本發(fā)明涉及一種昆蟲病原線蟲共生菌及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大豆疫霉根腐病，又稱大豆疫病，是由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)引起世界大豆生產(chǎn)上最為嚴(yán)重的病害之一。自于1948年于美國首次發(fā)現(xiàn)以來，其危害面積大，毀滅性強(qiáng)的特點(diǎn)，使其在世界大豆主產(chǎn)區(qū)均呈現(xiàn)擴(kuò)大蔓延趨勢(shì)。中國是栽培大豆的起源國，具有五千年的栽培歷史，其糧菜兼做的特點(diǎn)，使其在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及社會(huì)經(jīng)濟(jì)生活中地位顯著。東北作為全國大豆主產(chǎn)區(qū)，于1989年最早發(fā)現(xiàn)大豆疫霉菌，隨后在全國其他省份也陸續(xù)有發(fā)現(xiàn)大豆疫霉菌的報(bào)道。研究表明，其環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，種群變化速度快的特點(diǎn)，是其能夠大面積發(fā)生且難于用藥劑防治的主要原因。目前，該病已經(jīng)在我國造成了巨大產(chǎn)量損失，嚴(yán)重威脅著我國大豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
昆蟲病原線蟲共生菌是存在于昆蟲病原線蟲腸道內(nèi)的一類革蘭氏陰性細(xì)菌，屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，包括致病桿菌屬(XeNorhabdus)、光桿狀菌屬(Photorhabdus)和沙氏菌屬(Serratia)，其分別與斯氏線蟲屬(Steinernema)、異小桿線蟲屬(Heterorhabditis)及擬異小桿線蟲屬(Heterorhabditidoides)的線蟲共生。在自然界，此類細(xì)菌存在于3齡侵染期線蟲的腸道內(nèi)，隨著線蟲的侵染，而被攜帶到寄主體內(nèi)并釋放到血腔中，經(jīng)大量繁殖，產(chǎn)生毒素，在48之內(nèi)就能殺死寄主。研究表明，昆蟲病原線蟲共生菌在離體人工培養(yǎng)時(shí)，也能夠產(chǎn)生多種物質(zhì)。隨著對(duì)昆蟲病原線蟲共生菌研究的不斷深入，這些產(chǎn)物的功能亦不斷被發(fā)現(xiàn)，如對(duì)多種動(dòng)植物加人類病原菌有廣泛的抑菌活性等。目前，昆蟲病原線蟲共生菌已成為一類新型的具有開發(fā)潛力和應(yīng)用前景的能夠殺蟲防病的生物資源。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了提供一種具有抑制大豆疫霉根腐病的昆蟲病原線蟲共生菌及應(yīng)用。
本發(fā)明的一種具有抑制大豆疫霉根腐病的昆蟲病原線蟲共生菌，它為致病桿菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2016年4月11日，保藏號(hào)CGMCC No.12352。
它用于防治大豆疫霉根腐病。
本發(fā)明具有抑制大豆疫霉根腐病的昆蟲病原線蟲共生菌為革蘭氏陰性菌，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上為乳黃色菌落，圓形，微凸，邊緣不整齊，隨著時(shí)間延長顏色加深；在NBTA培養(yǎng)基上，初生型可吸收溴麝香百里酚藍(lán)(BTB)，形成藍(lán)色菌落，次生型不能吸收呈紫色菌落。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》方法進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果表明：昆蟲病原線蟲共生菌不能還原硝酸鹽，過氧化氫酶、氧化酶陰性，淀粉水解、吲哚實(shí)驗(yàn)陰性，葡萄糖、纖維二糖、麥芽糖、甘油等產(chǎn)酸為陽性，蔗糖、蜜二糖、D-核糖等為陰性。
本發(fā)明具有抑制大豆疫霉根腐病的昆蟲病原線蟲共生菌可在NBTA培養(yǎng)基上生長，生長溫度為28℃，最適pH為7.2～7.4，轉(zhuǎn)速180r/min。NBTA培養(yǎng)基由牛肉膏5g、蛋白胨10g、營養(yǎng)瓊脂20g、氯化鈉5g、溴麝香百里酚藍(lán)(BTB)0.025g、氯化三苯基四氮唑(TCC)0.04g和蒸餾水1000mL組成。
本發(fā)明具有抑制大豆疫霉根腐病的昆蟲病原線蟲共生菌通過16S rDNA序列比對(duì)分析，與致病桿菌屬有極高的同源性，同源性為99％以上。通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結(jié)果確定昆蟲病原線蟲共生菌屬于致病桿菌屬(XeNorhabdus)，為致病桿菌XeNorhabdus budapestensis。
平板抑菌實(shí)驗(yàn)表明，在固體培養(yǎng)培養(yǎng)條件下，本發(fā)明致病桿菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02具有較強(qiáng)的抑制大豆疫霉根腐病菌菌絲生長的能力，隨著體積濃度的增加而增大，持效期長，抑菌效果顯著。
附圖說明
圖1為致病桿菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02無菌體發(fā)酵液在CA培養(yǎng)基上對(duì)大豆疫霉菌產(chǎn)生抑菌帶照片；其中，A為產(chǎn)生抑菌帶第1天的照片，B為和產(chǎn)生抑菌帶第7天的照片。
具體實(shí)施方式
具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式的一種具有抑制大豆疫霉根腐病的昆蟲病原線蟲共生菌，它為致病桿菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2016年4月11日，保藏號(hào)CGMCC No.12352。
本實(shí)施方式的致病桿菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02是按照如下方式獲取的：
利用大臘螟誘集法從采自哈爾濱市的土樣中分離出昆蟲病原線蟲；按下列方法分離初生型共生細(xì)菌：
用分離得到的昆蟲病原線蟲感染大臘螟5齡幼蟲，蟲體死亡后，用體積百分含量為75％的酒精浸泡3s后，用質(zhì)量百分含量為1％的NaClO溶液擦拭蟲體表面，并用滅菌濾紙吸干蟲體上的水分；用滅菌剪子剪掉大臘螟前足，將從傷口流出的血淋巴涂布于NBTA培養(yǎng)基上，置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天，挑取藍(lán)色單菌落為初生型共生單菌落并接種于NA培養(yǎng)液(由牛肉膏5g、蛋白胨10g和蒸餾水1000mL組成)中，于28℃下180r/min振蕩培養(yǎng)24h后，按體積比1％轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)液中振蕩發(fā)酵36-48h后，離心管中冷凍離心，取上清液，以獲得無菌體發(fā)酵液。
所篩選的具有抑制大豆疫霉根腐病的昆蟲病原線蟲共生菌為革蘭氏陰性菌，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上為乳黃色菌落，圓形，微凸，邊緣不整齊，隨著時(shí)間延長顏色加深；在NBTA培養(yǎng)基上，初生型可吸收溴麝香百里酚藍(lán)(BTB)，形成藍(lán)色菌落，次生型不能吸收呈紫色菌落。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》方法進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果表明：昆蟲病原線蟲共生菌不能還原硝酸鹽，過氧化氫酶、氧化酶陰性，淀粉水解、吲哚實(shí)驗(yàn)陰性，葡萄糖、纖維二糖、麥芽糖、甘油等產(chǎn)酸為陽性，蔗糖、蜜二糖、D-核糖等為陰性。
對(duì)分離篩選得到的致病桿菌進(jìn)行分子鑒定，按以下步驟進(jìn)行：提取菌株的總DNA，根據(jù)共生菌16S rDNA設(shè)計(jì)引物，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后利用膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，之后，進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化，測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank中的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，同源性達(dá)到99％以上。通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結(jié)果確定昆蟲病原線蟲共生菌HEB02屬于致病桿菌屬(XeNorhabdus)，為致病桿菌XeNorhabdus budapestensis。
具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式的一種具有抑制大豆疫霉根腐病的昆蟲病原線蟲共生菌，它用于防治大豆疫霉根腐病。
具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二不同的是：它是采用昆蟲病原線蟲共生菌的菌液防治大豆疫霉根腐病。其它與具體實(shí)施方式二相同。
具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二或三不同的是：所述的具有抑制大豆疫霉根腐病的昆蟲病原線蟲共生菌的菌液制備方法是按照以下步驟進(jìn)行的：
將致病桿菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02接種于液體培養(yǎng)基中，在28℃，180r/min的條件下，振蕩發(fā)酵培養(yǎng)36～48h，倒入離心管中冷凍離心后，取上清液，獲到無菌體發(fā)酵液。
其它與具體實(shí)施方式二或三相同。
具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式四不同的是：所述的液體培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)液；1L的NA培養(yǎng)液是由5g的牛肉膏、10g的蛋白胨以及1000mL蒸餾水組成。
其它與具體實(shí)施方式四相同。
本發(fā)明內(nèi)容不僅限于上述各實(shí)施方式的內(nèi)容，其中一個(gè)或幾個(gè)具體實(shí)施方式的組合同樣也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。
通過以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果：
應(yīng)用梯度稀釋法測(cè)定無菌體發(fā)酵液對(duì)大豆疫霉根腐病的拮抗作用。
具體步驟為：
1.前期準(zhǔn)備：將本實(shí)驗(yàn)室保存的大豆疫霉菌，接種于胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(CA)上置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)至菌絲剛剛長滿培養(yǎng)皿時(shí)，備用。
2.胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(CA)的制備：將200g新鮮胡蘿卜加少量蒸餾水用組織搗碎機(jī)搗碎，去掉殘?jiān)?，再在汁液中加?8～20g瓊脂煮沸熔化，加蒸餾水補(bǔ)至1000mL，分裝，121℃高壓滅菌，備用。
3.拮抗作用測(cè)定：在無菌條件下，用內(nèi)徑為5mm的打孔器在CA培養(yǎng)基上打孔，孔內(nèi)加入無菌體發(fā)酵液60μL，在距該孔4cm處接種大豆疫霉菌菌塊。以加入無菌水為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，當(dāng)對(duì)照菌落長至?xí)r，測(cè)量抑菌帶寬度。
4.結(jié)果分析：經(jīng)測(cè)定致病桿菌HEB02的無菌體發(fā)酵液對(duì)大豆疫霉菌具有明顯抑制作用，從產(chǎn)生抑菌帶第1天起，至7天后菌絲繞過發(fā)酵液接菌孔，拮抗菌周圍平均產(chǎn)生了6mm寬的抑菌帶，靠近拮抗菌一側(cè)的大豆疫霉菌菌絲停止生長。
對(duì)大豆疫霉根腐病的拮抗作用結(jié)果如圖1所示，由圖1可以得出致病桿菌HEB02的無菌體發(fā)酵液對(duì)大豆疫霉菌具有明顯拮抗作用，且持效期較長，能夠很好的抑制靠近拮抗菌一側(cè)的大豆疫霉菌菌絲生長。