新型澳洲堅果過敏原的制作方法
本發(fā)明涉及一種多肽，其包括選自包含下列蛋白質(zhì)的組的澳洲堅果蛋白：在ph6.3至8.7于2dsdspage中電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)和在ph6.5至7.9于2dsdspage中電泳的20至25kda的蛋白質(zhì)或其抗原變體，優(yōu)選在ph6.3至8.7電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)或其抗原變體。
對樹堅果的過敏反應可以是嚴重的和危及生命的。這適用于常見的品種，例如榛子，花生，核桃，也適用于澳洲堅果，其為澳大利亞常青樹(四葉澳洲堅果(macadamiatetraphylla)和澳洲堅果(m.integrifolia))的果實。
澳洲堅果(就植物學而言，其是種子)不像許多其它樹堅果一樣是常見的食物，但其越來越頻繁地被生吃或烘焙食用，并且常常被添加至各種食物例如小吃棒、谷物和混合堅果。碎澳洲堅果膳食正在成為烘焙食品中日益流行的成分，冷壓澳洲堅果油亦如此。絕非少數(shù)情況的是，澳洲堅果常?？捎米鲌怨旌衔锏囊徊糠?，并因此在先前不進口其的國家中銷售。
在敏化個體中因暴露于澳洲堅果而引起的過敏反應可包括嚴重的癥狀(pallares,d.e.(2000):allergytomacadamianut.annallergyasthmaimmunol2000；85(5):385-6)。因此，患有過敏的受試者知曉過敏原的來源是至關(guān)重要的，因為他們需要避免接觸含有任何過敏原或已接觸過任何過敏原的食品、化妝品和其它產(chǎn)品。
過敏可以使用常規(guī)皮膚點刺試驗來診斷，所述試驗涉及將懷疑患有過敏的受試者的皮膚暴露于潛在致敏性果實的提取物，并用合適的對照進行補充。然而，假陰性結(jié)果經(jīng)常發(fā)生，因為某些過敏原可能以不足夠低的濃度存在于這些提取物中(sicherer,s.h.,teuber,s.s.(2004):currentapproachtothediagnosisandmanagementofadversereactionstofoods.journalofallergyandclinicalimmunology2004；114.5,1146–50)。另外，特定的過敏原可以在提取物中進行蛋白水解(rancé,f.,juchet,a.,brémont,f.,dutau,g.(1997):correlationbetweenskinpricktestsusingcommercialextractsandfreshfoods,specificigeandfoodchallenges.allergy1997；52.10,1031–5)。此外，基于全提取物的測定由于交叉反應性而不夠特異。
因此，期望基于針對特異性過敏原的抗體例如ige或igg的檢測來設(shè)計測定。這樣的測定涉及將包含抗體的患者樣品暴露于固定化的過敏原，隨后進行檢測，任選地定量結(jié)合至固定化的過敏原的ige抗體(volcheck,g.w.(2009):clinicalallergy,diagnosisandmanagement)。
主要過敏原已在一系列堅果中被鑒定。例如，花生過敏的絕大多數(shù)病例與對儲存蛋白arah2、arah7和arah6的敏感性相關(guān)。因此，已經(jīng)設(shè)計了基于針對這些過敏原的ige抗體的檢測的合理可靠的測定(codreanu,f.,collignon,o.,roitel,o.,thouvenot,b.,sauvage,c.,vilain,a.c.,cousin,m.o.,decoster,a.,renaudin,j.m.,astier,c.,monnez,j.m.,vallois,p.,morisset,m.,moneret-vautrin,d.a.,brulliard,m.,ogier,v.,castelain,m.c.,kanny,g.,bihain,b.e.,jacquenet,s.(2011):anovelimmunoassayusingrecombinantallergenssimplifiespeanutallergydiagnosis.intarchallergyimmunol2011；154(3):216-26；ep15075033.9)。
相比之下，關(guān)于澳洲堅果過敏原的身份的信息非常少。迄今為止，描述用于診斷澳洲堅果過敏的免疫測定的現(xiàn)有技術(shù)文獻的作者必須依賴于全堅果提取物或部分純化的提取物。例如，ghorbani等人進行了基于檢測食品中殘留的澳洲堅果蛋白質(zhì)的免疫測定(ghorbani,m.,morgan,m.r.a.(2010):proteincharacterisationandimmunochemicalmeasurementsofresidualmacadamianutproteinsinfoodstuffs.foodagrimmunol2010；21:347-360)。
herbst等人使用來自引起患者顯示過敏癥狀的單一批次的澳洲堅果的全堅果提取物(herbst,r.a.,wahl,r.,frosch,p.j.(2010):specificigereactivityandidentificationofpotentialallergensinmacadamiaallergy.jeuracaddermatolvenereol2010；24(11):1361-3)。
sathe等人報道了從包括澳洲堅果的各種樹堅果制備的全提取物的溶解并將其用于western印跡中(sathe,s.k.,venkatachalam,m.,sharma,g.m.,kshirsagar,h.h.,teuber,s.s.,roux,k.h.(2009):solubilizationandelectrophoreticcharacterizationofselectediblenutseedproteins.jagricfoodchem2009；57(17):7846-56)。
在缺乏特異性過敏原的情況下，提供足夠可靠的診斷是不可行的。全堅果提取物或部分純化的提取物與類似于皮膚點刺試驗的缺點的限制(例如不穩(wěn)定性和不足的特異性，更具體地說是假陰性結(jié)果)有關(guān)。
因此，本發(fā)明涉及的問題是提供一種用于診斷過敏，優(yōu)選堅果過敏，更優(yōu)選澳洲堅果過敏的方法，以及用于這樣的方法的試劑，相較于現(xiàn)有技術(shù)測定，所述方法具有改善的診斷可靠性(特別是靈敏度)。
本發(fā)明涉及的另一個問題是提供用于鑒別診斷過敏，優(yōu)選堅果過敏例如樹堅果過敏的測定，更優(yōu)選用于區(qū)分對澳洲堅果的過敏與對非澳洲堅果的堅果的過敏的測定，和/或用于監(jiān)測患有這種過敏的個體的治療。
本發(fā)明涉及的另一個問題是提供可用于這樣的測定的試劑，用于制備這樣的試劑的方法和用于這樣的診斷的方法。本發(fā)明涉及的另一個問題是提供用于治療患有對澳洲堅果的過敏的患者的治療方法和藥物組合物。
本發(fā)明涉及的問題通過所附的獨立和從屬權(quán)利要求的主題來解決。
在第一方面，本發(fā)明涉及的問題通過一種多肽來解決，所述多肽包括選自包含下列蛋白質(zhì)的組的澳洲堅果蛋白：在ph6.3至8.7于2dsdspage中電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)和在ph6.5至7.9于2dsdspage中電泳的20至25kda的蛋白質(zhì)或其變體，優(yōu)選在ph6.3至8.7電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)或其變體。所述多肽是來自四葉澳洲堅果(macadamiatetraphylla)和澳洲堅果(m.integrifolia)優(yōu)選澳洲堅果的多肽。
在優(yōu)選的實施方案中，多肽是分離的和/或重組的多肽。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，多肽是融合多肽，其優(yōu)選包含用于檢測或純化的標簽。
在第二方面，該問題通過一種核酸來解決，所述核酸編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽，其優(yōu)選在載體中，更優(yōu)選在細胞中的載體中。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，多肽是固定化的。
在第三方面，該問題通過一種醫(yī)療器械來解決，所述醫(yī)療器械包含根據(jù)本發(fā)明的多肽，其中所述醫(yī)療器械優(yōu)選是診斷上有用的載體，更優(yōu)選選自包含珠子、測試條、微量滴定板、印跡的組，優(yōu)選選自包含蛋白質(zhì)印跡、線印跡和斑點印跡、玻璃表面、載玻片、生物芯片、膜、微陣列、電泳凝膠和微量滴定板的組。
在第四方面，該問題通過包括以下步驟的方法來解決：在樣品，優(yōu)選來自哺乳動物，更優(yōu)選來自人的樣品中檢測與根據(jù)本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體，所述方法優(yōu)選用于診斷堅果過敏，更優(yōu)選用于診斷澳洲堅果過敏。
在第五方面，該問題通過包括下列步驟的治療疾病的方法來解決：向受試者施用或使來自受試者的樣品接觸根據(jù)本發(fā)明的多肽，
其中所述疾病優(yōu)選是堅果過敏，更優(yōu)選是樹堅果過敏，最優(yōu)選是澳洲堅果過敏。
在第六方面，該問題通過一種抗體來解決，所述抗體結(jié)合選自包含下列蛋白質(zhì)的組的澳洲堅果蛋白：在ph6.3至8.7于2dsdspage中電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)和在ph6.5至7.9于2dsdspage中電泳的20至25kda的蛋白質(zhì)或其變體，
優(yōu)選在ph6.3至8.7電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)，
其中任選地所述抗體處于與所述澳洲堅果蛋白或其變體的復合物中。在優(yōu)選的實施方案中，結(jié)合澳洲堅果蛋白的抗體是分離的抗體。
在第七方面，該問題通過用于診斷疾病的測試試劑盒來解決，所述試劑盒包含根據(jù)本發(fā)明的多肽和任選地用于檢測包含所述多肽和根據(jù)本發(fā)明的抗體的復合物的工具。
在第八方面，該問題通過用于分離抗體的方法來解決，所述抗體結(jié)合選自包含下列蛋白質(zhì)的組的澳洲堅果蛋白：在ph6.3至8.7于2dsdspage中電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)和在ph6.5至7.9于2dsdspage中電泳的20至25kda的蛋白質(zhì)或其抗原性片段，所述方法包括下列步驟：
a)在適于形成復合物的條件下，使包含所述抗體的樣品與澳洲堅果蛋白或其變體接觸，
b)分離在步驟a)中形成的復合物，
c)解離在步驟b)中分離的復合物，和
d)使澳洲堅果蛋白與所述抗體分離。
在第九方面，該問題通過一種藥物組合物或疫苗來解決，所述藥物組合物或疫苗包含根據(jù)本發(fā)明的多肽，任選地另外包含藥學上可接受的載物。
在優(yōu)選的實施方案中，所述樣品是包含抗體的體液，所述體液優(yōu)選選自包含全血、血清、腦脊液和唾液的組，更優(yōu)選為全血。
在優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是ige或igg，例如igg4，優(yōu)選ige抗體。
在第十面，該問題通過根據(jù)本發(fā)明的多肽用于診斷過敏，優(yōu)選堅果過敏，更優(yōu)選樹堅果過敏，最優(yōu)選澳洲堅果過敏的用途來解決。
本發(fā)明基于本發(fā)明人的令人驚訝的發(fā)現(xiàn)：在澳洲堅果中存在一系列特異性過敏原，其顯示針對來自患有堅果過敏的患者的血清的反應性，并且可用于診斷和治療堅果過敏，特別是澳洲堅果過敏。此外，這些過敏原可用于區(qū)分堅果過敏，特別是區(qū)分對澳洲堅果的過敏與對非澳洲堅果的堅果的過敏。就發(fā)明人所知，這些抗原在本領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)中還沒有被描述。
在優(yōu)選的實施方案中，本文所用的術(shù)語“樹堅果”是選自包含以下的組的堅果：澳洲堅果，榛子，花生，核桃，杏仁，美洲山核桃，腰果，巴西堅果，栗子，松子，開心果，mongongoyeheb堅果，石栗和智利榛子。
本發(fā)明涉及診斷上有用的載體，優(yōu)選為固相載體，用于使特異性捕獲抗體的工具(所述工具與所述載體締合)與來自受試者，優(yōu)選哺乳動物受試者，更優(yōu)選人受試者的體液樣品接觸。載體可以直接與樣品接觸，并且允許用于特異性捕獲抗體的工具暴露于樣品中的任何抗體。在優(yōu)選的實施方案中，固相載體是診斷裝置，更優(yōu)選選自包含珠子、測試條、微量滴定板、印跡的組，優(yōu)選選自包含蛋白質(zhì)印跡、線印跡和斑點印跡、玻璃表面、載玻片、生物芯片、膜、微陣列、電泳凝膠和微量滴定板的組。
在最優(yōu)選的實施方案中，診斷上有用的載體是線印跡(raoult,d.,anddasch,g.a.(1989),thelineblot:animmunoassayformonoclonalandotherantibodies.itsapplicationtotheserotypingofgram-negativebacteria.j.immunol.methods,125(1-2),57-65；wo2013041540)。在優(yōu)選的實施方案中，本文所用的術(shù)語“線印跡”是指已用一種或多種用于捕獲抗體的工具(優(yōu)選各自為多肽)包被的測試條，更優(yōu)選是基于膜的。如果使用兩種或更多種工具，則它們優(yōu)選在載體上是在空間上分離的。優(yōu)選地，帶的寬度為測試條的寬度的至少30％，更優(yōu)選地40％，50％，60％，70％或80％。測試條可以包含一個或多個對照帶，用于確認其已在適當?shù)臈l件下，特別是在存在人血清、抗體綴合物或兩者的情況下，與樣品接觸足夠長的時間。許多線印跡可商購獲得，例如獲自euroimmunag,lübeck,germany。
必要的是，用于實施本發(fā)明的樣品包含抗體，也稱為免疫球蛋白。通常，樣品是包含受試者的全部免疫球蛋白的代表性集合的體液。然而，在提供樣品后，樣品可以經(jīng)歷進一步的處理，這可包括分級分離、離心、富集或分離受試者的全部免疫球蛋白或任何免疫球蛋白類別，優(yōu)選ige和/或igg4，這可影響各種類型的免疫球蛋白的相對分布。樣品可以選自全血、血清、腦脊液和唾液，優(yōu)選血清。在最優(yōu)選的實施方案中，樣品包含ige類抗體。
必要的是，診斷上有用的載體包含用于特異性捕獲針對在ph6.3至8.7于2dsdspage中電泳的53至67kda的澳洲堅果蛋白或在ph6.5至7.9于2dsdspage中電泳的20至25kda的澳洲堅果蛋白(優(yōu)選在ph6.3至8.7電泳的53至67kda的澳洲堅果蛋白)的抗體的工具，所述澳洲堅果蛋白已被本發(fā)明人鑒定為澳洲堅果豌豆球蛋白樣蛋白(macadamiavicilin-likeprotein)(多肽的數(shù)據(jù)庫登錄碼：q9spl3；編碼所述蛋白質(zhì)的核酸的數(shù)據(jù)庫登錄碼：af161885)。本申請通篇中提及的任何數(shù)據(jù)庫代碼是指在本申請的優(yōu)先權(quán)日時可通過ncbi數(shù)據(jù)庫在線獲得的多肽序列。
優(yōu)選地，用于特異性捕獲這樣的抗體的這樣的工具是一種多肽，其包括選自包含下列蛋白質(zhì)的組的澳洲堅果蛋白：在ph6.3至8.7于2dsdspage中電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)或在ph6.5至7.9于2dsdspage中電泳的20至25kda的蛋白質(zhì)或其變體，優(yōu)選在ph6.3至8.7電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)或其變體。
根據(jù)本發(fā)明，載體包括用于特異性捕獲抗體的一種或多種工具，優(yōu)選一種或多種，更優(yōu)選兩種或更多種，更優(yōu)選三種或更多種，更優(yōu)選四種或更多種這樣的工具，它們中的每一種能夠特異性捕獲不同的抗體。除了用于捕獲澳洲堅果蛋白(優(yōu)選澳洲堅果豌豆球蛋白樣蛋白(q9spl3))的工具以外，所述載體還可包括用于捕獲針對一種或多于一種來自包含下列蛋白質(zhì)的組的蛋白質(zhì)的抗體的工具：seqidno3(來自榛子的cora11),seqidno4(來自芝麻(sesam)的sesi3),seqidno5(來自花生的arah1),seqidno6(來自開心果的pisv3),seqidno7(來自腰果的anao1),seqidno8(來自美洲山核桃的cari2),seqidno9(來自核桃的jugr2)；例如用于捕獲針對seqidno3的抗體的工具和用于捕獲針對seqidno4的抗體的工具。所述工具優(yōu)選固定在所述載體上。在優(yōu)選的實施方案中，用于特異性捕獲抗體的工具是與待捕獲的抗體結(jié)合的多肽或其變體，例如根據(jù)本發(fā)明的多肽或seqidno3(來自榛子的cora11),seqidno4(來自芝麻的sesi3),seqidno5(來自花生的arah1),seqidno6(來自開心果的pisv3),seqidno7(來自腰果的anao1),seqidno8(來自美洲山核桃的cari2),seqidno9(來自核桃的jugr2)，例如用于捕獲針對seqidno3的抗體的工具和用于捕獲針對seqidno4的抗體的工具。所述工具與其附著至的不溶性載體一起可以以直接方式例如通過過濾、離心或傾析從反應混合物中分離。所述工具可以以可逆或不可逆的方式固定。例如，如果分子經(jīng)由可以通過加入高濃度的鹽掩蔽的離子相互作用與載體相互作用，或者如果分子通過可切割的共價鍵結(jié)合，則固定是可逆的。相比之下，如果分子通過不能在水溶液中裂解的共價鍵連接到載體上，則固定是不可逆的。所述工具(優(yōu)選多肽)可以是間接固定的，例如通過固定對多肽具有親和力的抗體或其它實體，然后加入多肽并形成多肽-抗體復合物。
然而，本發(fā)明的教導不僅可以使用具有本申請中明確或隱含提及(例如通過功能、名稱、序列或登錄號)的精確序列的多肽或野生型序列來執(zhí)行，還可以使用這樣的多肽的變體來執(zhí)行。
在優(yōu)選的實施方案中，如本文所用的術(shù)語“變體”可以指所提及的全長序列的至少一個片段，更具體地，相對于全長序列而言在一個或兩個末端上截短一個或多個氨基酸的氨基酸或核酸序列。這樣的片段包含或編碼具有原始序列的至少10、15、25、50、75、100、150、200、300、400或500個連續(xù)氨基酸的肽或其變體。變體的總長度可以是25、30、40、50、60、70、80、90、100個或更多個氨基酸。優(yōu)選的片段是seqidno：1或其變體。
變體可以與所提及的參考氨基酸序列或其片段具有至少40、50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99％的同一性，其中除了對生物活性必需的那些氨基酸之外的氨基酸被缺失或取代和/或一個或多個這樣的必需氨基酸以保守方式被替換和/或氨基酸被添加或缺失以使得多肽的生物活性至少被部分保留?，F(xiàn)有技術(shù)包括可用于比對兩個給定的核酸或氨基酸序列和計算同一性程度的各種方法，參見例如arthurlesk(2008),introductiontobioinformatics,oxforduniversitypress,2008，第三版。在優(yōu)選的實施方案中，使用clustalw軟件(larkin,m.a.,blackshields,g.,brown,n.p.,chenna,r.,mcgettigan,p.a.,mcwilliam,h.,valentin,f.,wallace,i.m.,wilm,a.,lopez,r.,thompson,j.d.,gibson,t.j.,higgins,d.g.(2007):clustalwandclustalxversion2.0.bioinformatics,23,2947-2948)，應用默認設(shè)置。
在優(yōu)選的實施方案中，變體可以另外包含化學修飾，例如同位素標記或共價修飾，例如糖基化，磷酸化，乙?；?，脫羧基化，瓜氨酸化，羥基化等。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于修飾多肽的方法。此外，還可以通過與其它已知多肽或其變體融合來產(chǎn)生變體。
必要的是，多肽的變體具有生物活性。在優(yōu)選的實施方案中，這樣的生物活性是結(jié)合來自患者，優(yōu)選患有過敏，更優(yōu)選對堅果的過敏，最優(yōu)選對澳洲堅果的過敏的患者的過敏特異性ige抗體的能力。在另一個優(yōu)選的實施方案中，這樣的生物活性是在對堅果，優(yōu)選樹堅果，更優(yōu)選澳洲堅果過敏的受試者中引發(fā)過敏反應的能力。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過從原始澳洲堅果蛋白質(zhì)開始，引入修飾點突變、截短等來設(shè)計變體，隨后通過測試所述變體是否結(jié)合獲自對澳洲堅果過敏的受試者的樣品中的抗體來確認該變體仍然具有生物活性。
變體可以使用遺傳工程方法或化學合成法制備。
可以通過蛋白質(zhì)印跡，使用來自對澳洲堅果過敏的患者的血清(優(yōu)選如實施例中所述的)作為抗體來源來確定結(jié)合活性。
根據(jù)本發(fā)明的多肽或其變體可以是融合蛋白，即任選通過接頭與其它序列融合(優(yōu)選在n末端或c末端上)的多肽。該其它序列可以是用于檢測的標簽，例如flag標簽，或用于純化的標簽，例如選自包含gst、his或mbp標簽的組。根據(jù)本發(fā)明的示例性融合多肽顯示于seqidno：2中。
根據(jù)本發(fā)明的多肽可以以任何形式和以任何純化程度提供，從以內(nèi)源形式包含所述多肽的組織、果實或細胞、更優(yōu)選過表達所述多肽的細胞、這樣的細胞的粗制或富集的裂解物到純化和/或分離的多肽(其基本上是純的)。在優(yōu)選的實施方案中，多肽是天然多肽，其中本文所用的術(shù)語“天然多肽”是指折疊的多肽，更優(yōu)選從組織或細胞，更優(yōu)選從哺乳動物細胞或組織，任選地從非重組組織或細胞純化的折疊多肽。如果使用天然多肽，與其天然狀態(tài)相比，優(yōu)選是富集的。
根據(jù)本發(fā)明，多肽可以是重組蛋白，其中本文使用的術(shù)語“重組”是指在生產(chǎn)過程的任何階段使用遺傳工程方法產(chǎn)生的多肽，例如通過融合編碼多肽的核酸至用于在細胞或組織中過表達的強啟動子或通過工程改造多肽本身的序列和/或使用用于通過遺傳工程修飾的細胞的表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于工程改造核酸和編碼的多肽的方法(例如，在sambrook,j.,fritsch,e.f.andmaniatis,t.(1989),molecularcloning,csh或brownt.a.(1986),genecloning–anintroduction,chapman&hall中描述的)以及用于產(chǎn)生和純化天然或重組多肽的方法(例如由gehealthcarelifesciences出版的handbooks“strategiesforproteinpurification”,“antibodypurification”，以及在burgess,r.r.,deutscher,m.p.(2009):guidetoproteinpurification中描述的)。
在優(yōu)選的實施方案中，術(shù)語“分離的”意指多肽相對于在整個堅果或從整個堅果獲得的全堅果提取物中的全部澳洲堅果蛋白，優(yōu)選澳洲堅果過敏原，已被富集。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，多肽是分離的多肽，其中術(shù)語“分離的”意指該多肽相較于其在使用生物技術(shù)或合成方法產(chǎn)生后的狀態(tài)已被富集并且優(yōu)選是純的，即所使用的多肽的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％由所述多肽組成，如通過sds聚丙烯酰胺凝膠電泳隨后考馬斯藍染色和目視檢查所判斷的。
根據(jù)本發(fā)明的受試者是產(chǎn)生抗體，優(yōu)選ige類別或等同的過敏相關(guān)抗體，更優(yōu)選來自哺乳動物，最優(yōu)選人的抗體的動物，包括人。
根據(jù)本發(fā)明的方法考慮了在樣品中檢測與根據(jù)本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體，所述方法優(yōu)選用于診斷堅果過敏，更優(yōu)選用于診斷澳洲堅果過敏。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉可用于檢測樣品中的抗體的各種方法，例如選自包括免疫擴散技術(shù)、通過ige抗體的嗜堿性粒細胞活化、免疫電泳技術(shù)、光散射免疫測定、凝集技術(shù)、標記的免疫測定例如放射性標記的免疫測定、酶免疫測定例如比色測定、化學發(fā)光免疫測定和免疫熒光技術(shù)的組。
在許多情況下，檢測樣品中的抗體的不存在或存在(任選地意指確定抗體的濃度是否超過某些閾值，常常通過檢測限度顯示)足以用于診斷。如果可以檢測抗體，則這將是對臨床醫(yī)生的診斷有用的信息，并且表明患者患有過敏的可能性增加。在優(yōu)選的實施方案中，可以測定血清中的抗體相對于可能在平均健康受試者中發(fā)現(xiàn)的水平的相對濃度。在優(yōu)選的實施方案中，如本文所使用的術(shù)語“檢測存在或不存在”意指足以核查是否可以使用合適的復合物檢測方法檢測足夠超過任何背景水平的信號，所述復合物檢測方法指示目標抗體存在或存在比在健康受試者中所存在的更多的目標抗體。在更優(yōu)選的實施方案中，這可以包括確定濃度是否超過對照中的濃度或超過閾值，優(yōu)選至少0.1，優(yōu)選0.2、0.5、1、2、5、10、20、25、50、100，200、500、1000、10000或100000倍高于在平均健康受試者中發(fā)現(xiàn)的目標抗體的濃度。
簡言之，檢測抗體可以包括步驟a)在適于形成復合物的條件下，使包含抗體的樣品與根據(jù)本發(fā)明的多肽或其變體接觸。這可以通過使液體樣品與固定化形式(例如被固定在膜上，例如在蛋白質(zhì)印跡或線印跡中所使用的)的多肽接觸來實現(xiàn)。當樣品和多肽接觸時，樣品中存在的能夠特異性結(jié)合多肽的任何抗體將進行這樣的結(jié)合達到使包含多肽和抗體的復合物存在的效果。
隨后，進行步驟b)，其包括分離在步驟a)中形成的所述復合物，例如通過除去樣品和任選地使用洗滌緩沖液洗滌被固定的多肽來進行分離。
最后的步驟c)包括檢測復合物，例如通過添加可結(jié)合來自樣品的抗體的第二抗體來檢測。第二抗體可以包含標記，例如酶或放射性同位素。或者，可以使用方法諸如化學交聯(lián)隨后sdspage或使用質(zhì)譜法來直接檢測復合物。
針對根據(jù)本發(fā)明的多肽的抗體的檢測表明，供給樣品的受試者對澳洲堅果過敏。在受試者表現(xiàn)出過敏反應，但這樣的樣品不含有針對本發(fā)明受試者的抗體的情況下，受試者可能患有過敏，例如堅果過敏，但對澳洲堅果不過敏。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是診斷上有用的載體，其包含用于特異性捕獲針對本發(fā)明多肽的抗體的工具。在優(yōu)選的實施方案中，如本文所用的術(shù)語“特異性捕獲抗體”是指特異性結(jié)合目標抗體達到從樣品中結(jié)合和去除其而其它抗體基本上不結(jié)合并保留在樣品中的效果的能力。
根據(jù)本發(fā)明，提供了用于特異性檢測捕獲的抗體的工具，任選地作為試劑盒的一部分。在優(yōu)選的實施方案中，如本文所使用的術(shù)語“特異性檢測捕獲的抗體”意指在捕獲后檢測到特異性結(jié)合至特異性捕獲抗體(其結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的多肽)的工具的抗體，而不是樣品中存在的任何其它抗體。在優(yōu)選的實施方案中，如本文所用的術(shù)語“特異性結(jié)合”意指該結(jié)合比其特征在于下述解離常數(shù)的結(jié)合反應更強：1×10-5m，更優(yōu)選1×10-7m，更優(yōu)選1×10-8m，更優(yōu)選1×10-9m，更優(yōu)選1×10-10m，更優(yōu)選1×10-11m，更優(yōu)選1×10-12m，如通過表面等振子體共振使用biacore設(shè)備在25℃下在ph7的pbs緩沖液中測定的。
本發(fā)明的教導內(nèi)容提供了試劑盒，其優(yōu)選用于診斷過敏，更優(yōu)選用于診斷澳洲堅果過敏。這樣的試劑盒是包含實施本發(fā)明方法所需的特定試劑(特別是根據(jù)本發(fā)明的診斷上有用的載體，任選地除了實施本發(fā)明方法所需的一種或多種溶液之外，該溶液優(yōu)選選自或全部選自包括樣品稀釋緩沖液、洗滌緩沖液和包含用于檢測任何特異性捕獲的抗體例如第二抗體的工具和任選地用于檢測后者的工具的緩沖液的組)的容器。此外，其可以包括詳述如何使用試劑盒和本發(fā)明的用于使本發(fā)明的多肽與來自受試者優(yōu)選人受試者的體液樣品接觸的診斷上有用的載體(例如線印跡，其中將用于特異性捕獲抗體至根據(jù)本發(fā)明的多肽的工具固定在線印跡上)的說明書。此外，試劑盒可以包含陽性對照，例如已知結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的多肽的重組抗體，和陰性對照，例如對根據(jù)本發(fā)明的多肽沒有可檢測的親和力的蛋白質(zhì)。最后，這樣的試劑盒可以包含含有用于制備校準曲線的抗體的標準溶液。
根據(jù)本發(fā)明，需要用于檢測一種或多種捕獲的抗體的工具。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道可以使用的許多方法，所述方法也被描述在現(xiàn)有技術(shù)中，例如在zane,h.d.(2001),immunology–theoretical&practicalconceptsinlaboratorymedicine,w.b.saunderscompany中，特別是在第14章中描述的。在優(yōu)選的實施方案中，使用結(jié)合一種或多種捕獲的抗體(其是相應的第一抗體)的恒定區(qū)的第二抗體，所述第二抗體可以與直接檢測例如熒光、放射性或酶活性標記(后者可以催化化學發(fā)光反應或可使用比色法或光譜或其它分析方法檢測的分子的產(chǎn)生)的標記相關(guān)聯(lián)。
或者，生物功能測定可用作檢測一種或多種捕獲的抗體的工具，條件是抗體是ige類抗體，優(yōu)選基于通過ige抗體的嗜堿性粒細胞活化的測定。這樣的測定法已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中描述，例如hausmann,o.v.,gentinetta,t.,bridts,c.h.,andebo,e.g.(2009):thebasophilactivationtestinimmediate-typedrugallergy,immunol.allergyclin.n.am.29,555-566。
在優(yōu)選的實施方案中，如本文所使用的術(shù)語“診斷”是指旨在獲得在評估患者是否患有或可能或比平均或比較受試者(后者優(yōu)選地具有相似的癥狀)更可能在診斷時或在未來患有某種疾病或病癥的過程中有用的信息以發(fā)現(xiàn)疾病如何進展或在未來可能進展或評估患者對于某種治療(例如施用合適的藥物，例如用于使過敏患者脫敏的藥物)的反應性的任何種類的程序。換句話說，術(shù)語“診斷”不僅包括診斷，而且包括預測和/或監(jiān)測疾病或病癥的過程或治療的成功。優(yōu)選檢測igg(更優(yōu)選igg4)類別的自身抗體用于監(jiān)測疾病的進展和/或治療的成功。
因此，術(shù)語“診斷”優(yōu)選地不意味著根據(jù)本發(fā)明的診斷方法或試劑將是結(jié)論性的并且足以基于單一測試(更不用說參數(shù))來完成診斷，而是可以指對被稱為“鑒別診斷”(即基于一系列診斷參數(shù)考慮一系列可能條件的可能性的系統(tǒng)診斷程序)的貢獻。術(shù)語“診斷”還可以指用于為患者選擇最有希望的治療方案的方法或試劑。換句話說，所述方法或藥劑可涉及選擇用于受試者的治療方案。
本發(fā)明提供了包含根據(jù)本發(fā)明的多肽的藥物組合物，優(yōu)選疫苗，所述組合物優(yōu)選適于施用至受試者，優(yōu)選哺乳動物受試者，更優(yōu)選施用至人。這樣的藥物組合物可以包含藥學上可接受的載體。藥物組合物可以例如經(jīng)口、腸胃外、通過吸入噴霧、局部地、通過滴眼劑、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)口腔、經(jīng)陰道或經(jīng)由植入的儲庫施用，其中本文所用的術(shù)語“腸胃外”包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。藥物組合物可以以合適的劑型提供，例如膠囊、片劑和水性懸浮液和溶液，優(yōu)選為無菌形式。其可用于治療疾病優(yōu)選過敏的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的本發(fā)明的多肽。可以使用根據(jù)本發(fā)明的多肽的低過敏原性變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于產(chǎn)生已知過敏原的低過敏原性變體的方法。
本發(fā)明提供了用于通過向受試者施用本發(fā)明的藥物組合物治療、預防或改善過敏，優(yōu)選堅果過敏，更優(yōu)選澳洲堅果過敏的方法。
通過以下附圖和非限制性序列和實施例進一步說明本發(fā)明，從中可以獲得本發(fā)明的其它特征、實施方案、方面和優(yōu)點。
附圖描述
圖1顯示了澳洲堅果提取物的2d凝膠電泳分離的結(jié)果。在ph3-10非線性ipg條上在第一維中分離，隨后在還原條件下通過sdspage分離蛋白質(zhì)，通過考馬斯染色進行染色并從凝膠中切出。數(shù)字標記隨后進行maldi-tof分析的點。箭頭標記代表后續(xù)被鑒定為澳洲堅果豌豆球蛋白樣蛋白的蛋白質(zhì)的條帶。
圖2顯示了澳洲堅果提取物的蛋白質(zhì)印跡分析和通過2d凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果。分子量標記與圖1所示相同。
圖3顯示了使用涂覆有來自澳洲堅果的豌豆球蛋白樣蛋白的euroline品系測定法對來自澳洲堅果致敏患者(n＝20)和健康獻血者(n＝17)的人血清的分析?；趀ast參考系統(tǒng)進行來自人血清的結(jié)合抗體的評價。
圖4a至4g顯示了比較數(shù)據(jù)，其指示如使用線印跡測定的來自所述患者的血清中以east類別形式表達的ige濃度。這些圖顯示了針對來自非澳洲堅果的樹堅果的一種樹堅果或核7s豌豆球蛋白樣蛋白的ige與針對來自澳洲堅果的maci豌豆球蛋白的ige之間的相關(guān)性(如果有的話)。
本申請包括多個氨基酸序列，更具體地，包括：
seqidno1(優(yōu)選澳洲堅果豌豆球蛋白樣蛋白(q9spl3)的片段)
seqidno2(包含澳洲堅果豌豆球蛋白樣蛋白的融合蛋白)
seqidno3(來自榛子的cora11),
seqidno4(來自芝麻的sesi3),
seqidno5(來自花生的arah1),
seqidno6(來自開心果的pisv3)
seqidno7(來自腰果的anao1)
seqidno8(來自美洲山核桃的cari2)
seqidno9(來自核桃的jugr2)
seqidno10(來自澳洲堅果的maci豌豆球蛋白)
通過以下非限制性實施例進一步說明本發(fā)明，從中可以獲得本發(fā)明的其它特征、實施方案、方面和優(yōu)點。
實施例：
實施例1：
澳洲堅果提取物的制備
將烘焙和鹽腌的市售澳洲堅果仁研磨，然后用丙酮脫脂3次。將脫脂的堅果碎片在折疊的過濾器上干燥。將干燥的材料重懸于緩沖液例如磷酸緩沖鹽水(pbs，50mm磷酸鈉，150mmnacl,ph7.4)中，在孵育振蕩器中在4℃孵育3小時，隨后過濾并在臺式離心機中在4℃以4000rpm離心30分鐘。
使用100％硫酸銨沉淀上清液，并將所得沉淀針對pbs透析。如生產(chǎn)商的說明書中所述，通過bio-rad蛋白測定(bio-radlaboratories,inc.,hercules,usa)進行蛋白濃度的估計。
制備凝膠電泳
將粗制的澳洲堅果提取物用冷的丙酮沉淀，并且在-20℃孵育2小時且在4℃以20000xg離心30分鐘后，將沉淀物重懸在樣品緩沖液中用于等電聚焦(2.5％磺基甜菜堿3-10，4m尿素，2m硫脲，0.5％(v/v)載體兩性電解質(zhì)(carrierampholyte)ph3-10、40mmdtt和0.003％溴酚藍)。在室溫下用樣品再次水化ipg條(readystripipg條7cmph3至10(bio-rad)，固定的ph梯度)過夜。
隨后，使用proteani12ief系統(tǒng)(bio-rad)聚焦蛋白質(zhì)，并且通過用于在凝膠上產(chǎn)生純蛋白點的聚丙烯酰胺凝膠電泳(4至12％bis-tris蛋白質(zhì)凝膠，1.0mmx2d孔，thermofisherscientific)，基于其表觀分子量在第二維進行分離。對于2d凝膠中的點的尺寸估計，如制造商的說明書中所述使用spectramulticolorbroadrange(thermofisherscientific)進行估計。
通過blue-銀染色(candiano等人,electrophoresis.2004may；25(9):1327-33.bluesilver:averysensitivecolloidalcoomassieg-250stainingforproteomeanalysis)對所得2d凝膠的蛋白質(zhì)進行染色。染色的凝膠如圖1所示。
蛋白質(zhì)印跡
如制造商的說明書中所述，將堅果提取物的2d凝膠通過te22miniblotter(hoeferinc.，holliston，ma，usa)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。通過用ponceaus染色檢測轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)。將所得蛋白質(zhì)印跡在洗滌緩沖液(euroimmunag,lübeck,germany)中孵育15分鐘，隨后用在洗滌緩沖液中1:10稀釋的來自澳洲堅果致敏的患者的血清孵育1小時。
在用洗滌緩沖液(產(chǎn)品號zd1100，由euroimmunag提供用于euroline線印跡，lübeck，germany)洗滌3次，每次5分鐘后，將膜與抗ige-ap綴合物(euroimmunag,lübeck,germany)孵育并再次用洗滌緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。如制造商的說明書中推薦的，通過與bcip/nbt底物(euroimmunag,lübeck,germany)孵育來檢測結(jié)合的抗體。
獲得的印跡示于圖2中。主要的目標蛋白質(zhì)包括在ph6.3至8.7于2dsdspage中電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)和在ph6.5至7.9于2dsdspage中電泳的20至25kda的蛋白質(zhì)。
maldi
切下用blue銀染色染色的2d凝膠的選定點并用胰蛋白酶消化。如制造商的說明書中所述，使用maldi-tof/tofautoflexiii(brukercorporation,billerica,ma,usa)進行肽質(zhì)量指紋分析(pmf)和msms。就方便的序列篩選針對綠色植物的ncbi數(shù)據(jù)庫，導致作為在ph6.3至8.7電泳的53至67kda的蛋白質(zhì)的澳洲堅果豌豆球蛋白樣蛋白(數(shù)據(jù)庫登錄碼：q9spl3)的鑒定。
澳洲堅果豌豆球蛋白樣蛋白的克隆、重組表達和純化
通過基因合成(eurofinsgenomicsgmbh)生成澳洲堅果豌豆球蛋白樣蛋白的編碼區(qū)，更具體地等同于如seqidno：2所示的通過接頭與his標簽融合的af161885中的核苷酸序列的編碼dna，通過聚合酶鏈反應擴增并使用
線印跡(euroline)的制備
通過使用精密分配器(可從zetacorporation商購獲得)將融合蛋白涂覆在硝酸纖維素膜(可從schleicher&schüll商購獲得)上來產(chǎn)生euroline線印跡。根據(jù)制造商的說明書的推薦封閉和洗滌后，將膜切成3mm的條。
使用euroline線測定法評價樣品
根據(jù)制造商(euroimmunag,lübeck,germany)說明書的推薦孵育euroline條。具體來說，在室溫下，用1ml在洗滌緩沖液中1/11(v/v)稀釋的患者樣品(20個澳洲堅果致敏的患者和17個健康血液供體)孵育所述條16小時。棄去患者樣品后，將所述條洗滌3次，每次用每條1ml洗滌緩沖液洗滌5分鐘，隨后用1ml與ap綴合的抗人ige抗體孵育1小時。然后，將所述條再次用洗滌緩沖液洗滌5次，然后用bcip/nbt底物孵育10分鐘。
通過掃描儀和
表1：east類別
實施例2：
來自榛子(seqidno3)、芝麻(seqidno4)、花生(seqidno5)、開心果(seqidno6)、腰果(seqidno7)、美洲山核桃(seqidno8)、核桃(seqidno9)和澳大利亞堅果(seqidno10)的豌豆球蛋白樣蛋白根據(jù)標準方法表達為his標簽融合蛋白，并如實施例1所述純化。
制備線印跡，將其與患者樣品接觸，并如ep15001277的實施例2和3中所述進行評價。測試了來自對樹堅果過敏的29個患者和9個健康獻血者的血清。
測試來自健康獻血者的對照血清，并且發(fā)現(xiàn)其均為陰性(east類別0)。
圖4a至4g顯示了比較數(shù)據(jù)，其指示如使用線印跡測定的來自所述患者的血清中以east類別形式表達的ige濃度。這些圖顯示了針對來自非澳洲堅果的樹堅果的一種樹堅果或核7s豌豆球蛋白樣蛋白的ige與針對來自澳洲堅果的maci豌豆球蛋白的ige之間的相關(guān)性(如果有的話)。
例如，圖4g顯示，對于maci豌豆球蛋白，一個患者顯示出east類別1ige反應，幾個患者顯示east類別2ige反應，并且一個患者顯示east類別5ige反應，但是對于anao1(腰果)沒有反應，如通過他們在對應于anao1的0east類別的那一排中所顯示的情況所指示的。
這些結(jié)果顯示，在每個比較實驗中，顯著數(shù)量的過敏性患者(圖4a至4g中的暗視野)對maci豌豆球蛋白反應，但不對來自另一樹堅果的相應豌豆球蛋白樣蛋白反應，更具體地，該數(shù)量為29個患者中的13個(cora11相比于maci)，29個患者中的9個(sesi3)，29個患者中的10個(jugr2)，29個患者中的9個(pisv3)，29個患者中的8個(cari2)，29個患者中的4個(arah1)和29個患者中的4個(anao1)。這些患者之一不能通過檢測針對來自其它樹堅果的豌豆球蛋白而非maci豌豆球蛋白的ige類別抗體來診斷，因為其血清中的ige抗體僅對maci豌豆球蛋白反應。
maci豌豆球蛋白與來自其它堅果和核的7s豌豆球蛋白樣蛋白沒有east類別相關(guān)性。一些患者對maci豌豆球蛋白的反應比對各自的其它樹堅果過敏原的反應強得多，表明各患者主要對澳洲堅果過敏而不是對另一種樹堅果過敏。例如，圖4a顯示4名患者具有對maci豌豆球蛋白的6(強反應)的east類別，但對于cora11沒有或僅有輕微反應(east類別0或1)。這表明，maci豌豆球蛋白具有不與任何其它豌豆球蛋白共有的獨特的ige表位。
序列表
<110>euroimmunmedizinischelabordiagnostikaag
<120>新型澳洲堅果過敏原
<130>15pp017ep2
<160>10
<170>patentinversion3.5
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<211>177
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列
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