎn)化。

農(nóng)桿菌菌液制備：:挑取含有pJawoh18-GmRAV1重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落接種于含利福平50mg/L、鏈霉素25mg/L、氨芐霉素100mg/L的5mL YEB液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm培養(yǎng)48h。吸取1ml菌液接種于50ml新鮮的上述YEB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，將菌液于5000rpm的離心機(jī)中離心15min，富集菌體后用等量的液體CCM培養(yǎng)基重懸。

大豆轉(zhuǎn)化方法具體見實施例3

大豆轉(zhuǎn)化子的鑒定：將嫁接大豆收取的種子種植于土壤中，觀察其生長狀態(tài)與對照相比是否有差異，并采用小量法提取其新鮮葉片的DNA，根據(jù)重組質(zhì)粒的DNA序列，設(shè)計特異性引物，以DNA為模板，按照EasyTaq DNA Polymerase說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下：Pat正義引物：5′-GCACCATCGTCAACCACTAC-3′，反義引物：5′-TGAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3′，產(chǎn)物大小為440bp。選取部分轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行半定量RT-PCR分析，結(jié)果表明GmRAV-i株系中外源基因GmRAV1已經(jīng)整合到大豆基因組中，在轉(zhuǎn)錄水平上RNAi轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因大豆相比GmRAV1表達(dá)受到抑制，信號非常弱。

實施例5：轉(zhuǎn)GmRAV1基因過量表達(dá)大豆及轉(zhuǎn)GmRAV-i干涉大豆的表型觀察和功能分析

蛭石與土1:1混合后，將轉(zhuǎn)GmRAV1基因過量表達(dá)大豆、轉(zhuǎn)GmRAV-i干涉大豆和對照大豆DN50種植于其中，16h光/8h暗，25℃條件下生長，觀察轉(zhuǎn)基因大豆與對照大豆相比，植株的株高，葉片顏色，節(jié)數(shù)，莢數(shù)，節(jié)間距和開花時間的差異(圖6)。

實施例6：轉(zhuǎn)GmRAV1基因擬南芥、突變體擬南芥rav、GmRAV1基因恢復(fù)擬南芥GmRAV1-ox rav T4代功能分析

1GmRAV1基因增強(qiáng)了細(xì)胞分裂素(2-ip)的效應(yīng)

種子的消毒與萌發(fā)：Columbia-0、rav、GmRAV1-ox、GmRAV1-ox rav 4種擬南芥種子于4℃春化3d后，用10％NaClO渦旋振蕩消毒6-8min后，用無菌水洗5次，種在含2％蔗糖的MS培養(yǎng)基上，每個平皿約種100粒，在22℃和16h光照/8h黑暗的光周期下垂直培養(yǎng)，等待發(fā)芽。

愈傷組織的培養(yǎng)：向含有B5的培養(yǎng)基中加入2.2μmol/L 2,4-D，0.2μmol/L KT，2％蔗糖，0.59g/L MES，0.8％瓊脂，pH5.5。將苗齡8d的4種擬南芥的根分別去掉頭部和尾部大約5mm的區(qū)域，將剩余部分切成大約5mm的段，接種于愈傷組織培養(yǎng)基中，每個平皿接入越40段外植體，每種擬南芥3次重復(fù)，在22℃和16h光照/8h黑暗的光周期下培養(yǎng)3d。

不定芽的誘導(dǎo)：3d后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有B5的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中添加不同濃度的2-ip(0、1、5、10μmol/L)，0.75μmol/L IAA，2％蔗糖，0.59g/L MES，0.8％瓊脂，pH5.6。每種擬南芥接種10個外植體于每個平皿中，4種擬南芥的外植體均同時接種于每個平皿中，每個處理5個重復(fù)，在22℃和16h光照/8h黑暗的光周期下培養(yǎng)，等待外植體的發(fā)芽，觀察其分化情況，確定最適2-ip濃度并統(tǒng)計在最適濃度下4種擬南芥的再生效率。當(dāng)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不含有2-ip時，愈傷組織不會分化生成芽組織，當(dāng)2-ip濃度為1μmol/L時有不定芽出現(xiàn)，當(dāng)2-ip濃度小于5μmol/L時，擬南芥WT的不定芽數(shù)隨著2-ip濃度的增加而增加，顏色逐漸加綠，當(dāng)2-ip濃度為5μmol/L時不定芽的誘導(dǎo)情況最好，當(dāng)2-ip濃度為10μmol/L時擬南芥WT不定芽生長情況呈下降趨勢，確定了5μmol/L的2-ip濃度為誘導(dǎo)不定芽發(fā)生的最適濃度。選取4種不同2-ip濃度進(jìn)行擬南芥的跟外植體不定芽再生實驗，觀察不定芽的再生圖9a，并統(tǒng)計其再生率(表1)。

表1向B₅培養(yǎng)基中外源施加不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA后3種大豆的再生率

2.GmRAV1基因增強(qiáng)了細(xì)胞分裂素(6-BA)的效應(yīng)

Columbia-0、rav、GmRAV1-ox、GmRAV1-ox rav 4種擬南芥種子于4℃春化3d后，用10％NaClO渦旋振蕩消毒6-8min后，用無菌水洗5次，種在含2％蔗糖的MS培養(yǎng)基上，每個平皿約種100粒，在22℃和16h光照/8h黑暗的光周期下垂直培養(yǎng)，等待發(fā)芽。發(fā)芽后將擬南芥移于含有0、0.5、1mg/L 6-BA的MS固體培養(yǎng)基上，22℃和16h光照/8h黑暗的光周期下垂直培養(yǎng)，6d后統(tǒng)計根長，并照相(圖10a和b)。在0.5mg/L和1.0mg/L的6-BA處理下，rav根抑制與對照相比均不顯著，RAV1ox根抑制與對照相比顯著，GmRAV1-ox rav根抑制與對照相比不顯著；說明突變體rav對6-BA抑制根伸長不敏感，進(jìn)而說明GmRAV1基因是6-BA抑制根伸長的正調(diào)節(jié)因子。

3.GmRAV1-ox基因?qū)Ρ碛筒怂貎?nèi)酯epiBL的效應(yīng)不敏感

Columbia-0、rav、GmRAV1-ox 3種擬南芥種子于4℃春化3d后，用10％NaClO渦旋振蕩消毒6-8min后，用無菌水洗5次，種在含2％蔗糖的MS培養(yǎng)基上，每個平皿約種100粒，在22℃和16h光照/8h黑暗的光周期下培養(yǎng)，等待發(fā)芽。將發(fā)芽后擬南芥移于含有0、5、10、50mmol/L epiBL的MS固體培養(yǎng)基上，一半放在22℃和16h光照/8h黑暗的光周期下垂直培養(yǎng)，另一半放在暗下生長，10d后統(tǒng)計下胚軸，并照相(圖12(a))。隨著epiBL濃度的適量增加，WT擬南芥的下胚軸伸長與不加BR相比更長，10mmol/L達(dá)到最適濃度，當(dāng)濃度再升高達(dá)到50mmol/L的時候擬南芥的伸長效果變差(圖12(b))。在10mmol/L的epiBL處理下，rav下胚軸促進(jìn)與對照相比顯著，GmRAV1-ox下胚軸促進(jìn)與對照相比不顯著；說明突變體rav對6-BA抑制根伸長敏感而過表達(dá)GmRAV1-ox則超不敏感。即可通過表達(dá)GmRAV1使植株的株型向矮小方向生長，通過抑制或干擾GmRAV1基因的表達(dá)，同時使用10mmol/L的表油菜素內(nèi)酯epiBL促進(jìn)植株的株型向高大方向生長。

實施例7：轉(zhuǎn)T2代GmRAV1基因大豆、轉(zhuǎn)GmRAV-i基因干涉大豆、DN50對照大豆的功能分析

1GmRAV1基因增強(qiáng)了細(xì)胞分裂素(6-BA)促進(jìn)再生的效應(yīng)

大豆種子滅菌，將滅菌后的種子種臍向下種于萌發(fā)培養(yǎng)基(GM)中，每瓶種8-10粒，在23℃、16h光照/8h黑暗條件下萌發(fā)4-5天。

大豆子葉節(jié)的制備：取出無菌苗，選取萌發(fā)充分的植株，去掉種皮，于子葉下端5mm處將下胚軸切掉，沿下胚軸中線將兩片子夜切開，去除真葉，得到子葉節(jié)外植體。,用解剖刀在子葉與胚軸交接處直徑約3mm的范圍內(nèi)劃3-5刀。經(jīng)過此番操作,每棵無菌苗可得到2個用于轉(zhuǎn)化的子葉節(jié)外植體。

不定芽的培養(yǎng)：切萌發(fā)7d后的大豆子葉節(jié)，將其直接轉(zhuǎn)至芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，進(jìn)行生芽培養(yǎng)，觀察其分化情況。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以B5為基本培養(yǎng)基，添加5種不同濃度的6-BA(0、0.0835、0.167、1.67、3.34mg·L^-1)，3％蔗糖，0.59g·L-1MES，8％瓊脂，pH 5.6。每個處理3次重復(fù)，每次重復(fù)接種10塊愈傷組織。取再生7-10天后的大豆愈傷組織，觀察其不定芽再生情況，并統(tǒng)計其再生效率(圖9(b)和表2)。

表2向MS培養(yǎng)基中外源施加不同濃度的細(xì)胞分裂素2-ip后4種擬南芥的再生率

2GmRAV1基因增強(qiáng)了細(xì)胞分裂素(6-BA)抑制根和下胚軸的效應(yīng)

種子的消毒與播種：選取飽滿無菌斑的種子，放入通風(fēng)廚的干燥器內(nèi)，在干燥器的小燒杯內(nèi)倒入96ml次氯酸鈉，快速加入4ml濃鹽酸后迅速蓋緊。大豆在其反映產(chǎn)生的氯氣中滅菌16h后置于超凈臺內(nèi)通風(fēng)30min，密封備用。將滅菌后的種子種臍向下種于萌發(fā)培養(yǎng)基(GM)中，每瓶種8-10粒，在23℃、16h光照/8h黑暗條件下萌發(fā)1-2天。

萌發(fā)大豆移至含有不同濃度6-BA培養(yǎng)基中：取出無菌苗，選取萌發(fā)充分的植株，轉(zhuǎn)移至含有不同濃度的6-BA的培養(yǎng)基上，觀察其生長情況。培養(yǎng)基以B5為基本培養(yǎng)基，添加3種不同濃度的6-BA(0、0.5、1.0mg·L-1)，3％蔗糖，0.59g·L-1MES，8％瓊脂，pH 5.6。每個處理3次重復(fù)，每次重復(fù)接種20顆大豆。

根和下胚軸生長情況的觀察：觀察生長7d后的大豆根和下胚軸生長情況，統(tǒng)計其下胚軸和根長(圖10(c),(d)和(e)。

實施例8：Real-time RT-PCR分析外源施加6-BA(100μmol 6-BA)和未施加6-BA(0μmol 6-BA)的DN42大豆中GmRAV1基因的表達(dá)規(guī)律

大豆DN42培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱25℃，250μmol m-2sec-1白光，長日照(16h/8h光/暗)(LD)條件下于蛭石中生長，待其第一個三出復(fù)葉全展時進(jìn)行處理，快速去除大豆根部的殘留蛭石，將一部分大豆的根放置在含有100μmol 6-BA的1/4MS水溶液中，另一部分大豆的根放置在不含有6-BA的1/4MS水溶液中，待轉(zhuǎn)移后的0、0.5、1、2、4、6、8、12、24、48h，同時對其葉片進(jìn)行取材，液氮速凍，-80℃保存，提取RNA，按照SYBR(R)ExScriptTM RT-PCR Kit的程序進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。GmRAV1擴(kuò)增片斷長度為144bp，大豆看家基因Actin4(AF049106)擴(kuò)增片斷長度為214bp，其引物如下：GmRAV1正義引物：GGTGTAGTGGCATAGTGGC，反義引物：TAAGAAGGGGAGAAGCTAGA；Actin4正義引物：GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT，反義引物：GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA。

Real-time RT-PCR分析外源施加6-BA(100μmol 6-BA)和未施加6-BA(0μmol 6-BA)的DN42大豆中GmRAV1基因的表達(dá)規(guī)律如圖11所示。

雖然本發(fā)明已以較佳的實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明精神和范圍內(nèi)，都可以做各種的改動與修飾，因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

序列表

<110> 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種與大豆光周期調(diào)控相關(guān)基因GmRAV1的應(yīng)用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1757

<212> DNA

<213> GmRAV1

<400> 1

tcacctcatc attaataaat tgtcccaact aagcatattt ccttttccac ttaggataat 60

attaaaataa cacatttact agggactgtt tccttctata tatattccct cctcaaacaa 120

cccctattcc cacccaaact catctatctt tgcttcccct tagtcaaaca aagtaacaca 180

ccatccatcc tctctctctt ctcttcttct gttctctagt ttcctgctct tgtttcttag 240

aatccgtacg gtctaatcaa cacaacaaaa tggatgcaat tagttgcctg gatgagagca 300

ccaccaccga gtcactctcc ataagtcagg cgaagccttc ttcgacgatt atgtcgtccg 360

agaaggcttc tccttccccg ccgccgccga acaggctgtg ccgcgtcggt agcggtgcta 420

gcgcagtcgt ggattccgac ggcggcggcg ggggtggcag caccgaggtg gagtcgcgga 480

agctcccctc gtccaagtat aagggcgtcg tgccccagcc caacggccgc tggggctcgc 540

agatttacga gaagcaccag cgcgtgtggc tgggaacgtt caacgaggaa gacgaggcgg 600

cgcgtgcgta cgacgtcgcc gtgcagcgat tccgcggcaa ggacgccgtc acaaacttca 660

agccgctctc cggcaccgac gacgacgacg gggaatcgga gtttctcaac tcgcattcga 720

aatccgagat cgtcgacatg ctgcgtaagc atacgtacaa tgacgagctg gaacaaagca 780

agcgcagccg cggcttcgta cgtcggcgcg gctccgccgc cggcgccgga aacggaaact 840

caatctccgg cgcgtgtgtt atgaaggcgc gtgagcagct attccagaag gccgttacgc 900

cgagcgacgt tgggaaactg aaccgtttgg tgataccgaa gcagcacgcg gagaagcact 960

ttcctttaca gagcgctgct aacggcgtta gcgcgacggc gacggcggcg aagggcgttt 1020

tgttgaactt cgaagacgtt ggagggaaag tgtggcggtt tcgttactcg tattggaaca 1080

gtagccagag ttacgtcttg accaaaggtt ggagccggtt cgttaaggag aagaatctga 1140

aagccggtga cacggtttgt tttcaacggt ccactggacc ggacaggcag ctttacatcg 1200

attggaagac gaggaatgtt gttaacgagg tcgcgttgtt cggaccggtt gtcgaaccga 1260

tccagatggt tcggctcttt ggtgttaaca ttttgaaact acccggttca gattctatcg 1320

ccaataacaa taatgcaagt gggtgctgca atggcaagag aagagaaatg gaactctttt 1380

cattagagtg tagcaagaaa cctaagatta ttggtgcttt gtagcgttac gttacttttt 1440

ttgagttttt tttttttttg agttttgtga ctgatgaaag aaagaaggta caagaagaac 1500

ggcggtgtag tggcatagtg gcatcgcaag ttgctgcaaa aggtgaattg tatattactt 1560

aatattagat gctgaaatat taggtgtaat gtaacaaaaa actgtacaag gagaagaaaa 1620

aaggttctaa gaaggggaga agctagaaga aaaaaaatga tgtcatcatg ggataactgt 1680

ttaattgtat atgttgataa tattgttgaa tgttgattat tatgttcacg gcatctgatg 1740

ttttttttct gtttttt 1757

<210> 2

<211> 384

<212> PRT

<213> GmRAV1編碼區(qū)蛋白

<400> 2

Met Asp Ala Ile Ser Cys Leu Asp Glu Ser Thr Thr Thr Glu Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ile Ser Gln Ala Lys Pro Ser Ser Thr Ile Met Ser Ser Glu Lys

20 25 30

Ala Ser Pro Ser Pro Pro Pro Pro Asn Arg Leu Cys Arg Val Gly Ser

35 40 45

Gly Ala Ser Ala Val Val Asp Ser Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser

50 55 60

Thr Glu Val Glu Ser Arg Lys Leu Pro Ser Ser Lys Tyr Lys Gly Val

65 70 75 80

Val Pro Gln Pro Asn Gly Arg Trp Gly Ser Gln Ile Tyr Glu Lys His

85 90 95

Gln Arg Val Trp Leu Gly Thr Phe Asn Glu Glu Asp Glu Ala Ala Arg

100 105 110

Ala Tyr Asp Val Ala Val Gln Arg Phe Arg Gly Lys Asp Ala Val Thr

115 120 125

Asn Phe Lys Pro Leu Ser Gly Thr Asp Asp Asp Asp Gly Glu Ser Glu

130 135 140

Phe Leu Asn Ser His Ser Lys Ser Glu Ile Val Asp Met Leu Arg Lys

145 150 155 160

His Thr Tyr Asn Asp Glu Leu Glu Gln Ser Lys Arg Ser Arg Gly Phe

165 170 175

Val Arg Arg Arg Gly Ser Ala Ala Gly Ala Gly Asn Gly Asn Ser Ile

180 185 190

Ser Gly Ala Cys Val Met Lys Ala Arg Glu Gln Leu Phe Gln Lys Ala

195 200 205

Val Thr Pro Ser Asp Val Gly Lys Leu Asn Arg Leu Val Ile Pro Lys

210 215 220

Gln His Ala Glu Lys His Phe Pro Leu Gln Ser Ala Ala Asn Gly Val

225 230 235 240

Ser Ala Thr Ala Thr Ala Ala Lys Gly Val Leu Leu Asn Phe Glu Asp

245 250 255

Val Gly Gly Lys Val Trp Arg Phe Arg Tyr Ser Tyr Trp Asn Ser Ser

260 265 270

Gln Ser Tyr Val Leu Thr Lys Gly Trp Ser Arg Phe Val Lys Glu Lys

275 280 285

Asn Leu Lys Ala Gly Asp Thr Val Cys Phe Gln Arg Ser Thr Gly Pro

290 295 300

Asp Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Trp Lys Thr Arg Asn Val Val Asn Glu

305 310 315 320

Val Ala Leu Phe Gly Pro Val Val Glu Pro Ile Gln Met Val Arg Leu

325 330 335

Phe Gly Val Asn Ile Leu Lys Leu Pro Gly Ser Asp Ser Ile Ala Asn

340 345 350

Asn Asn Asn Ala Ser Gly Cys Cys Asn Gly Lys Arg Arg Glu Met Glu

355 360 365

Leu Phe Ser Leu Glu Cys Ser Lys Lys Pro Lys Ile Ile Gly Ala Leu

370 375 380