本發(fā)明是基于申請(qǐng)日為2012年9月28日，申請(qǐng)?zhí)枮椤?01280059185.2”(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮閜ct/us2012/057839)，發(fā)明名稱為“治療肽”的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

優(yōu)先權(quán)聲明

本申請(qǐng)要求獲得于2011年9月30日遞交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/541,921的利益，在此援引并入其全部?jī)?nèi)容。

政府支持

本發(fā)明在政府支持下進(jìn)行，基金號(hào)為no.po1ai045757，由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院資助。政府對(duì)本發(fā)明享有某些權(quán)利。

序列表

本申請(qǐng)包括一個(gè)序列表，其通過(guò)efs-web以ascii格式提交，在此援引并入其全部?jī)?nèi)容。所述ascii拷貝于2012年9月27日生成，名稱為53293wo1.txt，大小為90,411字節(jié)。

本發(fā)明涉及與人類受試者相關(guān)的治療組合物(例如肽)。

背景

暴露于病癥或疾病的人類受試者為具有治療潛力的抗體提供了來(lái)源，而且用于獲得這些抗體的一般方法是本領(lǐng)域已知的。然而，特異性獲得具有治療潛力的抗體的方法一般受到表達(dá)這些抗體的b細(xì)胞的出現(xiàn)頻率低、增殖速度慢、和抗體分泌水平低的限制。例如，具有限定特異性的記憶b細(xì)胞通常在每百萬(wàn)外周血細(xì)胞或大約每毫升血液中僅有1個(gè)細(xì)胞(lanzavecchiaetal.,curr.opin.immunol.,21:298-304(2009):yoshidaetal.,immunol.rev.,因此有必要開(kāi)發(fā)新方法以便能夠以高靈敏度和高效率分離這些細(xì)胞。

傳統(tǒng)的方法一般依賴通過(guò)體外培養(yǎng)將記憶b細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榭贵w分泌細(xì)胞和/或使用被免疫動(dòng)物模型(例如小鼠)(crottyetal.,j.immunol.,171:4969-4973(2003):fecteauetal.,immunology,128:e353-e365(2009):buismanetal.,vaccine,28:179-186(2009):cortietal.,plosone,5:e8805(2010))。例如，在體外培養(yǎng)達(dá)1周之后，可以使用酶聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)(elispot)測(cè)定在培養(yǎng)物上清中測(cè)量到抗體，并評(píng)估抗體分泌細(xì)胞的頻率。這類方法的不足之處已有報(bào)道(hennetal.,j.immunol.,183:31777-3187(2009):caoetal.,j.immunol.,methods,358:56-65(2010))。例如，體外培養(yǎng)的記憶b細(xì)胞會(huì)改變記憶b細(xì)胞的表型，使之類似于具有截然不同的功能性質(zhì)的漿細(xì)胞(jiangetal.,eur.j.immunol.,37:2205-2213(2007):hugginsetal.,blood,109:1611-1619(2007):jourdanetal.,blood,114:5173-5181(2009))?；跓晒饪乖姆椒ǖ牟蛔阒幰灿袌?bào)道(hoferetal.,immunol.rev.,211:295-302(2006):odendahletal.,blood,105:1614-1621(2005)；kunkeletal.,nat.rev.immunol.,3:822-829(2003):scheidetal.,nature,458:636-640(2009):wuetal.,science,329:856-861(2010))。

需要有改進(jìn)的方法，用于特異性地獲得或靶定具有治療潛力的抗體。

mica是nkg2d的一種配體，nkg2d是在大多數(shù)人nk細(xì)胞、γδt細(xì)胞和cd8+t細(xì)胞上表達(dá)的c型凝集素樣ii型跨膜受體(c-typelectin-like,typeiitransmembranereceptor)。配體一旦偶聯(lián)，nkg2d通過(guò)銜接蛋白(adaptorprotein)dap10傳遞信號(hào)，引發(fā)穿孔素依賴的細(xì)胞裂解，并提供共刺激(co-stimulation)。在人體內(nèi)，nkg2d配體包括mhci類鏈相關(guān)蛋白a(mica)、緊密近緣的micb、ul-16結(jié)合蛋白(ulbp)1-4和rae-1g。盡管nkg2d配體在健康組織中不經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，但是各種形式的細(xì)胞應(yīng)激，包括dna損傷，可上調(diào)配體表達(dá)，導(dǎo)致它們?cè)诙喾N惡性實(shí)體瘤和血液惡性病(包括黑素瘤)中經(jīng)常被檢測(cè)到。用抗-nkg2d封閉抗體處理的nkg2d缺陷型和野生型小鼠會(huì)顯示更高的腫瘤易感性，可見(jiàn)nkg2d通過(guò)配體陽(yáng)性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的激活促進(jìn)外部的腫瘤抑制。然而在患者體內(nèi)，由于nkg2d配體從腫瘤細(xì)胞脫落(shed)，觸發(fā)表面nkg2d的內(nèi)化和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的功能障礙，可能實(shí)現(xiàn)免疫逃逸?？扇苄詎kg2d配體還可以刺激調(diào)節(jié)性nkg2d+cd4+foxp3-t細(xì)胞的擴(kuò)增，這些細(xì)胞可以通過(guò)fas配體、il-10和tgf-β拮抗抗腫瘤細(xì)胞毒作用。mica是一種從腫瘤細(xì)胞脫落的配體，從腫瘤細(xì)胞脫落即從細(xì)胞表面釋放到周圍介質(zhì)中；來(lái)自癌癥患者的血清中通常含有升高水平的可溶形式(smica)。mica脫落可以部分地通過(guò)與蛋白二硫鍵異構(gòu)酶erp5相互作用實(shí)現(xiàn)，其與關(guān)鍵的半胱氨酸形成一個(gè)二硫鍵，導(dǎo)致α3結(jié)構(gòu)域去折疊，使之容易被adam-10/17和mmp14蛋白水解。

血管發(fā)生是從預(yù)先存在的血管形成新毛細(xì)管的過(guò)程，已被提示是腫瘤生長(zhǎng)和播散的關(guān)鍵部分。腫瘤刺激血管新生，以滿足依靠單純擴(kuò)散所難以滿足的不斷增加的氧氣和營(yíng)養(yǎng)需要。結(jié)果，腫瘤招募、重構(gòu)和擴(kuò)展現(xiàn)有的血管，以滿足其代謝需求。生長(zhǎng)中的腫瘤對(duì)新血管形成的依賴性，使得血管發(fā)生成為抗癌療法的一個(gè)引人注意的靶標(biāo)。許多細(xì)胞因子，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)家族成員和促血管發(fā)生素，被認(rèn)為在調(diào)節(jié)血管發(fā)生中發(fā)揮作用。促血管發(fā)生素是作為ties的配體發(fā)現(xiàn)的，ties是一個(gè)在血管內(nèi)皮中選擇性表達(dá)的酪氨酸激酶家族。已知有四種促血管發(fā)生素：促血管發(fā)生素-1(“ang-1”)至促血管發(fā)生素-4(“ang-4”)。研究提示，促血管發(fā)生素(例如ang-1和ang-2)可能參與腫瘤血管發(fā)生。根據(jù)這個(gè)信息，促血管發(fā)生素已經(jīng)被鑒定作為基于免疫的癌癥療法的潛在靶標(biāo)。

有需要鑒定，其能夠特異性識(shí)別并結(jié)合基于免疫的癌癥療法的靶標(biāo)，例如mica和促血管發(fā)生素的新的作用劑。這些作用劑可用于診斷篩選和治療干預(yù)與腫瘤發(fā)生相關(guān)的疾病狀態(tài)。

概要

本公開(kāi)提供了與具有治療潛力的抗體相關(guān)的組合物和方法。

在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供組合物，其包含與mhci類多肽相關(guān)序列a(mica)或其上的表位免疫特異性結(jié)合的肽。在一些方面中，該組合物的肽包含具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換的表1所示的抗體id1、6、7、8或9的vh的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)，和具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換的表1所示的抗體id1、6、7、8或9的vl的cdr3。在一些方面中，這些肽包含表1所示的抗體id1、6、7、8或9的vh的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)3，和表1所示的抗體id1、6、7、8或9的vl的cdr3。在一些方面中，這些肽進(jìn)一步包含具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換的表1所示的抗體id1、6、7、8或9的vh的cdr2，或具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換的表1所示的抗體id1、6、7、8或9的vl的cdr2，或者包含上述兩者。在一些方面中，這些肽包含表1所示的抗體id1、6、7、8或9的vh的cdr2，或表1所示的抗體id1、6、7、8或9的vl的cdr2，或者包含上述兩者。在一些方面中，這些肽進(jìn)一步包含具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換的表1所示的抗體id1、6、7、8或9的vh的cdr1，或具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換的表1所示的抗體id1、6、7、8或9的vl的cdr1，或者包含上述兩者。在一些方面中，這些肽包含表1所示的抗體id1、6、7、8或9的vh的cdr1，或表1所示的抗體id1、6、7、8或9的vl的cdr1，或者包含上述兩者。

在一些方面中，肽是抗體或抗體片段，包含：與seqidno:2具有同一性的vh鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2、和cdr3的區(qū)域包含具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換的表1所示的抗體id1的vh的cdr1、cdr2、和cdr3，并且seqidno:2中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id1的vh的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列；和與seqidno:11具有同一性的vl鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2、和cdr3的區(qū)域包含具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換的表1所示的抗體id1的vl的cdr1、cdr2、和cdr3，并且seqidno:11中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id1的vl的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列。在一些方面中，肽包括抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含一個(gè)含有seqidno:2的vh鏈和包含seqidno:11的vl鏈。在一些方面中，除了肽之外，組合物還包含一種或多種(例如12、3、4、5、6、7、8、9、10或少于20種)抗癌治療劑。在一些方面中，組合物被配制成藥物組合物(例如用于施用給受試者)。

在一些方面中，肽是抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：與seqidno:149具有同一性的vh鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2、和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id6的vh的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:149中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id6的vh的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列；和與seqidno:151具有同一性的vl鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2、和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id6的vl的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:151中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id6的vl的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列。在一些方面中，肽包括抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：包含seqidno:149的vh鏈和包含seqidno:151的vl鏈。在一些方面中，除了肽之外，組合物進(jìn)一步包含一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或少于20種)抗癌治療劑。在一些方面中，組合物被配制成藥物組合物(例如用于施用給受試者)。

在一些方面中，肽是抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：與seqidno:168具有同一性的vh鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id7的vh的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:168中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id7的vh的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列；和與seqidno:170具有同一性的vl鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id7的vl的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:170中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id7的vl的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列。在一些方面中，肽包括抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：包含seqidno:168的vh鏈和包含seqidno:170的vl鏈。在一些方面中，除了肽之外，組合物進(jìn)一步包含一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或少于20種)抗癌治療劑。在一些方面中，組合物被配制成藥物組合物(例如用于施用給受試者)。

在一些方面中，肽是抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：與seqidno:186具有同一性的vh鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id8的vh的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:186中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id8的vh的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列；和與seqidno:188具有同一性的vl鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id7的vl的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:188中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id8的vl的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列。在一些方面中，肽包括抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：包含seqidno:186的vh鏈和包含seqidno:188的vl鏈。在一些方面中，除了肽之外，組合物進(jìn)一步包含一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或少于20種)抗癌治療劑。在一些方面中，組合物被配制成藥物組合物(例如用于施用給受試者)。

在一些方面中，肽是抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：與seqidno:204具有同一性的vh鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id9的vh的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:204中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id9的vh的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列；和與seqidno:206具有同一性的vl鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id9的vl的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:206中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id9的vl的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列。在一些方面中，肽包括抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：包含seqidno:204的vh鏈和包含seqidno:206的vl鏈。在一些方面中，除了肽之外，組合物進(jìn)一步包含一種或多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或少于20種)抗癌治療劑。在一些方面中，組合物被配制成藥物組合物(例如用于施用給受試者)。

在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供組合物，其包含一種或多種與促血管發(fā)生素或其上的表位結(jié)合的肽。在一些方面中，所述組合物的肽包含具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換的表1所示的抗體id2、3、4、5或10的vh的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)3，和表1所示的抗體id2、3、4、5或10的vl的cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換。在一些方面中，肽可以包含表1所示的抗體id2、3、4、5或10的vh的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)3，和表1所示的抗體id2、3、4、5或10的vl的cdr3。在一些方面中，肽可以進(jìn)一步包含具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換的表1所示的抗體id2、3、4、5或10的vh的cdr2，或具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換的表1所示的抗體id2、3、4、5或10的vl的cdr2，或者包含上述兩者。在一些方面中，這些肽可以包含表1所示的抗體id2、3、4、5或10的vh的cdr2，或表1所示的抗體id2、3、4、5或10的vl的cdr2，或者包含上述兩者。在一些方面中，肽可以進(jìn)一步包含具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換的表1所示的抗體id2、3、4、5或10的vh的cdr1，或具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換的表1所示的抗體id2、3、4、5或10的vl的cdr1，或者包含上述兩者。在一些方面中，這些肽可以包含表1所示的抗體id2、3、4、5或10的vh的cdr1，或表1所示的抗體id2、3、4、5或10的vl的cdr1，或者包含上述兩者。

在一些方面中，肽包括抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：與seqidno:20具有同一性的vh鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id2的vh的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:20中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id2的vh的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列；和與seqidno:29具有同一性的vl鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id2的vl的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:29中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id2的vl的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列。在一些方面中，肽包括抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：包含seqidno:20的vh鏈和包含seqidno:29的vl鏈。

在一些方面中，肽包括抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：與seqidno:38具有同一性的vh鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id3的vh的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:38中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id3的vh的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列；和與seqidno:47具有同一性的vl鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id3的vl的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:47中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id3的vl的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列。在一些方面中，肽包括抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：包含seqidno:38的vh鏈和包含seqidno:47的vl鏈。

在一些方面中，肽包括抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：與seqidno:56具有同一性的vh鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id4的vh的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:56中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id4的vh的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列；和與seqidno:65具有同一性的vl鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id4的vl的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:65中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id4的vl的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列。在一些方面中，肽包括抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：包含seqidno:56的vh鏈和包含seqidno:65的vl鏈。

在一些方面中，肽包括抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：與seqidno:74具有同一性的vh鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id5的vh的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:74中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id5的vh的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列；和與seqidno:83具有同一性的vl鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id5的vl的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:83中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id5的vl的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列。在一些方面中，肽包括抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：包含seqidno:74的vh鏈和包含seqidno:83的vl鏈。在一些方面中，所述肽至少免疫特異性結(jié)合促血管發(fā)生素-2。在一些方面中，所述組合物進(jìn)一步包括一種或多種抗癌治療劑。在一些方面中，所述組合物被配制成藥物組合物。

在一些方面中，肽包括抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：與seqidno:222具有同一性的vh鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id10的vh的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:222中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id10的vh的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列；和與seqidno:224具有同一性的vl鏈，其中對(duì)應(yīng)于cdr1、cdr2和cdr3的區(qū)域包含表1所示的抗體id10的vl的cdr1、cdr2和cdr3，并在cdr1、cdr2和cdr3區(qū)內(nèi)具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換，并且seqidno:224中對(duì)應(yīng)于fr1、fr2、fr3、fr4的區(qū)域包含與表1所示的抗體id10的vl的fr1、fr2、fr3、fr4具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98、99％、或100％的同一性的氨基酸序列。在一些方面中，肽包括抗體或抗體片段，所述抗體或抗體片段包含：包含seqidno:222的vh鏈和包含seqidno:224的vl鏈。在一些方面中，所述肽至少免疫特異性結(jié)合促血管發(fā)生素-2。在一些方面中，所述組合物進(jìn)一步包括一種或多種抗癌治療劑。在一些方面中，所述組合物被配制成藥物組合物。

在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)包括用于治療受試者中的癌癥的方法。在一些方面中，該方法包括向受試者施用根據(jù)權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)的組合物。

本公開(kāi)還提供了在免疫治療后從癌癥患者分離人抗體的方法。

在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)包括從受試者獲得針對(duì)自身抗原的免疫細(xì)胞的方法，該方法包括鑒定對(duì)自身抗原呈陽(yáng)性免疫應(yīng)答的受試者，提供多聚體形式的自身抗原，使多聚體形式的自身抗原與來(lái)自對(duì)自身抗原顯示陽(yáng)性免疫應(yīng)答的受試者的樣品相接觸，和獲得與多聚體形式的自身抗原結(jié)合的免疫細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)包括從癌癥患者獲得針對(duì)自身抗原的免疫細(xì)胞的方法，該方法包括鑒定對(duì)自身抗原呈陽(yáng)性免疫應(yīng)答的受試者，提供多聚體形式的自身抗原，使多聚體形式的自身抗原與來(lái)自對(duì)自身抗原呈陽(yáng)性免疫應(yīng)答的受試者的樣品相接觸，和獲得與多聚體形式的自身抗原結(jié)合的免疫細(xì)胞。

除非另外指出，否則這里所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的相同的意義。這里描述了用于在本發(fā)明中使用的方法和材料；但是也可以使用本領(lǐng)域已知的其它合適方法和材料。這些材料、方法和實(shí)例僅作為舉例，并不意圖具有限制意義。本文引用這里提到的所有公開(kāi)、專利申請(qǐng)、專利、序列、數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)容和其它參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容作為參考。當(dāng)存在矛盾時(shí)，以本說(shuō)明書(shū)，包括定義，為準(zhǔn)。

通過(guò)下面的詳細(xì)說(shuō)明書(shū)和附圖以及權(quán)利要求，可以顯見(jiàn)本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)。

附圖簡(jiǎn)述

圖1.抗體id1(抗-mhci類多肽相關(guān)序列a(mica)抗體)可變重鏈(vh)的核酸序列(seqidno:1)。

圖2.抗體id1(抗-mica抗體)vh鏈的氨基酸序列(seqidno:2)。

圖3.抗體id1(抗-mica抗體)可變輕鏈(vl)的核酸序列(seqidno:10)。

圖4.抗體id1(抗-mica抗體)vl鏈的氨基酸序列(seqidno:11)。

圖5.抗體id2(抗-促血管發(fā)生素-2抗體)vh鏈的核酸序列(seqidno:19)。

圖6.抗體id2(抗促血管發(fā)生素-2抗體)vh鏈的氨基酸序列(seqidno:20)。

圖7.抗體id2(抗促血管發(fā)生素-2抗體)vl鏈的核酸序列(seqidno:28)。

圖8.抗體id2(抗促血管發(fā)生素-2抗體)vl鏈的氨基酸序列(seqidno:29)。

圖9.抗體id3(抗-促血管發(fā)生素-2抗體)vh鏈的核酸序列(seqidno:37)。

圖10.抗體id3(抗促血管發(fā)生素-2抗體)vh鏈的氨基酸序列(seqidno:38)。

圖11.抗體id3(抗促血管發(fā)生素-2抗體)vl鏈的核酸序列(seqidno:46)。

圖12.抗體id3(抗促血管發(fā)生素-2抗體)vl鏈的氨基酸序列(seqidno:47)。

圖13.抗體id4(抗-促血管發(fā)生素-2抗體)vh鏈的核酸序列(seqidno:55)。

圖14.抗體id4(抗促血管發(fā)生素-2抗體)vh鏈的氨基酸序列(seqidno:56)。

圖15.抗體id4(抗促血管發(fā)生素-2抗體)vl鏈的核酸序列(seqidno:64)。

圖16.抗體id4(抗促血管發(fā)生素-2抗體)vl鏈的氨基酸序列(seqidno:65)。

圖17.抗體id5(抗-促血管發(fā)生素-2抗體)vh鏈的核酸序列(seqidno:73)。

圖18.抗體id5(抗促血管發(fā)生素-2抗體)vh鏈的氨基酸序列(seqidno:74)。

圖19.抗體id5(抗促血管發(fā)生素-2抗體)vl鏈的核酸序列(seqidno:82)。

圖20.抗體id5(抗促血管發(fā)生素-2抗體)vl鏈的氨基酸序列(seqidno:83)。

圖21a-21f.用于從b細(xì)胞制作抗體的示例方法。(a)表達(dá)具有用于位點(diǎn)特異性生物素化的bira標(biāo)簽的抗原，并與熒光標(biāo)記的鏈親和素組成四聚體。(b)b細(xì)胞用四聚體和一組單克隆抗體染色。將四聚體⁺，類別轉(zhuǎn)換的記憶b細(xì)胞單細(xì)胞分選到pcr連排反應(yīng)管(pcrstrip)中。(c)用t7rna聚合酶進(jìn)行mrna擴(kuò)增。(d)用300-400bppcr產(chǎn)物進(jìn)行pcr產(chǎn)物測(cè)序。(e)使用重疊pcr構(gòu)建全長(zhǎng)igg1重鏈和κ/λ輕鏈序列，并將它們克隆到分離的載體中。將載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)入cho-s細(xì)胞，用于表達(dá)全人重組抗體。(f)測(cè)試抗體的抗原結(jié)合，并評(píng)估其潛在治療性能。

圖22a-22b.顯示使用單體和四聚體抗原鑒定記憶b細(xì)胞的結(jié)果比較的圖。(a)單生物素化的ttcf或cd80抗原直接用alexa-488熒光團(tuán)標(biāo)記；四聚體用非標(biāo)記的鏈親和素產(chǎn)生。將從每個(gè)供體富集的b細(xì)胞分成三個(gè)部分，并用對(duì)照cd80四聚體、ttcf單體或ttcf四聚體以相同的總抗原濃度0.125μg/ml進(jìn)行標(biāo)記。facs點(diǎn)圖描繪了cd19⁺cd27⁺igm^-類別轉(zhuǎn)換的記憶b細(xì)胞；門(gate)附近的數(shù)字代表父門(parentalgate)的百分比。(b)在三個(gè)不同供體中檢測(cè)到的四聚體⁺記憶b細(xì)胞的頻率。數(shù)字計(jì)算為：四聚體⁺細(xì)胞個(gè)數(shù)/1x10⁶個(gè)cd19⁺記憶b細(xì)胞。

圖23a-23b.顯示從漿母細(xì)胞和記憶b細(xì)胞產(chǎn)生的抗體與ttcf的高親和性結(jié)合的曲線圖。實(shí)施飽和結(jié)合試驗(yàn)以確定重組抗體的親和性。將ttcf抗體用銪標(biāo)記，銪在用螯合劑溫育時(shí)會(huì)在615nm發(fā)射強(qiáng)熒光信號(hào)。將抗體固定在96孔板中，并與ttcf-銪(100nm-4pm)一起37℃溫育2小時(shí)。記錄5nm的熒光計(jì)數(shù)，并用非線性回歸分析計(jì)算kd。在所有實(shí)驗(yàn)中均包含同樣在cho-s細(xì)胞中產(chǎn)生的對(duì)照抗體(克隆8.18.c5)。(a)重組ttcf抗體1和2從ttcf四聚體⁺漿母細(xì)胞(供體1)產(chǎn)生。(b)ttcf抗體3,4和5從來(lái)自三個(gè)不同供體的ttcf四聚體⁺記憶b細(xì)胞產(chǎn)生。

圖24.顯示抗-mica抗體與mica包被的luminex珠子的結(jié)合的柱狀圖。

圖25a-25o.顯示抗-mica抗體與mica包被的珠子的結(jié)合的曲線圖。

圖26a-26d.顯示四種人促血管發(fā)生素2特異性抗體以及對(duì)照抗體與三種人促血管發(fā)生素(促血管發(fā)生素-1、2和4)和類促血管發(fā)生素-3(ang-樣3)的結(jié)合的柱狀圖。將重組促血管發(fā)生素固定在elisa板中，并用銪標(biāo)記的鏈親和素檢測(cè)人重組抗體的結(jié)合。

圖27a-27c.顯示了從肺癌患者分離促血管發(fā)生素特異性抗體的相關(guān)圖片和凝膠。(a)通過(guò)elisa確定的肺癌患者(l19)血清(1:1000稀釋)的促血管發(fā)生素-2反應(yīng)性。(b)facs點(diǎn)圖，以cd19⁺,cd27⁺igm-b細(xì)胞設(shè)門的pbmc樣品(時(shí)間點(diǎn)-10/98)，x軸為cd19，y軸為熒光標(biāo)記的促血管發(fā)生素-2。(c)從患者l19分離的10個(gè)促血管發(fā)生素-2反應(yīng)活性記憶b細(xì)胞的重鏈、輕鏈和鉸鏈區(qū)的pcr產(chǎn)物。圖片左側(cè)指示了500堿基對(duì)的標(biāo)記物。

圖28.抗體id6(抗-mhci類多肽相關(guān)序列a(mica)抗體)的可變重(vh)鏈的核酸序列(seqidno:148)。

圖29.抗體id6(抗-mica抗體)vh鏈的氨基酸序列(seqidno:149)。

圖30.抗體id6(抗-mica抗體)可變輕(vl)鏈的核酸序列(seqidno:150)。

圖31.抗體id6(抗-mica抗體)vl鏈的氨基酸序列(seqidno:151)。

圖32.抗體id7(抗-mhci類多肽相關(guān)序列a(mica)抗體)的可變重(vh)鏈的核酸序列(seqidno:167)。

圖33.抗體id7(抗-mica抗體)vh鏈的氨基酸序列(seqidno:168)。

圖34.抗體id7(抗-mica抗體)可變輕(vl)鏈的核酸序列(seqidno:169)。

圖35.抗體id7(抗-mica抗體)vl鏈的氨基酸序列(seqidno:170)。

圖36.抗體id8(抗-mhci類多肽相關(guān)序列a(mica)抗體)的可變重(vh)鏈的核酸序列(seqidno:185)。

圖37.抗體id8(抗-mica抗體)vh鏈的氨基酸序列(seqidno:186)。

圖38.抗體id8(抗-mica抗體)可變輕(vl)鏈的核酸序列(seqidno:187)。

圖39.抗體id8(抗-mica抗體)vl鏈的氨基酸序列(seqidno:188)。

圖40.抗體id9(抗-mhci類多肽相關(guān)序列a(mica)抗體)的可變重鏈(vh)的核酸序列(seqidno:203)。

圖41.抗體id9(抗-mica抗體)vh鏈的氨基酸序列(seqidno:204)。

圖42.抗體id9(抗-mica抗體)可變輕(vl)鏈的核酸序列(seqidno:205)。

圖43.抗體id9(抗-mica抗體)vl鏈的氨基酸序列(seqidno:206)。

圖44.抗體id10(抗-促血管發(fā)生素-2抗體)的可變重鏈(vh)的核酸序列(seqidno:221)。

圖45.抗體id10(抗-促血管發(fā)生素-2抗體)vh鏈的氨基酸序列(seqidno:222)。

圖46.抗體id10(抗-促血管發(fā)生素-2抗體)可變輕(vl)鏈的核酸序列(seqidno:223)。

圖47.抗體id10(抗-mica抗體)vl鏈的氨基酸序列(seqidno:224)。

圖48a-g.顯示對(duì)重組抗-mica抗體與mica等位體的特異性結(jié)合的評(píng)估的曲線圖。

圖49.顯示用抗-mica抗體cm24002ab2標(biāo)記自體腫瘤細(xì)胞的曲線圖。

圖50.顯示血清mica對(duì)nkg2d的調(diào)節(jié)的一系列facs點(diǎn)圖。人nk細(xì)胞與來(lái)自患者cm24002的對(duì)照血清的1:10稀釋物一起溫育48小時(shí)。在溫育開(kāi)始時(shí)，以10μg/ml的濃度添加所示抗體。通過(guò)流式細(xì)胞儀評(píng)估nkg2d在cd56+nk細(xì)胞上的表達(dá)。

圖51.顯示重組mica對(duì)nkg2d的調(diào)節(jié)的一系列facs點(diǎn)圖。將人nk細(xì)胞與2ng/ml的濃度的重組mica一起溫育48小時(shí)。在溫育開(kāi)始時(shí)，以10μg/ml的濃度添加所示抗體。48小時(shí)后，通過(guò)流式細(xì)胞儀評(píng)估nkg2d在cd56+nk細(xì)胞上的表達(dá)。

圖52.證明抗-mica抗體cm24002ab2可提高細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的曲線圖。在10μg/ml的指示抗體的存在下，將人nk細(xì)胞與重組mica(2ng/ml)一起溫育48小時(shí)。通過(guò)測(cè)量以指定比例溫育4小時(shí)后ldh的釋放，評(píng)估nk細(xì)胞(效應(yīng)物)殺死k562靶細(xì)胞的能力。

圖53.證明抗-mica抗體cm24002ab2和cm33322ab29可提高細(xì)胞介導(dǎo)的毒性的柱狀圖。在10μg/ml的指示抗體的存在下，將人nk細(xì)胞與重組mica(2ng/ml)溫育48小時(shí)。通過(guò)測(cè)量在溫育4小時(shí)后ldh的釋放，評(píng)估nk細(xì)胞(效應(yīng)物)殺死k562靶細(xì)胞的能力。在效應(yīng)物與靶細(xì)胞溫育4小時(shí)期間，添加nkg2d封閉抗體或fc封閉抗體，以評(píng)估fc受體和nkg2d對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的毒性的貢獻(xiàn)。

圖54.顯示重組抗-mica抗體與micaalpha3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合的一系列曲線圖。重組micaalpha3結(jié)構(gòu)域被生物素化，并被捕捉在鏈親和素包被的珠子表面上。將10μg/ml的所示抗體與各個(gè)重組蛋白包被的珠子一起溫育1小時(shí)。隨后清洗珠子，并與fitc-偶聯(lián)的抗人igg第二抗體一起溫育。通過(guò)流式細(xì)胞儀定量fitc熒光。

圖55.證明腫瘤細(xì)胞被抗-mica抗體cm24002ab2和cm33322ab29標(biāo)記的曲線圖。熒光通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定。

圖56.證明通過(guò)luminex測(cè)定法確定的抗-mica抗體cm33322ab29的mica等位體特異性的柱狀圖。

圖57.柱狀圖顯示了抗-促血管發(fā)生素-2特異性抗體抗-ang6ab2以及對(duì)照抗體對(duì)三種人促血管發(fā)生素(促血管發(fā)生素-1,2和4)和類促血管發(fā)生素-3的結(jié)合。重組促血管發(fā)生素被固定在elisa板上，用銪-標(biāo)記的鏈親和素檢測(cè)人重組抗體的結(jié)合。

詳細(xì)說(shuō)明

本公開(kāi)部分地基于如下的觀察，即通過(guò)用四聚體形式的感興趣的抗原標(biāo)記b細(xì)胞，能夠從暴露于疾病的人類受試者獲得針對(duì)疾病中重要治療靶標(biāo)的抗體。如上文背景部分描述的，先前方法至少在下列方面有限制：在人類受試者中鑒定合適b細(xì)胞的效率低和/或方法會(huì)誘導(dǎo)被捕獲任何的b細(xì)胞經(jīng)歷表型改變，從而降低其價(jià)值。相反，本文中描述的方法允許捕獲稀少的針對(duì)特定疾病相關(guān)抗原的記憶b細(xì)胞。如下文所述，該方法需要疾病相關(guān)抗原的四聚體化，正如下面的實(shí)施例中證實(shí)的那樣，該過(guò)程可以提高合適記憶b細(xì)胞的鑒定。具體地，本文中的方法允許在受試者初始暴露于抗原后的更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)更高效地捕獲合適的記憶b細(xì)胞。本文中的方法還包括利用通過(guò)使用這里所公開(kāi)的方法獲得的記憶b細(xì)胞的遺傳材料所產(chǎn)生的抗體(和從這些抗體序列產(chǎn)生的肽)。

本文描述了針對(duì)mhci類多肽相關(guān)序列a(mica)的人抗體和靶定促血管發(fā)生素-2的人抗體。這兩種類型的人抗體均是通過(guò)涉及使用四聚體抗原的方法從接受了基于細(xì)胞的癌癥疫苗(gm-csf轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體腫瘤細(xì)胞)的患者中鑒定的。

在一些情況下，本公開(kāi)提供了用于從選定的人類受試者特異性獲得或靶定具有治療潛力的抗體的方法，以及由其產(chǎn)生的治療組合物。這些方法可以包括：在人類受試者中獲得或靶定免疫細(xì)胞，其中免疫細(xì)胞包括但不僅限于，例如b細(xì)胞和/或記憶b細(xì)胞，從所得的或所靶定的免疫細(xì)胞分離或純化遺傳材料(例如dna和/或mrna)，和使用分離或純化的遺傳材料產(chǎn)生治療組合物，例如本文中公開(kāi)的治療組合物。該方法的進(jìn)一步描述在下文的“方法”部分中提供。

在一些情況下，本公開(kāi)提供了治療組合物(例如包括治療肽，包括抗體、抗體片段、抗體衍生物和/或抗體偶聯(lián)物)，該組合物涉及患有或者曾經(jīng)患有狀況或疾病、并對(duì)該狀況或疾病顯示陽(yáng)性免疫應(yīng)答的受試者中存在的抗體。治療組合物

在一些情況下，本文中的治療組合物能夠與狀況或疾病相關(guān)的結(jié)合配偶相互作用(例如結(jié)合、特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)，其中治療組合物與結(jié)合配偶之間的相互作用導(dǎo)致針對(duì)該狀況或疾病的陽(yáng)性免疫應(yīng)答(例如受試者中的疾病或其癥狀的水平降低)。

在一些情況下，治療組合物可以包括肽，所述肽包括(例如包含，基本上由其構(gòu)成，或由其構(gòu)成)表1所示的抗體id1,2,3,4或5，6,7,8,9或10的可變重鏈(vh)和/或可變輕鏈(vl)的至少一個(gè)(例如1、2、3、4、5和/或6個(gè))互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)。

在一些情況下，治療組合物可以包括肽，所述肽包括(例如包含，基本上由其構(gòu)成，或由其構(gòu)成)表1所示的抗體id1,2,3,4,5,6,7,8,9或10的可變重鏈(vh)和/或可變輕鏈(vl)的至少一個(gè)(例如1、2、3、4、5和/或6個(gè))互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)，并且其與mhci類多肽相關(guān)序列a(mica(例如unigenehs.130838))(例如可溶mica(smica))和/或促血管發(fā)生素-2(例如unigenehs.583870)，包括其表位，相互作用(例如結(jié)合、特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。

在一些情況下，治療組合物可以包括肽，所述肽包括表1所示的抗體id1,6,7,8和/或9的vh和/或vl的至少一個(gè)cdr，其中肽與mica(例如人mica(例如人mica(例如可溶mica(smica)))結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，所述肽可以包括至少2個(gè)cdr，其中該至少2個(gè)cdr是表1所示的不同抗體的cdr。換言之，表1所示的抗體id1,6,7,8和9的cdr(和fr和/或aa序列)可以互換使用，并能夠被組合產(chǎn)生肽，只要該肽能夠與mica(例如人mica(例如可溶mica(smica)))結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)即可。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id1,6,7,8和/或9的vh和/或vl的cdr3。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id1,6,7,8和/或9的vh和vl的cdr3和表1所示的抗體id1,6,7,8和/或9的vh和/或vl的cdr1和/或cdr2。在一些情況下，這些肽包括抗體id1,6,7,8和/或9的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3。在一些情況下，這些肽包括抗體id1,6,7,8和/或9的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3，和表1所示的抗體id1,6,7,8和/或9的vh和/或vl的至少一個(gè)fr1fr2fr3和/或fr4。在一些情況下，這些肽包括seqidno:2,149,168,186或204的其中之一和/或seqidno:11,151,170,188或206的其中之一。在每種情況下，肽能夠與mica(例如人mica(例如可溶mica(smica)))結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，肽和mica之間的結(jié)合親和力為大約0.1nm-1μm，例如大約10nm。

在一些情況下，治療組合物可以包括肽，所述肽包含表1所示的抗體id6的vh和/或vl的至少一個(gè)cdr，其中肽與mica(例如人mica(例如可溶mica(smica)))結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id6的vh和/或vl的cdr3。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id6的vh和vl的cdr3和表1所示的抗體id6的vh和/或vl的cdr1和/或cdr2。在一些情況下，這些肽包括抗體id6的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3。在一些情況下，這些肽包括抗體id6的vh和vl的cdr1、cdr2和cdr3和表1所示的抗體id6的vh和/或vl的fr1、fr2、fr3和/或fr4中的至少一個(gè)。在一些情況下，這些肽包括seqidno:149和/或seqidno:151。在每種情況下，肽能夠與mica(例如人mica(例如可溶mica(smica)))結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，肽和mica之間的結(jié)合親和力為大約0.1nm-1μm，例如大約10nm。

在一些情況下，治療組合物可以包括肽，所述肽包含表1所示的抗體id7的vh和/或vl的至少一個(gè)cdr，其中肽與mica(例如人mica(例如可溶mica(smica)))結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id7的vh和/或vl的cdr3。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id7的vh和vl的cdr3和表1所示的抗體id7的vh和/或vl的cdr1和/或cdr2。在一些情況下，這些肽包括抗體id7的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3。在一些情況下，這些肽包括抗體id7的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3和表1所示的抗體id7的vh和/或vl的fr1、fr2、fr3和/或fr4中的至少一個(gè)。在一些情況下，這些肽包括seqidno:168和/或seqidno:170。在每種情況下，肽能夠與mica(例如人mica(例如可溶mica(smica)))結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，肽和mica之間的結(jié)合親和力為大約0.1nm-1μm，例如大約10nm。

在一些情況下，治療組合物可以包括肽，所述肽包含表1所示的抗體id8的vh和/或vl的至少一個(gè)cdr，其中肽與mica(例如人mica(例如可溶mica(smica)))結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id8的vh和/或vl的cdr3。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id8的vh和vl的cdr3和表1所示的抗體id8的vh和/或vl的cdr1和/或cdr2。在一些情況下，這些肽包括抗體id8的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3。在一些情況下，這些肽包括抗體id8的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3和表1所示的抗體id8的vh和/或vl的fr1、fr2、fr3和/或fr4中的至少一個(gè)。在一些情況下，這些肽包括seqidno:186和/或seqidno:188。在每種情況下，肽能夠與mica(例如人mica(例如可溶mica(smica)))結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，肽和mica之間的結(jié)合親和力為大約0.1nm-1μm，例如大約10nm。

在一些情況下，治療組合物可以包括肽，所述肽包含表1所示的抗體id9的vh和/或vl的至少一個(gè)cdr，其中肽與mica(例如人mica(例如可溶mica(smica)))結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id9的vh和/或vl的cdr3。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id9的vh和vl的cdr3和表1所示的抗體id9的vh和/或vl的cdr1和/或cdr2。在一些情況下，這些肽包括抗體id9的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3。在一些情況下，這些肽包括抗體id9的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3和表1所示的抗體id9的vh和/或vl的fr1、fr2、fr3和/或fr4中的至少一個(gè)。在一些情況下，這些肽包括seqidno:204和/或seqidno:206。在每種情況下，肽能夠與mica(例如人mica(例如可溶mica(smica)))結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，肽和mica之間的結(jié)合親和力為大約0.1nm-1μm，例如大約10nm。

在一些情況下，治療組合物可以包括肽，所述肽包含表1所示的抗體id2,3,4,5和/或10的vh或vl的至少一個(gè)cdr，其中所述肽與促血管發(fā)生素-2(例如人促血管發(fā)生素-2)結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，肽可以包括至少2個(gè)cdr，其中該至少兩個(gè)cdr是來(lái)自表1所示的不同抗體的cdr。換言之，表1所示的抗體id2,3,4,5和10的cdr(和fr和/或aa序列)可以互換使用，并能夠組合以產(chǎn)生肽，只要該肽能夠與促血管發(fā)生素-2(例如人促血管發(fā)生素-2)結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)即可。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id2,3,4,5和/或10的vh和/或vl的cdr3。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id2,3,4,5和/或10的vh和vl的cdr3和表1所示的抗體id2,3,4,5和/或10的vh和/或vl的cdr1和/或cdr2。在一些情況下，這些肽包括抗體id2,3,4,5和/或10的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3。在一些情況下，這些肽包括抗體id2,3,4,5和/或10的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3，和表1所示的抗體id2,3,4,5和/或10的vh和/或vl的至少一個(gè)fr1fr2fr3和/或fr4。在一些情況下，這些肽包括seqidno:20,38,56,74或222的其中之一和/或seqidno:29,47,65,83或224的其中之一。在每種情況下，肽能夠與促血管發(fā)生素-2(例如人促血管發(fā)生素-2(例如unigenehs.583870))結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。

在一些情況下，治療組合物可以包括肽，所述肽包含表1所示的抗體id2的vh和/或vl的至少一個(gè)cdr，其中所述肽與促血管發(fā)生素-2(例如人促血管發(fā)生素-2)結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id2的vh和/或vl的cdr3。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id2的vh和vl的cdr3和表1所示的抗體id2的vh和/或vl的cdr1和/或cdr2。在一些情況下，這些肽包括抗體id2的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3。在一些情況下，這些肽包括抗體id2的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3和表1所示的抗體id2的vh和/或vl的fr1、fr2、fr3和/或fr4中的至少一個(gè)。在一些情況下，這些肽包括seqidno:20和/或seqidno:29。在每種情況下，肽能夠與促血管發(fā)生素-2(例如人促血管發(fā)生素-2)結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，肽和促血管發(fā)生素-2之間的結(jié)合親和力為大約0.1nm-1μm，例如大約10nm。

在一些情況下，治療組合物可以包括肽，所述肽包含表1所示的抗體id3的vh和/或vl的至少一個(gè)cdr，其中肽與促血管發(fā)生素-2(例如人促血管發(fā)生素-2)結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id3的vh和/或vl的cdr3。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id3的vh和vl的cdr3和表1所示的抗體id3的vh和/或vl的cdr1和/或cdr2。在一些情況下，這些肽包括抗體id3的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3。在一些情況下，這些肽包括抗體id3的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3和表1所示的抗體id3的vh和/或vl的fr1、fr2、fr3和/或fr4中的至少一個(gè)。在一些情況下，這些肽包括seqidno:38和/或seqidno:47。在每種情況下，肽能夠與促血管發(fā)生素-2(例如人促血管發(fā)生素-2)結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，肽和促血管發(fā)生素-2之間的結(jié)合親和力為大約0.1nm-1μm，例如大約10nm。

在一些情況下，治療組合物可以包括肽，所述肽包含表1所示的抗體id4的vh和/或vl的至少一個(gè)cdr，其中肽與促血管發(fā)生素-2(例如人促血管發(fā)生素-2)結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id4的vh和/或vl的cdr3。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id4的vh和vl的cdr3和表1所示的抗體id4的vh和/或vl的cdr1和/或cdr2。在一些情況下，這些肽包括抗體id4的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3。在一些情況下，這些肽包括抗體id4的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3和表1所示的抗體id4的vh和/或vl的fr1、fr2、fr3和/或fr4中的至少一個(gè)。在一些情況下，這些肽包括seqidno:56和/或seqidno:65。在每種情況下，肽能夠與促血管發(fā)生素-2(例如人促血管發(fā)生素-2)結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，肽與促血管發(fā)生素-2之間的結(jié)合親和力可為x-y，例如x-y，x-y。在一些情況下，肽和促血管發(fā)生素-2之間的結(jié)合親和力為大約0.1nm-1μm，例如大約10nm。

在一些情況下，治療組合物可以包括肽，所述肽包含表1所示的抗體id5的vh和/或vl的至少一個(gè)cdr，其中肽與促血管發(fā)生素-2(例如人促血管發(fā)生素-2)結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id5的vh和/或vl的cdr3。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id5的vh和vl的cdr3和表1所示的抗體id5的vh和/或vl的cdr1和/或cdr2。在一些情況下，這些肽包括抗體id5的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3。在一些情況下，這些肽包括抗體id5的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3和表1所示的抗體id5的vh和/或vl的fr1、fr2、fr3和/或fr4中的至少一個(gè)。在一些情況下，這些肽包括seqidno:74和/或seqidno:83。在每種情況下，肽能夠與促血管發(fā)生素-2(例如人促血管發(fā)生素-2)結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，肽和促血管發(fā)生素-2之間的結(jié)合親和力為大約0.1nm-1μm，例如大約10nm。

在一些情況下，治療組合物可以包括肽，所述肽包含表1所示的抗體id10的vh和/或vl的至少一個(gè)cdr，其中肽與促血管發(fā)生素-2(例如人促血管發(fā)生素-2)結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id10的vh和/或vl的cdr3。在一些情況下，這些肽包括表1所示的抗體id10的vh和vl的cdr3和表1所示的抗體id10的vh和/或vl的cdr1和/或cdr2。在一些情況下，這些肽包括抗體id10的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3。在一些情況下，這些肽包括抗體id10的vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3和表1所示的抗體id10的vh和/或vl的fr1、fr2、fr3和/或fr4中的至少一個(gè)。在一些情況下，這些肽包括seqidno:222和/或seqidno:224。在每種情況下，肽能夠與促血管發(fā)生素-2(例如人促血管發(fā)生素-2)結(jié)合(例如特異性結(jié)合和/或免疫特異性結(jié)合)。在一些情況下，肽和促血管發(fā)生素-2之間的結(jié)合親和力為大約0.1nm-1μm，例如大約10nm。

在一些情況下，與促血管發(fā)生素-2結(jié)合的肽還能夠與促血管發(fā)生素-1(例如unigenehs.369675)和/或促血管發(fā)生素-4(例如unigenehs.278973)結(jié)合。例如，在一些情況下，與促血管發(fā)生素-2結(jié)合的肽還能夠與除促血管發(fā)生素-1之外的其它相關(guān)抗原(除促血管發(fā)生素-1之外)特異性和/或免疫特異性結(jié)合。在一些情況下，與促血管發(fā)生素-2結(jié)合的肽還能夠與除促血管發(fā)生素-4之外的其它相關(guān)抗原(除促血管發(fā)生素-4之外)特異性和/或免疫特異性結(jié)合。

在一些情況下，治療組合物可以包括肽，所述肽包含：seqidno:2和/或seqidno:11；seqidno:149和/或seqidno:151；seqidno:168和/或seqidno:170；seqidno:186和/或seqidno:188；seqidno:204和/或seqidno:206；seqidno:20和/或seqidno:29；seqidno:38和/或seqidno:47；seqidno:56和/或seqidno:65；seqidno:74和/或seqidno:83；和seqidno:222和/或seqidno:224

^*序列包括與所示序列具有(至少具有)80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％和/或100％序列同一性的序列或變異體。

^**序列能夠包含1、2、3、4、5個(gè)，少于5個(gè)，或少于10個(gè)保守氨基酸修飾。

^#序列包括該序列或與所示序列具有(至少具有)80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％和/或100％序列同一性(例如在對(duì)應(yīng)于fr1,fr2,fr3和/或fr4的區(qū)域內(nèi))的變異體，和/或在對(duì)應(yīng)于cdr1,2和/或3的區(qū)域內(nèi)具有1、2、3、4、5個(gè)，少于5個(gè)，或少于10個(gè)保守氨基酸修飾。

^##序列包括與所示序列具有(至少具有)80％,85％,90％,95％,96％,97％,98,99％和/或100％序列同一性的序列或變異體，其中序列編碼相應(yīng)的aa。

a.a.^#顯示vh或vl氨基酸序列。

核酸^##顯示vh或vl核酸序列。

盡管上面顯示了cdr和fr區(qū)，但是這些區(qū)域也可以根據(jù)kabat(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.,1987and1991))加以定義?？贵w或抗原結(jié)合片段的氨基酸編號(hào)也可以根據(jù)kabat的編號(hào)。

在一些情況下，治療組合物可以包括肽，包括例如抗體，包括全長(zhǎng)和/或完整抗體，或抗體片段?！翱贵w”是一種能夠通過(guò)位于免疫球蛋白分子可變區(qū)內(nèi)的至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)特異結(jié)合靶標(biāo)(例如碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”不僅包括完整多克隆或單克隆抗體，還包括其任何抗原結(jié)合片段(例如“抗原結(jié)合部分”)或單鏈，包含抗體的融合蛋白，和包含抗原識(shí)別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的任何其它修飾構(gòu)象?？贵w包括任何類型的抗體，例如igg,iga,或igm(或其亞類)，抗體不必是任何特殊的類別。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的抗體氨基酸序列，免疫球蛋白可以被分類成不同的類別。有五種主要的免疫球蛋白類別：iga,igd,ige,igg,和igm，其中的多個(gè)可以被進(jìn)一步分成亞類(同種型(isotype))，例如igg1,igg2,igg3,igg4,iga1和iga2。對(duì)應(yīng)于不同類別免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)被分別稱作α、δ、ε、γ和μ。不同類別免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象是眾所周知的?？贵w和抗體片段的實(shí)例包括，但不僅限于，單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、由至少兩種不同的表位結(jié)合片段形成的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、駱駝化(camelised)抗體、嵌合抗體、單鏈fv(scfv)、單鏈抗體、單域抗體、域抗體、fab片段、f(ab')2片段、顯示期望生物活性的抗體片段(例如抗原結(jié)合部分)、二硫鍵連接的fv(dsfv)、和抗獨(dú)特型(抗id)抗體(包括例如，抗本發(fā)明抗體的抗-id抗體)、細(xì)胞內(nèi)抗體(intrabodies)，和上述任一的表位結(jié)合片段。抗體或抗體片段可以是人的或人源化的。

抗體的片段適合于在本方法中使用，只要它們保持全長(zhǎng)抗體的期望親和性和特異性即可。因此，抗-mica抗體或抗-促血管發(fā)生素抗體的片段在fv部分中將分別保持結(jié)合mica或促血管發(fā)生素的能力，并在fc部分中保持結(jié)合樹(shù)突細(xì)胞上fc受體的能力。這些片段的特征是具有與相應(yīng)全長(zhǎng)抗-mica抗體或抗促血管發(fā)生素抗體相似的性質(zhì)，也就是說(shuō)，片段可以分別特異性結(jié)合在人細(xì)胞表面上表達(dá)的人mica抗原或促血管發(fā)生素抗原，或已經(jīng)脫落到介質(zhì)中的相應(yīng)smica抗原。

fv片段是含有完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。該區(qū)域由緊密締合的一條重鏈可變區(qū)和一條輕鏈可變區(qū)的二聚體構(gòu)成，所述締合在天然狀態(tài)下，例如在scfv中，可以是共價(jià)的。在該構(gòu)型中，每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)cdr相互作用，在vh-vl二聚體的表面上限定一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)?？傮w上，6個(gè)cdr，或它們的子集，為抗體提供了抗原結(jié)合特異性。然而，甚至單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或僅包含三個(gè)特異針對(duì)某抗原的cdr的半個(gè)fv)也能夠具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，盡管通常其親和力比完整的結(jié)合位點(diǎn)要低。

單鏈fv或(scfv)抗體片段包括抗體的vh和vl結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單條多肽鏈上。一般地，fv多肽進(jìn)一步包括位于vh和vl結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，使得scfv能夠形成用于抗原結(jié)合的期望結(jié)構(gòu)。

fab片段含有輕鏈的可變和恒定結(jié)構(gòu)域和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域和第一恒定結(jié)構(gòu)域(ch1)。f(ab')2抗體片段包括一對(duì)fab片段，它們一般在其羧基端附近通過(guò)它們之間的鉸鏈半胱氨酸共價(jià)連接在一起?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)在本領(lǐng)域也是已知的。

雙抗體是具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段，該片段包括在相同多肽鏈中連接在一起的vh和vl(vh和vl)。通過(guò)使用非常短以致于相同鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間無(wú)法形成配對(duì)的接頭，結(jié)構(gòu)域被強(qiáng)迫與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。

線性抗體包括一對(duì)串聯(lián)的fd片段(vh-ch1-vh-ch1)，它們與互補(bǔ)輕鏈多肽一起形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以是雙特異性或單特異性的。

本公開(kāi)的抗體和抗體片段可以在fc區(qū)被修飾，從而提供期望的效應(yīng)物功能或血清半衰期。在一些情況下，fc區(qū)能夠偶聯(lián)peg或白蛋白，以增加血清半衰期，或者其它可導(dǎo)致期望效果的偶聯(lián)?？蛇x擇地，當(dāng)期望消除或降低效應(yīng)物功能，以便使副作用或治療并發(fā)癥最小化時(shí)，可以使用某些其它的fc區(qū)。

人和人源化抗體包括具有來(lái)自人種系免疫球蛋白序列的可變和恒定區(qū)(或具有與來(lái)自人種系免疫球蛋白序列的抗體相同的氨基酸序列)的抗體。人抗體包含(例如，在cdr中、特別是cdr3中包含)不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過(guò)體外隨機(jī)或定點(diǎn)突變或體內(nèi)體細(xì)胞突變所引入的突變)。

可變區(qū)的“cdr”是超變區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基，其根據(jù)kabat、chothia、kabat和chothia的累加、abm、接觸和/或構(gòu)象定義或任何本領(lǐng)域眾所周知的cdr確定方法加以鑒定。抗體cdr可以被鑒定為最初由kabat等定義的超變區(qū)。見(jiàn)例如kabatetal.,1992,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,publichealthservice,nih,washingtond.c.。cdr的位置也可以被鑒定為最初由chothia等人描述的結(jié)構(gòu)環(huán)結(jié)構(gòu)。見(jiàn)例如chothiaetal.,1989,nature342:877-883。其它c(diǎn)dr鑒定方法包括“abm定義”，其是kabat和chothia方法的折中方法，并使用oxfordmolecular的abm抗體建模軟件(現(xiàn)在是)生成，或者根據(jù)所觀察到的抗原接觸進(jìn)行的cdr的“接觸定義”，其在maccallumetal.,1996,j.mol.biol.,262:732-745中提出。在另一個(gè)方法中，在本文中被稱作cdr的“構(gòu)象定義”，cdr的位置可以被鑒定為對(duì)抗原結(jié)合具有焓貢獻(xiàn)的殘基。見(jiàn)例如makabeetal.,2008,journalofbiologicalchemistry,283:1156-1166。另外的cdr邊界可以不是嚴(yán)格遵循上述的某一方法定義，但是仍然會(huì)與kabatcdr的至少一部分重疊；盡管根據(jù)預(yù)測(cè)或?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)，具體的殘基或殘基的基團(tuán)或者甚至整個(gè)cdr對(duì)抗原結(jié)合沒(méi)有顯著影響，可以對(duì)它們進(jìn)行延長(zhǎng)或縮短。如本文中所使用的，cdr可以是指通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法，包括方法組合，定義的cdr。本文中所用的方法可以使用根據(jù)任何這些方法定義的cdr。對(duì)于任何給定的包含超過(guò)1個(gè)cdr的實(shí)施例，cdr可以根據(jù)kabat、chothia、擴(kuò)展、abm、接觸、和/或構(gòu)象定義中的任一個(gè)加以定義。

在一些情況下，本文中公開(kāi)的肽的氨基酸序列可以被修飾和改變，以產(chǎn)生例如肽變異體(例如與本文中所公開(kāi)的肽具有限定的同源性的序列的肽)，只要該肽變異體的抗原結(jié)合性質(zhì)被保留，或者與未經(jīng)修飾的肽相比有所提高即可(任何被修飾肽的抗原結(jié)合性質(zhì)均可以使用本文中描述的和/或本領(lǐng)域已知的技術(shù)通過(guò)體外和/或體內(nèi)測(cè)定進(jìn)行評(píng)估)。

盡管肽變異體一般在氨基酸水平被觀察和討論，但是實(shí)際的修飾通常在核酸水平引入或?qū)嵤?。例如，與表1所示肽具有80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％氨基酸序列同一性的變異體，可以通過(guò)用本領(lǐng)域已知的和/或本文中公開(kāi)的技術(shù)(例如克隆技術(shù))對(duì)編碼seqidnos:1,10,19,28,37,46,55,64,73和/或82的核酸進(jìn)行修飾加以產(chǎn)生。

氨基酸序列修飾通?？梢詫儆谌N類型中的一種或多種：替換、插入或刪除修飾。插入包括氨基和/或末端融合以及序列內(nèi)插入單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。插入通常是比氨基端或羧基端融合更小的插入，例如1-4個(gè)殘基的量級(jí)。刪除的特征是從蛋白序列中除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。典型地，在蛋白分子內(nèi)的任何一個(gè)位置處刪除不超過(guò)大約2-6個(gè)殘基。氨基酸替換通常是單個(gè)殘基替換，但是也可以同時(shí)在多個(gè)不同位置發(fā)生；插入通常處于大約1-10個(gè)氨基酸殘基的量級(jí)；刪除的范圍是大約1-30個(gè)殘基。刪除或插入可以是鄰近成對(duì)的插入或刪除，即二殘基刪除或二殘基插入。替換、刪除、插入或其任意組合可以組合使用，以獲得最終的構(gòu)建體。突變不可導(dǎo)致序列的閱讀框錯(cuò)誤，優(yōu)選地不會(huì)產(chǎn)生可能導(dǎo)致二級(jí)mrna結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的互補(bǔ)區(qū)。替換修飾是指除去至少一個(gè)殘基，并在其位置上插入不同的殘基。在一些情況下，替換可以是保守的氨基酸替換。在一些情況下，本文中肽與表1所示的肽相比，可以包含1個(gè)或多個(gè)保守氨基酸替換。例如，變異體與表1所示的肽相比，可以包含1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,20-30,30-40,或40-50個(gè)保守氨基酸替換?？蛇x擇地，變異體與表1所示的肽相比，可以包含50個(gè)或更少的、40個(gè)或更少的、30個(gè)或更少的、20個(gè)或更少的、10個(gè)或更少的、9個(gè)或更少的、8個(gè)或更少的、7個(gè)或更少的、6個(gè)或更少的、5個(gè)或更少的、4個(gè)或更少的、3個(gè)或更少的、2個(gè)或更少的保守氨基酸替換。這些替換一般根據(jù)下面的表2實(shí)現(xiàn)，并被稱作保守替換。用于預(yù)測(cè)蛋白對(duì)修飾的耐受性的方法是本領(lǐng)域已知的(見(jiàn)例如guoetal.,proc.natl.acad.sci.,usa,101(25):9205-9210(2004))。

表2:保守氨基酸替換

在一些情況下，替換不是保守的。例如，表1所示肽中的一個(gè)氨基酸可以被可能改變肽的一些性質(zhì)或方面的氨基酸替換。在一些情況下，可進(jìn)行非保守氨基酸替換以便，例如，改變肽的結(jié)構(gòu)，改變肽的結(jié)合性質(zhì)(例如增加或降低肽與抗原的結(jié)合親和力，和/或增加或降低肽與抗原的結(jié)合特異性)。

在一些情況下，肽和/或肽變異體可以包含或者可以是表1所示肽的片段。這樣的片段可以比表1所示的cdr、fr和/或aa少，例如，1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,3637,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,50-100,101-150個(gè)氨基酸，只要該片段仍至少保持全長(zhǎng)肽的一部分結(jié)合性質(zhì)即可(例如全長(zhǎng)肽的至少50％,60％,70％,80％,90％,或100％的結(jié)合性質(zhì))。截短可以在本文肽的氨基、羧基和/或內(nèi)部進(jìn)行。

在一些情況下，肽變異體的相互作用面可以和未經(jīng)修飾的肽相同(例如基本上相同)，例如與未經(jīng)修飾的肽相比，改變(如增加或降低)、保留、或保持肽變異體的結(jié)合性質(zhì)。用于鑒定肽相互作用面的方法是本領(lǐng)域已知的(gongetal.,bmc:bioinformatics,6:1471-2105(2007)；andradeandweietal.,pureandappl.chem.,64(11):1777-1781(1992)；choietal.,proteins:structure,function,andbioinformatics,77(1):14-25(2009)；parketal.,bmc:andbioinformatics,10:1471-2105(2009))。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)容易理解如何確定兩條多肽(例如未經(jīng)修飾的肽和肽變異體)的同一性。例如，可以在將兩條序列進(jìn)行比對(duì)從而使其同一性達(dá)到最高水平之后，計(jì)算同一性。另一種計(jì)算同一性的方法是通過(guò)公開(kāi)的算法實(shí)施。用于比較的最佳序列比對(duì)，可以通過(guò)smithandwaterman,adv.appl.math,2:482(1981)的局部同一性算法，通過(guò)needlemanandwunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的同一性比對(duì)算法，通過(guò)pearsonandlipman,proc.natl.acad.sci.usa85:2444(1988)的搜索相似度方法，通過(guò)這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)(geneticscomputergroup(575sciencedr.,madison,wi)的wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的gap,bestfit,fasta,和tfasta)，或通過(guò)目測(cè)來(lái)急性。

通過(guò)例如zuker,science244:48-52(1989)；jaegeretal.,proc.natl.acad.sci.usa86:7706-10(1989)；jaegeretal.,methodsenzymol.183:281-306(1989)中公開(kāi)的算法，可以為核酸獲得相同類型的同一性，本文引用其至少與核酸比對(duì)相關(guān)的材料作為參考?？梢岳斫?，通常任何方法均可以使用，并且在某些情況下，這些不同方法的結(jié)果可能不同，但是技術(shù)人員會(huì)理解，如果使用這些方法中的至少一種時(shí)發(fā)現(xiàn)同一性，則該序列可以被稱作具有所述的同一性，并在本文中被公開(kāi)。

在一些情況下，如在下文方法部分將詳細(xì)描述的，本文中公開(kāi)的治療組合物可以使用從通過(guò)本文中公開(kāi)的方法獲得的免疫細(xì)胞(例如b細(xì)胞，包括記憶b細(xì)胞)分離和/或純化的遺傳材料(例如dna和/或rna)加以制備。一旦獲得了這些遺傳材料，則使用它們產(chǎn)生本文中公開(kāi)的治療組合物的方法是本領(lǐng)域已知的，和/或在下文中有總結(jié)。

在一些情況下，肽可以包含可檢測(cè)標(biāo)記物。如本文中所使用的，“標(biāo)記物”是指如下的部分，該部分中具有至少一種摻入其中的元素、同位素或功能團(tuán)，其能夠使該標(biāo)記物所附著的肽被檢測(cè)。標(biāo)記物可以是直接附著的(即通過(guò)化學(xué)鍵)，或者是通過(guò)接頭(例如環(huán)狀或非環(huán)狀、有分枝或無(wú)分枝、取代或未取代的亞烷基；環(huán)狀或非環(huán)狀、有分枝或無(wú)分枝、取代或未取代的亞烯基；環(huán)狀或非環(huán)狀、有分枝或無(wú)分枝、取代或未取代的亞炔基；環(huán)狀或非環(huán)狀、有分枝或無(wú)分枝、取代或未取代的雜亞烷基(heteroalkylene)；環(huán)狀或非環(huán)狀、有分枝或無(wú)分枝、取代或未取代的雜亞烯基(heteroalkenylene)；環(huán)狀或非環(huán)狀、有分枝或無(wú)分枝、取代或未取代的雜亞炔基(heteroalkynylene)；取代或未取代的亞芳基(arylene)；取代或未取代的雜亞芳基(heteroarylene)；或取代或未取代的亞酰基(arylene)，或其任何能夠形成接頭的組合)附著的。標(biāo)記物可以附著在肽的任何位置處，只要其不會(huì)干擾所檢測(cè)的本發(fā)明多肽的生物活性或特征即可。

標(biāo)記物可以包括：含有同位素部分的標(biāo)記物，同位素部分可以是放射性同位素或重同位素，包括但不僅限于，²h,³h,¹³c,¹⁴c,¹⁵n,³¹p,³²p,³⁵s,⁶⁷ga,^99mtc(tc-99m),¹¹¹in,¹²³i,¹²⁵i,¹⁶⁹yb,和¹⁸⁶re；包含免疫或免疫反應(yīng)性部分的標(biāo)記物，免疫或免疫反應(yīng)性部分可以是抗體或抗原，抗體或抗原可以和酶(例如辣根過(guò)氧化物酶)結(jié)合；有色、發(fā)光、磷光或包含熒光部分(例如熒光標(biāo)記物fitc)的標(biāo)記物；具備擁有一個(gè)或多個(gè)光親和部分的標(biāo)記物；具有一種或多種已知結(jié)合配偶的配體部分(例如生物素-鏈親和素、fk506-fkbp等)的標(biāo)記物。

在一些情況下，標(biāo)記物可以包含一種或多種光親和部分，用于直接闡明生物系統(tǒng)內(nèi)的分子間相互作用。可以采用多種已知的發(fā)光團(tuán)(photophore)，它們大多數(shù)依賴重氮化合物、疊氮化物、或雙吖丙啶(diazirine)向氮烯或碳烯的光轉(zhuǎn)化(見(jiàn)例如bayley,h.,photogeneratedreagentsinbiochemistryandmolecularbiology(1983),elsevier,amsterdam，本文引用其全部?jī)?nèi)容作為參考)。在本發(fā)明某些的實(shí)施方案中，所用的光親和標(biāo)記物是含有一個(gè)或多個(gè)鹵素取代的鄰-、間-和對(duì)-疊氮苯甲酰(azidobenzoyl)，包括但不僅限于，4-疊氮-2,3,5,6-四氟苯甲酸。

標(biāo)記物還可以是或者可以作為成像劑。成像劑的實(shí)例包括，但不僅限于，在正電子發(fā)射計(jì)算斷層掃描(pet)、計(jì)算機(jī)輔助斷層掃描(cat)、單光子發(fā)射計(jì)算斷層掃描、x-射線、熒光透視檢查(fluoroscopy)、和磁共振成像(mri)；抗嘔吐藥(anti-emetics)；和造影劑。診斷劑的實(shí)例包括，但不僅限于，熒光部分、發(fā)光部分、磁性部分、釓螯合物(例如釓與dtpa,dtpa-bma,dota和hp-do3a的螯合物)、鐵螯合物、鎂螯合物、錳螯合物、銅螯合物、鉻螯合物、用于cat和x-射線成像的碘基材料、和放射性核素。合適的放射性核素包括，但不僅限于，¹²³i,¹²⁵i,¹³⁰i,¹³¹i,¹³³i,¹³⁵i,⁴⁷sc,⁷²as,⁷²se,⁹⁰y,⁸⁸y,⁹⁷ru,¹⁰⁰pd,¹⁰¹mrh,¹¹⁹sb,¹²⁸ba,¹⁹⁷hg,²¹¹at,²¹²bi,²¹²pb,¹⁰⁹pd,¹¹¹in,⁶⁷ga,⁶⁸ga,⁶⁷cu,⁷⁵br,⁷⁷br,⁹⁹mtc,¹⁴c,¹³n,¹⁵0,³²p,³³p,和¹⁸f。

熒光和發(fā)光部分包括，但不僅限于，各種統(tǒng)稱為“染料”、“標(biāo)簽”或“指示劑”的不同有機(jī)或無(wú)機(jī)小分子。實(shí)例包括，但不僅限于，熒光素、若丹明、吖啶染料、alexa染料、花青染料等。熒光部分和發(fā)光部分可以包含多種天然存在的蛋白或其衍生物，例如遺傳工程變異體。例如，熒光蛋白包括綠色熒光蛋白(gfp)，增強(qiáng)的gfp，紅色、藍(lán)色、黃色、青色和藍(lán)寶石色熒光蛋白，珊瑚礁熒光蛋白，等。發(fā)光蛋白包括熒光素酶、水母發(fā)光蛋白及其衍生物。本領(lǐng)域已知有多種的熒光和發(fā)光染料和蛋白質(zhì)(見(jiàn)例如美國(guó)專利公開(kāi)2004/0067503；valeur,b.,"molecularfluorescence:principlesandapplications,"johnwileyandsons,2002；和handbookoffluorescentprobesandresearchproducts,molecularprobes,第9版,2002)。

如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“純化的”是指已經(jīng)被鑒定并與其自然環(huán)境組分分離和/或從其自然環(huán)境組分被回收的其它分子，如多肽、核酸分子。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是純化的抗體，其中它們已經(jīng)與其自然環(huán)境的一種或多種組分分離。

如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“表位”是指能夠結(jié)合抗體的蛋白決定簇。表位通常由分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)例如氨基酸或糖側(cè)鏈構(gòu)成，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，以及特定的電荷特征。構(gòu)象和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于，在去污劑存在下，與前者的結(jié)合喪失，而后者不會(huì)喪失。

在一些情況下，本公開(kāi)提供了對(duì)應(yīng)于(例如編碼)所公開(kāi)的肽(例如表1中公開(kāi)的肽)的核苷酸序列。這些序列包括與所公開(kāi)肽相關(guān)的所有簡(jiǎn)并序列，即具有編碼某個(gè)特定肽或其變異體或衍生物的序列的所有核酸。因此，盡管本文中可能沒(méi)有寫(xiě)出每個(gè)具體的核酸序列，但是應(yīng)當(dāng)理解，通過(guò)所公開(kāi)的多肽序列，本文中實(shí)際上公開(kāi)和描述了任何一個(gè)序列。

在一些情況下，所公開(kāi)的核酸可以包括表達(dá)載體。合適的載體的實(shí)例包括，但不僅限于，質(zhì)粒、人工染色體，例如bac、yac或pac，和病毒載體。

所提供的載體還可以包括，例如，復(fù)制原點(diǎn)和/或標(biāo)志物。標(biāo)志物基因可以為細(xì)胞提供一種可選擇的表型，例如抗生素抗性。標(biāo)志物產(chǎn)物用于確定該載體是否被輸送到細(xì)胞內(nèi)，以及一旦被輸送到細(xì)胞內(nèi)是否正在被表達(dá)。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的可選擇標(biāo)志物的實(shí)例是二氫葉酸還原酶(dhfr)、胸苷激酶、新霉素、新霉素類似物g418、潮霉素、嘌呤霉素和殺稻瘟素。當(dāng)這些可選擇標(biāo)記被成功轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí)，被轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞當(dāng)被置于選擇壓力下時(shí)能夠存活。其它標(biāo)記的實(shí)例包括，例如，大腸桿菌lacz基因、綠色熒光蛋白(gfp)和熒光素酶。此外，表達(dá)載體可以包括旨在便于操作或檢測(cè)(例如純化或定位)被表達(dá)多肽的標(biāo)簽序列。標(biāo)簽序列，如gfp、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(gst)、多聚組氨酸、c-myc、血凝素或flag^tm標(biāo)簽(kodak；newhaven,ct)序列，通常被表達(dá)作為與所表達(dá)多肽的融合物。這些標(biāo)簽可以被插入在多肽的任何位置，包括羧基端或氨基端。

在一些情況下，本公開(kāi)包括含有本文中所公開(kāi)核酸(例如載體)和/或肽的細(xì)胞。細(xì)胞可以包括，例如，真核和/或原核細(xì)胞。一般地，能夠在本文中使用的細(xì)胞可以從例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)(p.o.box1549,manassas,va20108)商業(yè)獲得。另見(jiàn)f.ausubeletal.,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,newyork,ny,(1998)?？捎糜诋a(chǎn)生本文中所公開(kāi)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染方法在例如f.ausubeletal.,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,newyork,ny,(1998)中有描述。

藥物制劑

在一些情況下，本文中公開(kāi)的治療組合物可以包括其它用于治療癌癥的化合物、藥物和/或試劑。這些化合物、藥物和/或試劑可以包括，例如，刺激針對(duì)給定癌癥的免疫應(yīng)答的化療藥、小分子藥物或抗體。在一些情況下，治療組合物可以包括，例如，本文中公開(kāi)的一種或多種肽和如下的一種或多種：抗-ctla-4抗體或肽、抗-pd-1抗體或肽、和/或抗-pdl-1抗體或肽。例如，在一些情況下，本文中公開(kāi)的治療組合物可以和一種或多種(例如1、2、3、4、5或少于10種)化合物組合。

在一些情況下，本文中公開(kāi)的治療組合物可以包括其它的化合物，包括組蛋白去乙?；敢种苿?“hdac”)抑制劑。hdac抑制劑的實(shí)例包括，例如，異羥肟酸、伏立諾他(vorinostat)(zolinza)、辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilidehydroxamicacid，saha)(merck)、曲古抑菌素(trichostatin)a(tsa)、laq824(novartis)、帕比司他(panobinostat)(lbh589)(novartis)、belinostat(pxd101)(curagen)、itf2357italfarmacospa(cinisello)、環(huán)四肽；depsipeptide(羅米地辛(romidepsin),fk228)(gloucesterpharmaceuticals)、苯甲酰胺；恩替諾特(entinostat)(sndx-275/ms-275)(syndaxpharmaceuticals)、mgcd0103(celgene)、短鏈脂肪族酸、丙戊酸(valproicacid)、丁酸苯酯、an-9、pivanex(titanpharmaceutical)、chr-3996(chromatherapeutics)和chr-2845(chromatherapeutics)。

在一些情況下，本文中公開(kāi)的治療組合物可以包括其它化合物，包括蛋白酶體抑制劑，包括例如bortezomib(millenniumpharmaceuticals)、npi-0052(nereuspharmaceuticals)、carfilzomib(pr-171)(onyxpharmaceuticals)、cep18770和mln9708。

在一些情況下，本文中公開(kāi)的治療組合物可以包括烷化劑如美法侖(mephalan)，并且拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑如阿霉素(adriamycin)(多柔比星)已經(jīng)顯示可提高mica表達(dá)，這可以提高抗-mica單克隆抗體的效力。

在一些情況下，本文中公開(kāi)的治療組合物可以配置為藥物組合物或者供藥物組合物中使用。這些組合物可以配置為或者調(diào)適為供通過(guò)任何路徑，例如由美國(guó)食品藥品管理局(fda)批準(zhǔn)的任何路徑，施用給受試者。方法的實(shí)例在fda的cder標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)手冊(cè)，004版(cderdatastandardsmanual,versionnumber004)(其可以在fda.give/cder/dsm/drg/drg00301.htm獲得)中有描述。

在一些情況下，藥物組合物可以包括有效量的一種或多種肽。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“有效量”和“治療有效的”是指一種或多種肽在一定時(shí)間內(nèi)(包括急性或慢性施用，和周期性或連續(xù)施用)內(nèi)能夠在其施用的具體情形下導(dǎo)致預(yù)期的效果或生理結(jié)果的量或濃度。

在一些情況下，藥物組合物可以包括一種或多種肽和任何可藥用的載體、佐劑和/或媒介(vehicle)。在一些情況下，藥物可以還包括一種或多種額外的治療劑，所述治療劑的量對(duì)實(shí)現(xiàn)疾病或疾病癥狀的調(diào)節(jié)是有效的。

術(shù)語(yǔ)“可藥用的載體或佐劑”是指可以和本發(fā)明肽一起施用給患者的載體或佐劑，它們不會(huì)破壞本發(fā)明肽的藥理活性，并且在施用足以輸送治療量的化合物的劑量下沒(méi)有毒性。

可以在本發(fā)明的藥物組合物中使用的可藥用的載體、佐劑和媒介包括，但不僅限于，離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，自乳化藥物輸送系統(tǒng)(sedds)如d-α-生育酚琥珀酸聚乙二醇1000琥珀酸酯，在藥物劑型中使用的表面活性劑如吐溫或其它類似的高分子輸送基質(zhì)，血清蛋白質(zhì)如人血清白蛋白，緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀，飽和植物油脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)，例如硫酸魚(yú)精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈉、鋅鹽，膠體二氧化硅，硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素類物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蠟，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂。也可以有利地使用環(huán)糊精如α-,β-,和γ-環(huán)糊精，用以提高本文中所述劑型化合物的輸送。

本發(fā)明的藥物組合物可以含有任何常規(guī)的無(wú)毒藥物可接受載體、佐劑或媒介。在一些情況下，制劑的ph可以用可藥用的酸、堿或緩沖液調(diào)節(jié)，以提高制劑化合物或其輸送形式的穩(wěn)定性。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“胃腸外”包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、病灶內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。

藥物組合物可以處于溶液或粉末形式，用于吸入和/或經(jīng)鼻給藥。這些組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的技術(shù)使用合適的分散劑或潤(rùn)濕劑(例如吐溫80)和懸浮劑加以制備。無(wú)菌的可注射制備物也可以是用無(wú)毒的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑制備的無(wú)菌可注射溶液或懸浮液，例如1,3-丁二醇中的溶液?？梢允褂玫目山邮苊浇楹腿軇┌ǜ事洞肌⑺?、林格氏溶液和等張氯化鈉溶液。此外，無(wú)菌不揮發(fā)油在傳統(tǒng)上用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為了這個(gè)目的，任何品牌的不揮發(fā)油均可使用，包括合成的單甘油酯或二甘油酯。脂肪酸，例如油酸及其甘油衍生物，可用于制備注射劑，同樣可以使用天然的可藥用的油，例如橄欖油或蓖麻油，特別是它們的聚氧乙烯化形式。這些油溶液或懸浮液也可以含有長(zhǎng)鏈醇稀釋劑或分散劑，或者通常在制備可藥用的劑量形式例如乳液和/或懸浮液時(shí)使用的羧甲基纖維素或類似的分散劑。為了制劑的目的，也可以使用其它通常使用的表面活性劑，例如吐溫或司盤(span)，和/或其它在制造可藥用的固體、液體或其它劑量形式時(shí)通常使用的類似的乳化劑或生物利用度增強(qiáng)劑。

藥物組合物能夠以任何經(jīng)口可接受的劑量形式經(jīng)口給藥，包括但不僅限于，膠囊、藥片、乳劑和水懸浮液、分散液和溶液。在使用藥片用于經(jīng)口給藥時(shí)，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。通常還會(huì)添加潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂。對(duì)于膠囊形式的經(jīng)口給藥，可用的稀釋劑包括乳糖和干燥的玉米淀粉。當(dāng)經(jīng)口給予水成懸浮液和/或乳劑時(shí)，活性成分可以被懸浮或溶解在油相中，并與乳化劑和/或懸浮劑組合。如果需要，可以添加某些甜味劑和/或芳香劑和/或著色劑。

或者/并且，藥物組合物可以通過(guò)鼻噴霧(nasalaerosol)或吸入給藥。這些組合物的制備是根據(jù)藥物制劑領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，并可以被制備成生理鹽水溶液，采用苯甲醇或其它合適的防腐劑，用以提高生物利用度的吸附促進(jìn)劑，碳氟化合物，和/或其它本領(lǐng)域已知的助溶劑或分散劑。

在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供了用于在如下的方法中使用本文中所公開(kāi)的一種或多種肽或藥物組合物(下文指示為“x”)的方法：

用作治療一種或多種本文中所公開(kāi)的狀況或疾病(例如癌癥，下面的實(shí)施例中稱作“y”)的藥物的物質(zhì)x。物質(zhì)x制備用于治療y的藥物的用途；和用于治療y的物質(zhì)x。

在一些情況下，本文中公開(kāi)的治療組合物可以被制備用于在美國(guó)銷售，進(jìn)口到美國(guó)，和/或從美國(guó)出口。

方法

在一些情況下，方法可以包括選擇患有或者曾經(jīng)患有狀況或疾病、并對(duì)該狀況或疾病顯示或曾經(jīng)顯示陽(yáng)性免疫應(yīng)答的人類受試者。在一些情況下，合適的受試者包括，例如，患有或曾經(jīng)患有狀況或疾病、但已解決該疾病或其某個(gè)方面，顯示減輕的疾病癥狀(例如與其它患有相同狀況或疾病的受試者(例如大部分受試者)相比)，和/或攜帶該狀況或疾病(例如與其它患有相同狀況或疾病的受試者(例如大部分受試者)相比)存活了更長(zhǎng)時(shí)間，例如無(wú)癥狀狀態(tài)(例如與其它患有相同狀況或疾病的受試者相比(例如大部分受試者))的受試者。在一些情況下，如果受試者已經(jīng)接種了針對(duì)該狀況或疾病的疫苗(例如先前已經(jīng)接種疫苗和/或接種和再接種疫苗(例如接受了加強(qiáng)疫苗(boostervaccine)))，則該受試者可以被選擇。

如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“受試者”是指任何動(dòng)物。在一些情況下，受試者是哺乳動(dòng)物。在一些情況下，如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“受試者”是指人(例如男人、女人或小孩)。用于在方法中使用的樣品可以包括血清樣品，例如從所選受試者獲得的血清樣品。

在一些情況下，受試者選擇可以包括從受試者(例如候選受試者)獲得樣品，并檢測(cè)樣品是否具有受試者適合被選擇的指征。在一些情況下，受試者可以被確認(rèn)或鑒定(例如由醫(yī)療保健專業(yè)人員確認(rèn)或鑒定)為曾經(jīng)患有或現(xiàn)在患有某種狀況或疾病。在一些情況下，可以根據(jù)患者記錄、家族歷史、和/或檢測(cè)陽(yáng)性免疫應(yīng)答的指征，來(lái)顯示針對(duì)某種狀況或疾病的陽(yáng)性免疫應(yīng)答。在一些情況下，受試者的選擇可以有多方參與。例如，可以由第一方從候選受試者獲得樣品，由第二方檢測(cè)樣品。在一些情況下，受試者可以是醫(yī)療從業(yè)人員(例如全科醫(yī)生)選擇和/或安排的。在一些情況下，受試者選擇可以包括從所選受試者獲得樣品，保存樣品，和/或在本文中公開(kāi)的方法中使用。樣品可以包括，例如，細(xì)胞或細(xì)胞群體。

在一些情況下，獲得或靶定免疫細(xì)胞可以包括例如如下的一個(gè)或多個(gè)或其組合：獲得或提供能夠結(jié)合(例如特異性結(jié)合)靶免疫細(xì)胞的四聚體免疫原；使該四聚體免疫原與樣品接觸；檢測(cè)該四聚體免疫原；確定該四聚體免疫原是否與靶免疫細(xì)胞結(jié)合；和如果四聚體免疫原與靶免疫細(xì)胞結(jié)合，則獲得靶免疫細(xì)胞。

四聚體免疫原可以包括與狀況或疾病相關(guān)的和/或與靶免疫細(xì)胞結(jié)合(例如特異性結(jié)合)的免疫原，例如其中靶免疫細(xì)胞與選定的狀況或疾病相關(guān)。與某種狀況或疾病相關(guān)的免疫原和靶免疫細(xì)胞包括，例如，存在于患有某種狀況或疾病的受試者體內(nèi)、但不存在于沒(méi)有該狀況或疾病的受試者體內(nèi)的免疫原或免疫細(xì)胞；和/或存在于與沒(méi)有該狀況或疾病的受試者相比，在某種狀況或疾病方面的水平有所改變(例如增加)的受試者體內(nèi)的免疫原或免疫細(xì)胞。在一些情況下，免疫原或免疫細(xì)胞可以是癌癥特異性的。免疫原可以是可溶的。四聚體免疫原可以包括四聚體(包括例如四聚體化的單體、二聚體和/或三聚體抗原免疫原(例如抗原和/或表位)的)。在一些情況下，四聚體免疫原與非四聚體化形式的免疫原相比，在相同條件下，與細(xì)胞的結(jié)合水平增加。在一些情況下，四聚體免疫原包括可檢測(cè)部分，例如鏈親和素部分。四聚體化方法是本領(lǐng)域已知的，并在本文中公開(kāi)。

四聚體免疫原和/或四聚體免疫原是否與靶細(xì)胞結(jié)合，可以使用本領(lǐng)域已知的和/或本文中公開(kāi)的方法來(lái)加以檢測(cè)。例如，方法可以包括流式細(xì)胞術(shù)。用于流式細(xì)胞術(shù)的優(yōu)化方法，包括分選和設(shè)門方法，是本領(lǐng)域已知的和/或在本文中公開(kāi)。在一些情況下，方法可以包括分析四聚體免疫原與靶免疫細(xì)胞之間結(jié)合、結(jié)合親和力、和/或結(jié)合特異性的水平。例如，當(dāng)(例如僅當(dāng))確定四聚體免疫原與靶免疫細(xì)胞之間具有預(yù)定的結(jié)合水平時(shí)，能夠獲得靶免疫細(xì)胞。預(yù)定的結(jié)合水平可以是具體的水平，和/或可以是相對(duì)水平。獲得靶免疫細(xì)胞包括獲得、提供、鑒定、選擇、純化和/或分離靶免疫細(xì)胞。這些方法可以包括，例如，細(xì)胞分選方法、細(xì)胞富集、和/或背景降低。

在一些情況下，獲得針對(duì)自身抗原的免疫細(xì)胞可以包括例如如下的一者或多者和/或其組合：鑒定對(duì)自身抗原顯示陽(yáng)性免疫應(yīng)答的受試者；獲得或提供多聚體形式的自身抗原；使多聚體形式的自身抗原與來(lái)自對(duì)該自身抗原顯示陽(yáng)性免疫應(yīng)答的受試者的樣品接觸；獲得與多聚體形式的自身抗原結(jié)合的免疫細(xì)胞。

在一些情況下，方法可以包括從癌癥患者獲得針對(duì)自身抗原的免疫細(xì)胞，可以包括例如如下的一者或多者和/或其組合：鑒定對(duì)自身抗原顯示陽(yáng)性免疫應(yīng)答的受試者；提供多聚體形式的自身抗原；使多聚體形式的自身抗原與來(lái)自對(duì)該自身抗原顯示陽(yáng)性免疫應(yīng)答的受試者的樣品接觸；和獲得與多聚體形式的自身抗原結(jié)合的免疫細(xì)胞。

多聚體形式的自身抗原可以包括與狀況或疾病相關(guān)和/或結(jié)合(例如特異性結(jié)合)靶免疫細(xì)胞的自身抗原，例如其中靶免疫細(xì)胞與所選狀況或疾病相關(guān)。與狀況或疾病相關(guān)的自身抗原和靶免疫細(xì)胞包括，例如，存在于患有某種狀況或疾病的受試者體內(nèi)、但不存在于沒(méi)有該狀況或疾病的受試者體內(nèi)的抗原或免疫細(xì)胞；和/或存在于與沒(méi)有該狀況或疾病的受試者相比，在具有某種狀況或疾病的受試者中的水平有所改變(例如增加)的免疫原或免疫細(xì)胞。在一些情況下，狀況或疾病可以是癌癥。在一些情況下，癌癥是黑素瘤、肺癌、乳腺癌、腎癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌和結(jié)腸癌、淋巴瘤或白血病。在一些情況下，自身抗原或免疫細(xì)胞可以是癌癥特異性的。自身抗原可以是可溶的。多聚體免疫原可以包括自身抗原(例如抗原和/或表位)的四聚體形式(包括例如四聚體化的單體、二聚體和/或三聚體抗原)。在一些情況下，多聚體形式的自身抗原包括可檢測(cè)部分，例如鏈親和素部分。多聚體化方法是本領(lǐng)域已知的，并在本文中公開(kāi)。

用于從所得靶免疫細(xì)胞分離或純化遺傳材料(例如dna和/或rna)的方法是本領(lǐng)域已知的并在本文中舉例說(shuō)明。一旦獲得了這些遺傳材料，使用它產(chǎn)生本文中所公開(kāi)的治療組合物的方法是技術(shù)上已知的和/或在下文中有總結(jié)。如上面討論的，遺傳材料可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)加以改變，以產(chǎn)生本文中公開(kāi)的肽變異體。

自靶細(xì)胞中含有的或從靶細(xì)胞獲得的核酸(例如cdna)產(chǎn)生肽，可以包括例如分析，例如測(cè)序來(lái)自靶免疫細(xì)胞(例如單一或分離的已鑒定靶免疫細(xì)胞)的重鏈和輕鏈可變區(qū)。在一些情況下，方法可以包括產(chǎn)生完全的人抗體或其片段(例如上面討論的)，和人源化非人抗體。dna可以使用傳統(tǒng)規(guī)程(例如使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)容易地從所得的免疫細(xì)胞分離和/或測(cè)序。

一旦分離，便可以將dna置于表達(dá)載體內(nèi)，其然后被轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞、猿cos細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞或自身不會(huì)產(chǎn)生抗體蛋白的骨髓瘤細(xì)胞，從而在重組宿主細(xì)胞內(nèi)合成單克隆抗體。關(guān)于在細(xì)菌內(nèi)重組表達(dá)編碼抗體的dna的綜述文獻(xiàn)包括skerraetal.,curr.opinioninimmunol.,5:256-262(1993)和pluckthun,immunol.revs.,130:151-188(1992)。

抗體或其變異體的重組表達(dá)一般需要構(gòu)建含有編碼該抗體的多核苷酸的表達(dá)載體。因此，本發(fā)明提供了可復(fù)制的載體，其包含與啟動(dòng)子操作連接的編碼抗體分子、抗體的重鏈或輕鏈、抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū)或其一部分、或重鏈或輕鏈cdr的核苷酸序列。這些載體可以包括編碼抗體分子恒定區(qū)的核苷酸序列(見(jiàn)例如美國(guó)專利nos.5,981,216；5,591,639；5,658,759和5,122,464)，并且可以將抗體的可變域克隆到這種載體中，用于表達(dá)整個(gè)重鏈、整個(gè)輕鏈、或同時(shí)表達(dá)完整的重鏈和輕鏈。

一旦通過(guò)傳統(tǒng)技術(shù)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)，即通過(guò)常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞以產(chǎn)生抗體。因此，本發(fā)明包括含有與異源啟動(dòng)子操作連接的編碼本發(fā)明抗體或其片段、或其重鏈或輕鏈、或其一部分、或本發(fā)明單鏈抗體的多核苷酸。在用于表達(dá)雙鏈抗體的某些實(shí)施方案中，可以在宿主細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)編碼重鏈和輕鏈二者的載體，用于表達(dá)完整的免疫球蛋白分子，如下文所詳述的。

可獲得作為表達(dá)重組抗體的宿主的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括許多可以從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)獲得的永生化細(xì)胞系，包括但不僅限于，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞、hela細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(bhk)細(xì)胞、猴腎(cos)細(xì)胞、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如hepg2)、人腎上皮細(xì)胞293細(xì)胞和若干其它的細(xì)胞系。不同宿主細(xì)胞在翻譯后加工和蛋白和基因產(chǎn)物的修飾方面具有獨(dú)特和具體的機(jī)制?？梢赃x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以確保所表達(dá)抗體或其部分的正確修飾和加工。為此，可以使用真核宿主細(xì)胞，其具有用于正確加工最初轉(zhuǎn)錄本、基因產(chǎn)物的糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)制。這些哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括，但不僅限于，cho,very,bhk,hela,cos,mdck,293,3t3,w138,bt483,hs578t,htb2,bt2o和t47d,ns0(一種不會(huì)內(nèi)源產(chǎn)生任何有功能的免疫球蛋白鏈的鼠骨髓瘤細(xì)胞系),sp20,crl7o3o和hss78bst細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用通過(guò)使人淋巴細(xì)胞永生化而開(kāi)發(fā)出的人細(xì)胞系，用于重組產(chǎn)生單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用人細(xì)胞系per.c6.(crucell,netherlands)重組產(chǎn)生單克隆抗體。

在一些情況下，本文中公開(kāi)的肽可以合成產(chǎn)生?？捎糜诤铣杀疚闹兴鲭牡暮铣苫瘜W(xué)改性(transformation)和保護(hù)基團(tuán)方法學(xué)(保護(hù)和去保護(hù))是本領(lǐng)域已知的，并且包括，例如，在下列文獻(xiàn)中描述的方法：r.larock,comprehensiveorganictransformations,vchpublishers(1989)；t.w.greeneandp.g.m.wuts,protectivegroupsinorganicsynthesis,第3版,johnwileyandsons(1999)；l.fieserandm.fieser,fieserandfieser'sreagentsfororganicsynthesis,johnwileyandsons(1994)；和l.paquette編輯,encyclopediaofreagentsfororganicsynthesis,johnwileyandsons(1995),和其后續(xù)版本。

肽還可以通過(guò)化學(xué)合成方法制備，這是普通技術(shù)人員眾所周知的。見(jiàn)例如fields等,chapter3insyntheticpeptides:auser'sguide,ed.grant,w.h.freeman&co.,newyork,n.y.,1992,第77頁(yè)。因此，肽可以在例如430a或431型appliedbiosystems肽合成儀上使用自動(dòng)化merrifield固相合成技術(shù)合成，用側(cè)鏈被保護(hù)的氨基酸通過(guò)t-boc或fmoc化學(xué)保護(hù)α-nh2。

一種制造本文中所述肽的方式是使用固相肽合成(spps)。c端氨基酸用接頭分子通過(guò)酸不穩(wěn)定的化學(xué)鍵附著到交聯(lián)的聚苯乙烯樹(shù)脂上。該樹(shù)脂在用于合成的溶劑中是不溶的，這樣就能夠相對(duì)簡(jiǎn)單而快速地沖洗掉過(guò)量的試劑和副產(chǎn)物。n端用fmoc基團(tuán)保護(hù)，該基團(tuán)在酸中是穩(wěn)定的，但是可以被堿除去。任何側(cè)鏈功能基團(tuán)用堿穩(wěn)定但酸不穩(wěn)定的基團(tuán)保護(hù)。

至于更長(zhǎng)的肽，可以使用自然化學(xué)連接通過(guò)聯(lián)合單獨(dú)合成的肽來(lái)制備?？蛇x擇地，可以通過(guò)眾所周知的重組dna技術(shù)合成更長(zhǎng)的合成肽。這些技術(shù)的詳細(xì)規(guī)程在眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)中有提供。為了構(gòu)建編碼本發(fā)明肽的基因，將氨基酸序列逆向翻譯，以獲得編碼該氨基酸序列的核酸序列，優(yōu)選地對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化，以適應(yīng)待表達(dá)該基因的生物體。接著，制備合成基因，這通常是合成編碼肽和(如果必需的話)任何調(diào)節(jié)元件的寡核苷酸。將合成基因插入到合適克隆載體內(nèi)，并轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞。然后在合適的適合于所選表達(dá)系統(tǒng)和宿主的條件下表達(dá)肽。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)肽進(jìn)行純化和表征。

肽可以以高通量、組合方式制備，例如使用可以從advancedchemtech獲得的高通量多通道組合合成儀。

肽鍵可以被如下的化學(xué)鍵替換以便，例如，提高肽的生理穩(wěn)定性：逆-反鍵(retro-inversobond)(c(o)-nh)；還原的酰胺鍵(nh-ch2)；硫代亞甲基鍵(s-ch2或ch2-s)；氧代亞甲基鍵(o-ch2或ch2-o)；乙烯鍵(ch2-ch2)；硫代酰胺鍵(c(s)-nh)；反式-烯鍵(ch＝ch)；氟取代的反式-烯鍵(cf＝ch)；酮亞甲基鍵(c(o)-chr)或chr-c(o)，其中r是h或ch3；和氟-酮亞甲基鍵(c(o)-cfr或cfr-c(o)，其中r是h或f或ch3。

肽可以進(jìn)一步被如下修飾：乙?；Ⅴ０坊?、生物素化、肉桂酰化、法尼基化、熒光素化、甲?；⑷舛罐Ⅴ；?、棕櫚?；⒘姿峄?ser、tyr或thr)、硬脂?；㈢牾；突酋；Ｈ缟纤?，肽可以偶聯(lián)于，例如，聚乙二醇(peg)；烷基(例如c1-c20直鏈或分枝烷基)；脂肪酸殘基；及其組合。

在一些情況下，肽可以通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的用于純化免疫球蛋白分子的方法進(jìn)行純化，例如通過(guò)色譜(例如離子交換色譜，親和色譜，特別是對(duì)特定抗原蛋白a或蛋白g的親和色譜，和大小排阻柱色譜)、離心、差異溶解度，或通過(guò)任何其它用于純化蛋白的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。進(jìn)一步，本發(fā)明的抗體或其片段可以和上文描述的或本領(lǐng)域已知的異源多肽序列(本文中稱作“標(biāo)簽”)融合，以便于純化。

圖21顯示了一個(gè)示例性、非限制性的方法概覽。不暗含次序。

使用方法

在一些情況下，本公開(kāi)提供了治療方法，其包括向受試者施用本文中公開(kāi)的組合物。

本文中提供了用于治療和/或預(yù)防受試者體內(nèi)癌癥或癌癥癥狀的方法，包括向受試者施用治療有效量的、包含與mhci類多肽相關(guān)序列a(mica)免疫特異性結(jié)合的肽的組合物，其中肽包含具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換的表1所示的抗體id1,6,7,8或9的vh的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)，和具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換的表1所示的抗體id1,6,7,8或9的vl的cdr3。在一些實(shí)施方案中，癌癥是與mica過(guò)表達(dá)相關(guān)的癌癥。在一些實(shí)施方案中，癌癥是黑素瘤、肺癌、乳腺癌、腎癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌和結(jié)腸癌、淋巴瘤或白血病。在一些實(shí)施方案中，癌癥是黑素瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥是漿細(xì)胞惡性腫瘤，例如多發(fā)性骨髓瘤(mm)或漿細(xì)胞惡變前狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，受試者被診斷患有癌癥或者有患癌癥的傾向。

在一些情況下，本公開(kāi)提供了用于治療和/或預(yù)防受試者體內(nèi)癌癥或癌癥癥狀的方法，包括向受試者施用治療有效量的、包含與mhci類多肽相關(guān)序列a(mica)特異性結(jié)合的分離抗體的組合物，其中所述抗體包含：重鏈可變區(qū)(vh)，其包含seqidno:11,149,168,186或204的vh序列所示的vhcdr1,vhcdr2,和vhcdr3；和seqidno:4,151,170,189或206的輕鏈可變區(qū)(vl)序列。

本文中還提供了用于治療和/或預(yù)防受試者體內(nèi)癌癥或癌癥癥狀的方法，包括向受試者施用治療有效量的、與促血管發(fā)生素免疫特異性結(jié)合的肽，其中肽包含具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換的表1所示的抗體id2,3,4或5或10的vh的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)，和具有5個(gè)或更少的保守氨基酸替換的表1所示的抗體id2,3,4或5的vl的cdr3。在一些實(shí)施方案中，癌癥是與mica過(guò)表達(dá)相關(guān)的癌癥。在一些實(shí)施方案中，癌癥是黑素瘤、肺癌、乳腺癌、腎癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌和結(jié)腸癌、淋巴瘤或白血病。在一些實(shí)施方案中，癌癥是黑素瘤。在一些實(shí)施方案中，癌癥是漿細(xì)胞惡性腫瘤，例如多發(fā)性骨髓瘤(mm)或漿細(xì)胞惡變前狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，受試者被診斷患有癌癥或者有患癌傾向。

在一些情況下，本公開(kāi)提供了用于治療和/或預(yù)防受試者體內(nèi)癌癥或癌癥癥狀的方法，包括向受試者施用治療有效量的、包含與促血管發(fā)生素(例如促血管發(fā)生素-2)特異性結(jié)合的分離抗體的組合物，其中所述抗體包含：重鏈可變區(qū)(vh)，其包含seqidno:20,38,56,74,222的vh序列所示的vhcdr1,vhcdr2,和vhcdr3；和29,47,65,83,或224的輕鏈可變區(qū)(vl)序列。

癌癥的癥狀是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，并且包括，但不僅限于，不常見(jiàn)的痣(mole)特征，痣的外形改變，包括不對(duì)稱、邊界(border)、顏色和/或直徑(diameter)的變化，新著色的皮膚區(qū)域，異常的痣，指/趾甲(nail)下暗區(qū)域，乳房腫塊，乳頭變化，乳房囊腫，乳房疼痛，死亡，體重減輕，虛弱，過(guò)度疲勞，進(jìn)食困難，食欲不振，長(zhǎng)期咳嗽，呼吸困難，咳血，尿中帶血，便血，惡心，嘔吐，肝轉(zhuǎn)移，肺轉(zhuǎn)移，骨轉(zhuǎn)移，腹?jié)M，腹脹，腹腔積液，陰道出血，便秘，腹脹，結(jié)腸穿孔，急性腹膜炎(感染、發(fā)燒、疼痛)，疼痛，嘔血，大量出汗，發(fā)熱，高血壓，貧血，腹瀉，黃疸，頭暈，寒戰(zhàn)，肌肉痙攣，結(jié)腸轉(zhuǎn)移，肺轉(zhuǎn)移，膀胱轉(zhuǎn)移，肝轉(zhuǎn)移，骨轉(zhuǎn)移，腎臟轉(zhuǎn)移，和胰腺轉(zhuǎn)移，吞咽困難，等。

本文中公開(kāi)的方法能夠應(yīng)用于多種物種，例如人、非人靈長(zhǎng)動(dòng)物(例如猴)、馬、牛、豬、綿羊、鹿、麋鹿、山羊、狗、貓、鼬科動(dòng)物、家兔、豚鼠、倉(cāng)鼠、大鼠和小鼠。

如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療”是指部分或完全消除、抑制、減輕和/或緩解受試者所罹患的狀況或疾病。在一些情況下，治療可導(dǎo)致受試者所罹患的狀況或疾病持續(xù)不存在。

一般地，方法包括選擇患有或者具有罹患某種狀況或疾病的危險(xiǎn)的受試者。在一些情況下，受試者的狀況或疾病能夠用本文中公開(kāi)的藥物組合物進(jìn)行治療。例如，在一些情況下，方法包括選擇患有癌癥的受試者，例如其中受試者的癌癥能夠通過(guò)靶定mica和/或促血管發(fā)生素-2的一種或兩種加以治療。

在一些情況下，治療方法可以包括根據(jù)對(duì)患者所患狀況或疾病的預(yù)防或治療的需要進(jìn)行單次給藥、多次給藥和重復(fù)給藥。在一些情況下，治療方法可以包括在治療前、治療中和/或治療后對(duì)受試者體內(nèi)的疾病水平進(jìn)行評(píng)估。在一些情況下，治療能夠持續(xù)，直至檢測(cè)到受試者體內(nèi)的疾病水平被降低。

如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“施用”或“給藥”是指植入、吸收、消化、注射、吸入本發(fā)明的肽，而不管其形式如何。在一些情況下，可以向受試者局部(例如經(jīng)鼻)和/或經(jīng)口施用本文中所公開(kāi)的一種或多種肽。例如，本文中的方法包括施用有效量的化合物或化合物組合物，以實(shí)現(xiàn)期望的或所述的效果。對(duì)于任何具體患者的具體劑量和治療方案取決于多種因素，包括所用具體化合物的活性、年齡、體重、一般健康狀態(tài)、性別、飲食、給藥時(shí)間、排泄速度、藥物組合，疾病、狀況或病癥的嚴(yán)重程度和進(jìn)程，患者對(duì)疾病、狀況或病癥的傾向(disposition)，和治療醫(yī)師的判斷。

給藥后，可以對(duì)受試者進(jìn)行評(píng)估，檢查、評(píng)估或確定其疾病的水平。在一些情況下，治療可以持續(xù)，直至檢測(cè)到受試者的疾病水平發(fā)生改變(例如減輕)。

當(dāng)患者的病情發(fā)生改善(例如受試者體內(nèi)的疾病水平發(fā)生改變(例如降低))時(shí)，如果需要，可以施用維持劑量的本發(fā)明化合物、組合物或其組合。隨后，根據(jù)狀況的情況，劑量或給藥頻率或者兩者可以降低到可以維持該被改善的狀況的水平。然而，在任何疾病癥狀復(fù)發(fā)時(shí)，患者可能需要長(zhǎng)期的間歇性治療。

在一些情況下，本公開(kāi)提供了用于檢測(cè)來(lái)自人類受試者的免疫細(xì)胞，例如b細(xì)胞和/或記憶b細(xì)胞的方法。這些方法可以在例如某一事件發(fā)生后，用于例如監(jiān)視人類受試者體內(nèi)免疫細(xì)胞如b細(xì)胞和/或記憶b細(xì)胞的水平。事件實(shí)例可以包括，但不僅限于，檢測(cè)到疾病、感染；施用本文中公開(kāi)的治療組合物，施用治療劑或治療方案，施用疫苗，誘發(fā)免疫應(yīng)答。這些方法可作應(yīng)用于臨床和/或用于研究。

實(shí)施例

本發(fā)明在下面的實(shí)施例中被進(jìn)一步描述，其并不對(duì)權(quán)利要求所述的本發(fā)明范圍構(gòu)成限制。

本文中所述的方法允許從有限量的外周血液中靈敏、特異且可靠地檢測(cè)具有限定抗原特異性的稀有b細(xì)胞。方法允許在抗原被清除(cleared)之后數(shù)月到數(shù)年的時(shí)間內(nèi)可視化和分離記憶b細(xì)胞。

本文中所公開(kāi)方法的原理證明使用破傷風(fēng)類毒素c片段(ttcf)的四聚體建立，該片段在franz等(blood,118(2):348-357(2011))中有詳細(xì)報(bào)道，本文引用其全部?jī)?nèi)容作為參考。

選擇ttcf(即52kda、無(wú)毒、ttcf的c端片段)作為模型抗原是因?yàn)榇蟛糠謧€(gè)體已經(jīng)接種了破傷風(fēng)類毒素疫苗，并且該疫苗誘發(fā)持久的igg抗體滴度(amannaetal.,n.engl.j.med.,357:1903-1915,2007)。因此，使用ttcf提供了很大的受試者群體，可以在他們中間對(duì)本文中所公開(kāi)的方法進(jìn)行驗(yàn)證。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，本文中的方法可以用常規(guī)技術(shù)加以調(diào)適以包含任何疾病相關(guān)抗原。如下面實(shí)施例中證明的，這些調(diào)適已經(jīng)通過(guò)獲得針對(duì)癌相關(guān)抗原mica和促血管發(fā)生素-2的抗體而得以實(shí)現(xiàn)。

實(shí)施例1：抗原表達(dá)和四聚體形成

如下文中將進(jìn)一步詳細(xì)描述的，ttcf在大腸桿菌中表達(dá)，在n端附加一個(gè)bira位點(diǎn)，用于通過(guò)bira酶進(jìn)行位點(diǎn)特異性單生物素化。在蛋白與生物素化位點(diǎn)之間設(shè)置一個(gè)柔性接頭，以防止抗體結(jié)合的空間位阻。ttcf通過(guò)陰離子交換色譜純化，用bira生物素化，并通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜與游離的生物素和bira分離。通過(guò)將帶有熒光標(biāo)簽的鏈親和素與生物素化的ttcf抗原以1:4的摩爾比進(jìn)行溫育，產(chǎn)生ttcf四聚體。然后，將這些四聚體與一組mab聯(lián)合使用，用于鑒定破傷風(fēng)類毒素特異的記憶b細(xì)胞。

將ttcf克隆在pet-15b(novagen)中。在bl21(de3)大腸桿菌中用1mm異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)28℃誘導(dǎo)蛋白表達(dá)4小時(shí)。清洗、裂解細(xì)胞，并收集所得的懸浮液。用his-select親和柱(sigma)純化ttcf。通過(guò)蛋白酶解除去his標(biāo)簽。用相似的方法制備鼠cd80近膜區(qū)。將蛋白單生物素化。對(duì)于某些實(shí)驗(yàn)，將alexa-488染料分子(molecularprobes)連接在生物素化的ttcf或cd80的伯胺上。

將生物素化的抗原與用優(yōu)質(zhì)級(jí)pe標(biāo)記的鏈親和素(molecularprobes)在冰上以4:1的摩爾比溫育至少20分鐘，來(lái)制備抗原四聚體。使用前，對(duì)四聚體制備物進(jìn)行離心以除去聚集體。在一些實(shí)驗(yàn)中，四聚體用alexa-fluor-488標(biāo)記的抗原和非熒光鏈親和素以4:1的比例形成。

實(shí)施例2：鑒定方法

方法如franz等.,blood,118(2):348-357(2011)所述實(shí)施。

細(xì)胞在bdfacsariaii細(xì)胞分選器上進(jìn)行分選。細(xì)胞被單細(xì)胞分選。樣品首先以cd19⁺細(xì)胞設(shè)門，其對(duì)一系列排除標(biāo)志物(cd3,cd14,cd16,7aad)而言是陰性的；然后以漿母細(xì)胞設(shè)門，通過(guò)高水平的cd27和直接水平(immediatelevel)的cd19表達(dá)進(jìn)行鑒定，最后以四聚體⁺cd19⁺細(xì)胞進(jìn)行設(shè)門。

由于記憶b的頻率低，所以必須盡可能仔細(xì)地降低背景。首先通過(guò)陰性篩選(針對(duì)cd2,cd3,cd14,cd16,cd56和血型糖蛋白a的抗體雞尾酒)對(duì)b細(xì)胞進(jìn)行富集，以除去大多數(shù)非特異性結(jié)合四聚體的細(xì)胞。將經(jīng)過(guò)富集的細(xì)胞平均分組，并用ttcf或?qū)φ账木垠w染色，隨后用cd19、cd27和igm進(jìn)行標(biāo)記，以特異性地篩選經(jīng)過(guò)類別轉(zhuǎn)換的記憶b細(xì)胞。設(shè)門策略考慮到了如下的類型轉(zhuǎn)換證據(jù)，即cd19的表達(dá)、以一組排除標(biāo)志物(cd3,cd14,cd16,7aad)缺少標(biāo)記、記憶標(biāo)志物cd27的表達(dá)和igm表達(dá)的缺少。將四聚體染色相對(duì)于cd27染色進(jìn)行描點(diǎn)作圖，以便可視化具有感興趣的抗原特異性的記憶b細(xì)胞。將四聚體陽(yáng)性b細(xì)胞直接分選到含有3μlmrna提取緩沖液的pcr連排反應(yīng)管中。

在分選期間，試管保持低溫，將所分選的細(xì)胞冷凍，并保存于-80℃。使用cd19+cd27+igm-b細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。

使用先前報(bào)道的巢式pcr規(guī)程來(lái)擴(kuò)增重鏈和輕鏈可變節(jié)段(wangetal.,j.immunol.methods.,244:217-225,2000)。在適合于使污染最小化的條件下實(shí)施mrna擴(kuò)增。所用的引物包括：

taatacgactcactataggttcggggaagtagtccttgaccagg(seqidno:91)；

taatacgactcactatagggatagaagttattcagcaggcacac(seqidno:92)；

taatacgactcactataggcgtcaggctcagrtagctgctggccgc(seqidno:93).

巢式rt-pcr如franz等,blood,118(2):348-357(2011)所述實(shí)施。

包含陰性對(duì)照以監(jiān)視和確保排除污染。從總共35個(gè)用ttcf四聚體標(biāo)記的單細(xì)胞擴(kuò)增出了32個(gè)重鏈節(jié)段和30個(gè)輕鏈節(jié)段，并從凝膠純化的pcr產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，這相當(dāng)于89％的整體pcr效率。序列分析顯示，ttcf四聚體⁺細(xì)胞采用多種不同的vhd-jh基因節(jié)段，沒(méi)有某個(gè)特定的基因節(jié)段占主導(dǎo)地位。所觀察的序列支持如下結(jié)論：這些克隆代表了由于體細(xì)胞高頻突變導(dǎo)致的多樣化的細(xì)胞。

抗體產(chǎn)生和純化包括將重鏈和輕鏈可變域dna克隆到不同的pcdna3.3表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體含有牛催乳素信號(hào)肽序列以及全長(zhǎng)igg1重鏈或κ輕鏈恒定區(qū)。在100ml轉(zhuǎn)瓶中，在補(bǔ)充有8mmglutamax(gibco)的cho-s培養(yǎng)基(invitrogen)內(nèi)，在37℃、8％co2的條件下表達(dá)抗體。在轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞分成6x10⁵細(xì)胞/ml。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，如果需要，將細(xì)胞調(diào)節(jié)為1x10⁶細(xì)胞/ml。用max轉(zhuǎn)染試劑(invitrogen)共轉(zhuǎn)染25μg重鏈和輕鏈質(zhì)粒dna，并將被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)6-8天。用蛋白gsepharose珠子獲得蛋白質(zhì)，用100mm甘氨酸ph2.5洗脫抗體，并用spin-x離心管將抗體與珠子分離。用microbio-spin柱(biorad)，將純化的抗體交換到磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中。蛋白濃度通過(guò)280nm吸光度進(jìn)行估算。

對(duì)于飽和結(jié)合測(cè)定法，用銪標(biāo)記未生物素化的、monoq純化的ttcf，并除去游離的銪。用配制于100mmnahco3緩沖液ph9.6中的20ng抗體/孔過(guò)夜包被96孔平底板。用含有牛血清白蛋白(bsa)和牛γ球蛋白的測(cè)試緩沖液進(jìn)行封閉。ttcf-銪用測(cè)試緩沖液稀釋(100nm-4pm)，每孔添加200μl，一式三份重復(fù)。平板在37℃溫育2小時(shí)，用200μl洗脫緩沖液(50mmtrisph8,150mmnacl,20μmedta,0.05％吐溫)清洗三次。向每孔添加100μl強(qiáng)化溶液，用victor³酶標(biāo)儀在615nm測(cè)量熒光計(jì)數(shù)。

重鏈和輕鏈可變域序列用imgt/v-quest和jionsolver軟件進(jìn)行分析。流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)用flowjo分析軟件進(jìn)行評(píng)估。統(tǒng)計(jì)分析用graphpadprism5軟件使用非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行。為了確定抗體kd值，用graphpadprism5軟件使用非線性回歸分析對(duì)飽和結(jié)合數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。

實(shí)施例3：多聚體化提高記憶b細(xì)胞的鑒定

對(duì)四聚體和單體ttcf進(jìn)行比較。ttcf用alexa-488進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后以單體形式使用或者用未標(biāo)記的鏈親和素轉(zhuǎn)變?yōu)樗木垠w(見(jiàn)上文)后使用。然后，將富集的b細(xì)胞用四聚體或單體ttcf-alexa-488以相同的濃度進(jìn)行溫育。對(duì)照蛋白(cd80近膜域)用相同方式標(biāo)記，也作為四聚體使用。

如圖22a和22b所示，使用來(lái)自三個(gè)供體的細(xì)胞，ttcf標(biāo)記了一些記憶b細(xì)胞，但是用四聚體鑒定的頻率要大得多(1.6-7.3倍)。在三個(gè)供體的其中一個(gè)中，ttcf特異性記憶b細(xì)胞能夠用四聚體檢測(cè)到，但是不能用單體檢測(cè)到。

這些結(jié)果證明，抗原四聚體使得基于它們的bcr的抗原特異性靈敏地檢測(cè)記憶b細(xì)胞成為可能，盡管這些細(xì)胞在外周血中非常稀少。特異針對(duì)ttcf的類型轉(zhuǎn)換記憶b細(xì)胞被合適的四聚體ttcf抗原高亮標(biāo)記，而對(duì)照四聚體的背景標(biāo)記則一直很低。

實(shí)施例4：方法/抗體驗(yàn)證

通過(guò)重疊pcr將igg重鏈和κ鏈的恒定區(qū)與分離的可變節(jié)段連接，產(chǎn)生完全的人抗體。在瞬時(shí)、無(wú)血清哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中用cho-s細(xì)胞表達(dá)抗體6-8天時(shí)間?？贵w用蛋白g和凝膠過(guò)濾色譜純化。

如圖23所示，從ttcf特異的漿母細(xì)胞分離的抗體對(duì)ttcf抗原顯示高結(jié)合親和性，kd為2.2nm(ttcfab1)和323pm(ttcfab2)(圖23b)。從記憶b細(xì)胞分離的抗體也顯示高結(jié)合親和性，其他抗體(ttcfabs3,4,和5)的kd為382pm、228pm和1.4nm(圖23b)。

這些數(shù)據(jù)支持本文中所公開(kāi)方法的特異性。而且，通過(guò)從三個(gè)不同供體構(gòu)建了5個(gè)抗-ttcf抗體，所有這些均以高親和力與ttcf結(jié)合，證明了本文方法的特異性。

本文中的數(shù)據(jù)還證明，抗原四聚體使得在抗原從宿主中清除很久之后仍有可能能夠靈敏地檢測(cè)記憶b細(xì)胞。

實(shí)施例5：獲得抗-mica抗體

使用本文中的方法產(chǎn)生免疫特異性結(jié)合mica的抗體。

簡(jiǎn)而言之，將mica抗原(unigenehs.130838)表達(dá)成具有c端bira標(biāo)簽(glndifeaqkiewhe(seqidno:238))，其使得抗原可以被單生物素化。用r-藻紅蛋白(pe)標(biāo)記的鏈親和素(sa)以4mica:1sa的摩爾比將抗原四聚體化。從已經(jīng)用gm-csf表達(dá)載體(gvax)(pnas103:9190,2006)轉(zhuǎn)導(dǎo)的自身腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了疫苗接種的晚期黑素瘤患者獲得外周血單核細(xì)胞，隨后用抗-ctla-4單克隆抗體ipilimumab(yervoy^tm(可以從bristolmyerssquib獲得))進(jìn)行處理。將外周血單核細(xì)胞快速融化、清洗，并以5x10⁶細(xì)胞/ml懸浮在含有2％胎牛血清的磷酸鹽緩沖鹽水(ph7.2)中，并用大約0.1ug/ml四聚體在冰上染色30分鐘。添加抗體以鑒定類型轉(zhuǎn)換的記憶b細(xì)胞(cd19⁺,cd27⁺和igm^-)。包含一組標(biāo)記t細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和死細(xì)胞的排除抗體(cd3,cd14,cd16,7-aad)，以減少背景四聚體染色。用bdfacsariaii將與mica四聚體結(jié)合的單個(gè)b細(xì)胞分選到8排pcr管中。用來(lái)自epicentrebiotechnologies的商業(yè)試劑盒(目錄號(hào):mbcl90310)使用下面顯示的基因特異性引物擴(kuò)增b細(xì)胞受體(bcr)mrna：

mrna擴(kuò)增

igg-t7:

aatacgactcactataggttcggggaagtagtccttgaccagg(seqidno:94)

κ-t7:

taatacgactcactatagggatagaagttattcagcaggcacac(seqidno:95)

λ-t7:

taatacgactcactataggcgtcaggctcagrtagctgctggccgc(seqidno:96)

pcr1

vhl-1:tcaccatggactg(c/g)acctgga(seqidno:97)

vhl-2:ccatggacacactttg(c/t)tccac(seqidno:98)

vhl-3:tcaccatggagtttgggctgagc(seqidno:99)

vhl-4:agaacatgaaaca(c/t)ctgtggttctt(seqidno:100)

vhl-5:atggggtcaaccgccatcct(seqidno:101)

vhl-6:acaatgtctgtctccttcctcat(seqidno:102)

vkl-1:gctcagctcctggggctcctg(seqidno:103)

vkl-2:ctggggctgctaatgctctgg(seqidno:104)

vkl-3:ttcctcctgctactctggctc(seqidno:105)

vkl-4:cagacccaggtcttcatttct(seqidno:106)

vll-1:cctctcctcctcaccctcct(seqidno:107)

vll-2:ctcctcactcagggcaca(seqidno:108)

vll-3:atggcctgga(t/c)c(c/g)ctctcc(seqidno:109)

cgii:gccagggggaagac(c/g)gatg(seqidno:110)

ckii:tttcaactgctcatcagatggcgg(seqidno:111)

clii:agctcctcagaggaggg(c/t)gg(seqidno:112)

pcr2

vh-1:caggt(g/c)cagctggt(g/a)cagtc(seqidno:113)

vh-2:cag(a/g)tcaccttgaaggagtc(seqidno:114)

vh-3:(g/c)aggtgcagctggtggagtc(seqidno:115)

vh-4:caggtgcagctgcaggagtc(seqidno:116)

vh-5:ga(g/a)gtgcagctggtgcagtc(seqidno:117)

vh-6:caggtacagctgcagcagtc(seqidno:118)

vk-1:cg(a/c)catcc(a/g)g(a/t)tgacccagt(seqidno:119)

vk-2:cgat(a/g)ttgtgatgac(c/t)cag(seqidno:120)

vk-3:cgaaat(t/a)gtg(t/a)tgac(g/a)cagtct(seqidno:121)

vk-4:cgacatcgtgatgacccagt(seqidno:122)

vl-1:ccagtctgtgctgactcagc(seqidno:123)

vl-2:ccagtctgccctgactcagc(seqidno:124)

vl-3:ctcctatgagctgac(t/a)cagc(seqidno:125)

cgiii:gac(c/g)gatgggcccttggtgga(seqidno:126)

ckiii:aagatgaagacagatggtgc(seqidno:127)

cliii:gggaacagagtgaccg(seqidno:128)

pcr1和2中所用的引物和pcr循環(huán)條件是從wang和stollar等(journalofimmunologicalmethods2000)適用的。

開(kāi)發(fā)了一個(gè)替代的重鏈可變區(qū)正向引物組，以覆蓋可能不會(huì)被上面的引物組充分覆蓋的重鏈可變區(qū)序列。產(chǎn)生了下面的可選擇引物：

pcr1

vhl1-58:tcactatggactggatttgga(seqidno:129)

vhl2-5:ccatggaca(c/t)actttg(c/t)tccac(seqidno:130)

vhl3-7:gtaggagacatgcaaatagggcc(seqidno:131)

vhl3-11:aacaaagctatgacatatagatc(seqidno:132)

vhl3-13.1:atggagttggggctgagctgggtt(seqidno:133)

vhl3-13.2:agttgttaaatgtttatcgcaga(seqidno:134)

vhl3-23:aggtaattcatggagaaatagaa(seqidno:135)

vhl4-39:agaacatgaagca(c/t)ctgtggttctt(seqidno:136)

vhl4-61:atggactggacctggagcatc(seqidno:137)

vhl-9:cctctgctgatgaaaaccagccc(seqidno:138)

pcr2

vh1-3/18:caggt(c/t)cagct(t/g)gtgcagtc(seqidno:139)

vh1-45/58:ca(a/g)atgcagctggtgcagtc(seqidno:140)

vh2-5:cag(a/g)tcaccttga(a/g)ggagtctggt(seqidno:141)

vh3-9/23/43:ga(a/g)gtgcagctg(t/g)tggagtc(seqidno:142)

vh3-16:gaggtacaactggtggagtc(seqidno:143)

vh3-47:gaggatcagctggtggagtc(seqidno:144)

v4-34:caggtgcagctacagcagtg(seqidno:145)

v4-30-2/39:cagctgcagctgcaggagtc(seqidno:146)

vh7-4-1:caggtgcagctggtgcaatc(seqidno:147)

簡(jiǎn)而言之，使用通過(guò)mrna擴(kuò)增產(chǎn)生的2ulcdna作為第一輪pcr的模板，循環(huán)條件如下：3個(gè)循環(huán)的預(yù)擴(kuò)增(94℃/45秒,45℃/45秒,72℃/105秒)；30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增(94℃/45秒,50℃/45秒,72℃/105秒)；72℃最終延長(zhǎng)10分鐘。

使用3ul第一輪pcr產(chǎn)物作為第二輪巢式pcr的模板。使用與第一輪pcr相同的循環(huán)條件，但是省略3個(gè)循環(huán)的預(yù)擴(kuò)增。兩個(gè)pcr步驟均使用克隆的pfu聚合酶ad(agilenttechnologies實(shí)施。將pcr產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上分離，用zymocleandna凝膠回收試劑盒(zymoresearch)分離大小為300-400核苷酸的產(chǎn)物。使用用于第二輪巢式pcr的正向和反向引物進(jìn)行測(cè)序。兩步巢式pcr擴(kuò)增了bcr重鏈和輕鏈的可變域(見(jiàn)上文)。從已經(jīng)用gm-csf表達(dá)載體(gvax)(pnas103:9190,2006)轉(zhuǎn)導(dǎo)的自身腫瘤細(xì)胞進(jìn)行疫苗接種的晚期黑素瘤患者獲得外周血單核細(xì)胞。抗體在瞬時(shí)cho-s表達(dá)系統(tǒng)中被表達(dá)成全長(zhǎng)igg1抗體。

用兩種獨(dú)立的基于珠子的測(cè)定法來(lái)驗(yàn)證抗-mica抗體與mica的結(jié)合。第一種測(cè)定法使用商業(yè)可得的基于溶液的珠子測(cè)定試劑盒，其被設(shè)計(jì)用于檢測(cè)與各種mica等位體反應(yīng)的抗-mica抗體(onelambda,目錄號(hào)lsmica001)。將不同濃度的mica抗體與珠子進(jìn)行溫育，然后清洗，與藻紅蛋白偶聯(lián)的抗人igg抗體一起溫育。在第二個(gè)清洗步驟之后，在luminex儀器上對(duì)珠子進(jìn)行分析。陰性對(duì)照是用僅與藻紅蛋白偶聯(lián)的抗人igg抗體(無(wú)抗-mica抗體)溫育珠子。陽(yáng)性對(duì)照包括用商業(yè)可得的、直接與藻紅蛋白偶聯(lián)的抗-mica/micb單克隆抗體(克隆6d4)(biolegend目錄#320906)溫育珠子。第二種測(cè)定法是內(nèi)部開(kāi)發(fā)的，使用與鏈親和素偶聯(lián)的聚苯乙烯珠子。珠子用單生物素化的mica蛋白包被，用不同濃度的抗-mica抗體、抗-ttcf抗體(同種型陰性對(duì)照)、或直接與藻紅蛋白偶聯(lián)的抗-mica/micb抗體(陽(yáng)性對(duì)照)進(jìn)行溫育。對(duì)用抗-mica抗體或抗-ttcf抗體溫育的珠子進(jìn)行清洗，然后和與alexa488偶聯(lián)的抗-人igg抗體一起溫育。為了確定與珠子的背景結(jié)合，使用與鏈親和素偶聯(lián)、但沒(méi)有用mica蛋白包被的珠子進(jìn)行相同的溫育，用于比較。在facscaliber流式細(xì)胞儀上分析珠子與抗體的結(jié)合。

如圖24和25所示，抗-mica抗體(mica-ab12和mica-ab20)以高親和力與mica結(jié)合。mica-ab20對(duì)應(yīng)于表1所示的抗-mica抗體id-1。

實(shí)施例6：抗-mica抗體

使用本文中的方法開(kāi)發(fā)了額外的具有臨床相關(guān)生物性質(zhì)的抗-mica抗體。在已經(jīng)接受了細(xì)胞癌癥疫苗(gm-csf轉(zhuǎn)導(dǎo)的癌細(xì)胞，稱作gvax)和阻斷t細(xì)胞上抑制性ctla-4受體的抗體ipilimumab(yervoy^tm(可以從bristolmyerssquib獲得))的患者體內(nèi)，鑒定了與共有等位體(commonallele)有反應(yīng)性的mica特異性抗體。然后使用mica四聚體從具有最高血清mica反應(yīng)性的患者的外周血單核細(xì)胞分離b細(xì)胞。通過(guò)單細(xì)胞pcr從這些b細(xì)胞確定了重鏈和輕鏈序列，如實(shí)施例5中概述的。這項(xiàng)工作鑒定了可以識(shí)別在北美人群中普遍存在的等位體的抗體。

cm24002ab2(表1所述的抗-mica抗體id-6)是一種從患有急性髓細(xì)胞樣白血病(aml)的患者分離的抗體，該患者被證明對(duì)gvax+ipilimumab組合治療具有顯著的臨床響應(yīng)，并且血漿與mica強(qiáng)烈反應(yīng)。圖中顯示了cm24002ab2輕鏈(圖30和31)和重鏈(圖28和29)的核苷酸和氨基酸序列，cdr1、cdr2和cdr3序列用下劃線標(biāo)示。從同一患者獲得了額外的具有強(qiáng)烈結(jié)合的抗體，并標(biāo)記為cm24002ab4(表1所述的抗-mica抗體id-7)。圖中顯示了cm24002ab4輕鏈(圖34和35)和重鏈(圖23和32)的核苷酸和氨基酸序列，cdr1、cdr2和cdr3序列用下劃線標(biāo)示。

cm33322ab11(表1所述的抗-mica抗體id-8)和cm33322ab29(表1所述的抗-mica抗體id-9)是從患有轉(zhuǎn)移性黑素瘤、并對(duì)gvax+ipilimumab組合療法顯示長(zhǎng)期(>15年)響應(yīng)性的患者分離的抗體。圖中顯示了cm33322ab11輕鏈(圖38和39)和重鏈(圖36和37)的核苷酸和氨基酸序列，cdr1、cdr2和cdr3序列用下劃線標(biāo)示。圖中顯示了cm33322ab29輕鏈(圖42和43)和重鏈(圖40和41)的核苷酸和氨基酸序列，cdr1、cdr2和cdr3序列用下劃線標(biāo)示。由于該患者的長(zhǎng)期臨床響應(yīng)，這些抗體特別令人感興趣。

在感興趣的抗體被初始鑒定、克隆和表達(dá)之后，用流式微球測(cè)定法確定了這些抗體對(duì)不同mica等位體的特異性。簡(jiǎn)而言之，具有單bira生物素化位點(diǎn)的可溶重組mica等位體002,008,009和micb被表達(dá)、純化、并捕獲在鏈親和素珠子上。然后，將所示抗-mica抗體與包被有不同濃度的重組mica的珠子溫育1小時(shí)，然后清洗，用fitc標(biāo)記的抗人igg二抗進(jìn)行溫育。在第二個(gè)清洗步驟之后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)完成珠子結(jié)合的fitc熒光的定量。mica等位體002,008,009以及相關(guān)的micb蛋白是根據(jù)在北美人群中的普遍性選擇的(圖48)。mica等位體002,008,009以及相關(guān)的micb蛋白也是根據(jù)它們?cè)谌澜绲钠毡樾赃x擇的(圖48)。重要的是，cm24002ab2和cm33322ab29與所有mica等位體以及與micb均強(qiáng)烈結(jié)合。其它兩種抗體與一個(gè)子集的等位體結(jié)合：cm24002ab4高度結(jié)合mica*009和micb，cm33322ab11高度結(jié)合mica*002,mica*008和micb(圖48a-f)。通過(guò)使用相同技術(shù)產(chǎn)生的陰性人對(duì)照抗體(特異針對(duì)破傷風(fēng)類毒素c端片段，ttfc)和針對(duì)mcia的陽(yáng)性對(duì)照抗體(來(lái)自從biolegend的商業(yè)品化的針對(duì)mica的鼠抗體)佐證了特異性。這些研究鑒定了cm24002ab2和cm33322ab29作為臨床應(yīng)用的潛在候選者。

實(shí)施例7：抗-mica抗體與自身腫瘤細(xì)胞的結(jié)合

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢查分離的抗mica抗體cm24002ab2結(jié)合自身腫瘤細(xì)胞的能力(圖49)。從患者cm24002獲得骨髓，并測(cè)試cm24002ab2與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。然后，從骨髓樣品鑒定cd33+cd34+細(xì)胞作為腫瘤細(xì)胞。然后，用10μg/ml抗-mica抗體cm24002ab2、陽(yáng)性對(duì)照商業(yè)mica抗體(biolegend)或陰性對(duì)照抗體(ttcf特異的)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行染色。如圖49所示，cm24002ab2強(qiáng)烈結(jié)合這些細(xì)胞。cm24002ab2未顯示與非腫瘤細(xì)胞(cd16+和cd3+細(xì)胞)的結(jié)合，與cd14+細(xì)胞僅有背景結(jié)合，證明了其抗腫瘤特異性(數(shù)據(jù)未顯示)。

實(shí)施例8：抗-mica抗體抑制nk細(xì)胞上的nkg2d受體

對(duì)分離的抗-mica抗體cm24002ab2阻止可溶mica介導(dǎo)的其同源受體(cognatereceptor)nkg2d下調(diào)的能力進(jìn)行檢驗(yàn)。來(lái)自患者cm24002的血清以1:10稀釋度使用，并與人nk細(xì)胞溫育48小時(shí)。向這些培養(yǎng)物添加cm24002ab2(濃度為10μg/ml)、陽(yáng)性對(duì)照商業(yè)mica抗體(biolegend)或陰性對(duì)照抗體(ttcf特異的)。在48小時(shí)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估nkg2d的表達(dá)(圖50)。來(lái)自患者cm24002的血清強(qiáng)烈下調(diào)nkg2d的表達(dá)(因此使該受體喪失功能)。cm24002ab2和陽(yáng)性對(duì)照mica抗體部分地恢復(fù)nk細(xì)胞上nkg2d的表面表達(dá)。為了證明特異性，我們通過(guò)用2ng/ml重組mica代替患者血清溫育細(xì)胞，重復(fù)了上述實(shí)驗(yàn)(圖51)。cm24002ab2完全阻止mica介導(dǎo)的nkg2d表達(dá)下調(diào)，而陰性對(duì)照抗體(對(duì)ttcf特異的)沒(méi)有效果(圖51)。這些數(shù)據(jù)證明，人mica抗體能夠防止人nk細(xì)胞上關(guān)鍵nkg2d受體的抑制。

實(shí)施例9：抗-mica抗體細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性

為了證明cm24002ab2抗體是否能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒，在cm24002ab2、陰性對(duì)照抗體(ttcf特異)或陽(yáng)性對(duì)照抗體(biolegend)的存在下(均為10μg/ml)，將重組mica(2ng/ml)和人nk細(xì)胞(效應(yīng)物細(xì)胞)一起溫育48小時(shí)。48小時(shí)后，清洗細(xì)胞，并以20:1,10:1和5:1的效應(yīng)物:靶比例與k562腫瘤細(xì)胞溫育4小時(shí)。通過(guò)從k562腫瘤細(xì)胞釋放的胞漿蛋白(ldh)確定靶細(xì)胞被nk細(xì)胞的特異裂解。沒(méi)有mica抗體存在時(shí)，nk細(xì)胞沒(méi)有殺傷k562腫瘤細(xì)胞。然而，cm24002ab2大大提高nk細(xì)胞介導(dǎo)的k562腫瘤細(xì)胞的裂解，并且在所有效應(yīng)物:靶比例下，均比陽(yáng)性對(duì)照鼠mica抗體更有效(圖52)。進(jìn)一步證明，k562腫瘤細(xì)胞的殺傷確實(shí)是由nkg2d通路(而不是fc受體)介導(dǎo)的。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，并添加了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組：nkg2d封閉抗體和人fc封閉。此外，也對(duì)cm33322ab29進(jìn)行了測(cè)試。數(shù)據(jù)顯示，添加cm24002ab2和cm33322ab29實(shí)現(xiàn)了nk細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒。當(dāng)添加封閉nkg2d抗體時(shí)，沒(méi)有出現(xiàn)k562細(xì)胞的殺傷，而fc封閉劑幾乎沒(méi)有作用(圖53)。這些數(shù)據(jù)顯示，cm24002ab2和cm33322ab29恢復(fù)了nkg2d通路的抗腫瘤功能。

實(shí)施例10：抗-mica抗體與α3mica結(jié)構(gòu)域的結(jié)合

nkg2d受體與mica的上部α1和α2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，與相同位點(diǎn)結(jié)合的抗體可能與nkg2d受體競(jìng)爭(zhēng)，借此阻斷nk細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。與α3結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體則特別令人感興趣，因?yàn)樗鼈儾荒茏钄鄋kg2d受體的結(jié)合。同時(shí)，這些抗體能夠干擾mica從腫瘤細(xì)胞表面的蛋白酶切割。用先前描述的流式細(xì)胞珠子測(cè)定法對(duì)抗-mica抗體結(jié)合micaα3結(jié)構(gòu)域的能力進(jìn)行評(píng)估。將生物素化的重組蛋白捕獲在鏈親和素珠子上。然后，將10μg/ml的抗體cm24002ab2,cm24002ab4,cm33322ab11,cm33322ab29,陰性對(duì)照抗體(ttcf特異)或陽(yáng)性對(duì)照抗體(biolegend)與珠子溫育，隨后與fitc標(biāo)記的抗人igg二抗溫育，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)定量珠子結(jié)合的fitc熒光(圖54)。如圖54所示，cm33322ab29與micaα3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，因此具有很大的治療應(yīng)用潛力。

實(shí)施例11：抗-mica抗體與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合

對(duì)使用cm24002ab2和cm33322ab29靶定多種多樣的癌細(xì)胞的潛力進(jìn)行了評(píng)估。對(duì)一組癌細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試，檢查其是否被cm24002ab2和cm33322ab29標(biāo)記：多發(fā)性骨髓瘤(rpmi8226和xg-1)、卵巢癌(ovcar3)、急性髓細(xì)胞樣白血病(u937)、黑素瘤(k028)、肺癌(1792和827)、和乳腺癌(mcf7)細(xì)胞。將腫瘤細(xì)胞以1x10⁶細(xì)胞/ml的濃度懸浮在含有1％bsa的pbs中，用濃度為10μg/ml的cm24002ab2和cm33322ab29、以及陽(yáng)性和陰性對(duì)照抗體(分別為鼠mica抗體和ttcf特異性抗體)在4℃染色1小時(shí)(直接偶聯(lián))。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)標(biāo)記進(jìn)行評(píng)估(圖55)。cm24002ab2和cm33322ab29均結(jié)合每一種被測(cè)試的腫瘤細(xì)胞類型，對(duì)大多數(shù)被測(cè)試的細(xì)胞系的標(biāo)記強(qiáng)度高于商業(yè)陽(yáng)性對(duì)照。

實(shí)施例11：抗micaa抗體的mica等位體特異性

cm33322ab29的等位體特異性用市售的luminex測(cè)定法進(jìn)行評(píng)估。商業(yè)測(cè)試試劑盒含有與luminex珠子直接偶聯(lián)的多種重組mica等位體(mica*001,*002,*007,*012,*017,*018,*027,*004,*009,和*015)，每一種均具有內(nèi)在的熒光性質(zhì)，從而能夠在單一樣品中對(duì)其結(jié)合進(jìn)行評(píng)估。用10μg/ml的cm33322ab29、biolegend陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照(ttcf)溫育包被有指示mica等位體的luminex珠子1小時(shí)，隨后用pe偶聯(lián)的抗-人igg第二抗體溫育。在用指示抗體溫育60分鐘，隨后用抗-人pe偶聯(lián)第二抗體溫育之后，使用luminex200設(shè)備確定熒光(圖56)。在市售測(cè)定系統(tǒng)中，cm33322ab29能夠結(jié)合所有存在的等位體，表明它可以在患者中使用，而無(wú)需考慮mica基因型。

這些數(shù)據(jù)證明了cm24002ab2和cm33322ab29的高生物活性，以及它們恢復(fù)nk細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞裂解的能力。這些數(shù)據(jù)證明，對(duì)免疫療法具有響應(yīng)的癌癥患者產(chǎn)生了mica抗體，這些抗體恢復(fù)了nk細(xì)胞的抗腫瘤活性?？傊?，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了抗-mica抗體在癌癥患者體內(nèi)克服免疫抑制和促進(jìn)腫瘤破壞的治療潛力。

實(shí)施例12：獲得抗-促血管發(fā)生素-2抗體

使用本文中的方法產(chǎn)生了可結(jié)合促血管發(fā)生素-2的抗體。簡(jiǎn)而言之，生物素化的促血管發(fā)生素-2(unigenehs.583870)從r&dsystems購(gòu)買。將外周血單核細(xì)胞快速融化、清洗，并以5x10⁶重新懸浮在含有2％胎牛血清的磷酸鹽緩沖鹽水(ph7.2)中，在冰上用大約0.5ug/ml的促血管發(fā)生素-2染色30分鐘。用4mlpbs/2％fcs清洗細(xì)胞2次。然后添加抗體以鑒定類型轉(zhuǎn)換的記憶b細(xì)胞(cd19+,cd27+,和igm-)，并添加sa-pe以標(biāo)記在細(xì)胞表面上具有生物素化促血管發(fā)生素的b細(xì)胞。包含一組標(biāo)記t細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和死細(xì)胞的排除抗體(cd3,cd14,cd16,7-aad)，以減小背景四聚體染色。用bdfacsariaii將與促血管發(fā)生素-2結(jié)合的單個(gè)b細(xì)胞分選到8聯(lián)pcr反應(yīng)管中。使用epicentrebiotechnologies的市售試劑盒(目錄號(hào):mbcl90310)，用基因特異性引物(見(jiàn)上文)擴(kuò)增b細(xì)胞受體(bcr)mrna。兩步巢式pcr擴(kuò)增重鏈和輕鏈的bcr可變域(見(jiàn)上文)。從已經(jīng)用gm-csf表達(dá)載體(gvax)轉(zhuǎn)導(dǎo)的自身腫瘤細(xì)胞進(jìn)行疫苗接種的(cancerres.70:10150,2010)、患有惡性非小細(xì)胞肺癌的患者獲得外周血單核細(xì)胞。在瞬時(shí)cho-s表達(dá)系統(tǒng)中將抗體表達(dá)成全長(zhǎng)igg1抗體。

用elisa測(cè)定法驗(yàn)證抗-促血管發(fā)生素-2抗體與促血管發(fā)生素-2的結(jié)合。簡(jiǎn)而言之，將促血管發(fā)生素-2在96孔平底板(perkinelmer)中以4μg/ml濃度溶于100mm碳酸氫鈉緩沖液ph9.6中，并在4℃過(guò)夜包被。用含有牛血清白蛋白和牛γ球蛋白的測(cè)試緩沖液(perkinelmer)在室溫封閉平板3個(gè)小時(shí)?？贵w以20ug/ml-0.16ug/ml稀釋于測(cè)試緩沖液中，并4℃溫育1小時(shí)。用200μl清洗緩沖液(50mmtrisph8,150mmnacl,20mmedta,0.05％tween)清洗平板3次。向每個(gè)孔添加100μl增強(qiáng)液(perkinelmer)，并用victor3酶標(biāo)儀(perkinelmer)在615nm波長(zhǎng)下測(cè)量熒光計(jì)數(shù)。同時(shí)測(cè)試人促血管發(fā)生素-1和-4的結(jié)合，二者顯示相似的反應(yīng)性。

相關(guān)數(shù)據(jù)如圖27a-27c所示，提供了與從肺癌患者分離促血管發(fā)生素特異性抗體相關(guān)的曲線圖和凝膠圖。(a)通過(guò)elisa確定的肺癌患者(l19)血清(1:1000稀釋)的促血管發(fā)生素-2反應(yīng)性。x軸顯示了血清收集數(shù)據(jù)。包含對(duì)照蛋白牛血清白蛋白(bsa)作為陰性對(duì)照。(b)facs點(diǎn)圖顯示了以cd19+,cd27+igm-b細(xì)胞設(shè)門的pbmc樣品(時(shí)間點(diǎn)-10/98)，x軸為cd19，y軸為帶熒光標(biāo)簽的促血管發(fā)生素-2。門大概指示了分選截止之處。從該樣品中分選了10個(gè)b細(xì)胞。(c)從分離自患者l19的10個(gè)促血管發(fā)生素-2反應(yīng)性記憶b細(xì)胞產(chǎn)生的重鏈、輕鏈和鉸鏈區(qū)pcr產(chǎn)物。經(jīng)過(guò)兩輪巢式pcr產(chǎn)生的重鏈(上圖)和輕鏈(下圖)pcr產(chǎn)物大約為350個(gè)堿基對(duì)。

實(shí)施例13：抗-促血管發(fā)生素-2抗體與人重組促血管發(fā)生素家族成員的結(jié)合

用4μg/ml溶于碳酸氫鈉緩沖液ph9.6的重組促血管發(fā)生素-1、-2和-4(r&dsystems)過(guò)夜包被96孔板。隨后在室溫下用含有牛血清白蛋白(bsa)和牛γ球蛋白的測(cè)定緩沖液(perkinelmer)封閉平板3小時(shí)。將平板用稀釋到20μg/ml-0.16μg/ml的抗體id2,3,4和5(見(jiàn)表1)在4℃回轉(zhuǎn)溫育1小時(shí)。隨后清洗平板，并與抗-人igg-銪抗體(perkinelmer)一起溫育。通過(guò)酶標(biāo)儀獲得615nm的熒光計(jì)數(shù)。使用陰性對(duì)照抗體(克隆8.18.c5)確定特異性。數(shù)據(jù)通過(guò)兩次重復(fù)確定。

如圖26a-26c所示，抗體id2,3,4和5(見(jiàn)表1)以高親和性結(jié)合促血管發(fā)生素-1、-2和-4?？贵w不與結(jié)構(gòu)相近的蛋白——類促血管發(fā)生素-3結(jié)合(見(jiàn)圖26d)。

使用本文中的方法獲得了另一種具有臨床相關(guān)生物性質(zhì)的抗-促血管發(fā)生素抗體，稱作抗-ang2ab6(表1所述的抗-mica抗體id-10)。如上所述地對(duì)抗-ang2ab6與人重組促血管發(fā)生素家族成員的結(jié)合進(jìn)行分析。簡(jiǎn)而言之，用4μg/ml的促血管發(fā)生素ang-1,ang-2,ang4和類促血管發(fā)生素-3包被elisa平板，并在20μg/ml,4μg/ml,0.8μg/ml,和0.16μg/ml濃度下檢測(cè)抗-ang2ab6的結(jié)合。使用銪偶聯(lián)的抗-人igg第二抗體，45分鐘后測(cè)量銪計(jì)數(shù)。如圖57所示，抗-ang2ab6以劑量依賴的方式與所有促血管發(fā)生素結(jié)合。

其它實(shí)施方案

應(yīng)當(dāng)理解，盡管已結(jié)合其詳細(xì)說(shuō)明書(shū)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是前述的描述只是用于舉例說(shuō)明，對(duì)本發(fā)明的范圍沒(méi)有限制。本發(fā)明的范圍由附加權(quán)利要求的范圍限定。其它的方面、優(yōu)點(diǎn)和修改也在下面權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。

序列表

<110>dana-farbercancerinstitute,inc.

<120>治療肽

<130>00530-0293001

<150>pct/us2012/057839

<151>2012-09-28

<150>61/541,921

<151>2011-09-30

<160>238

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>384

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>1

caggtgcagctacagcagtggggcgcaggactgttgaagccttcggagaccctggccctc60

acctgcgctgtctctggtgggtccttcactgatcattactggagttggatccgtcaggcc120

ccagggaaggggctggagtggattggagaaatcaatcatagtggagtcaccaactacaac180

ccgtccctcaagagtcgactcaccatatcagtagacacgtccaagagccagttctccctg240

aggctgacctctgtgaccgccgcggacacggctctgtactactgtgcgaaaactggcctg300

tattatgatgacgtttgggggacttttcgtccacggggcgggttcgactcctggggccag360

ggaaccctggtcaccgtctcctca384

<210>2

<211>128

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>2

glnvalglnleuglnglntrpglyalaglyleuleulysproserglu

151015

thrleualaleuthrcysalavalserglyglyserphethrasphis

202530

tyrtrpsertrpileargglnalaproglylysglyleuglutrpile

354045

glygluileasnhisserglyvalthrasntyrasnproserleulys

505560

serargleuthrileservalaspthrserlysserglnpheserleu

65707580

argleuthrservalthralaalaaspthralaleutyrtyrcysala

859095

lysthrglyleutyrtyraspaspvaltrpglythrpheargproarg

100105110

glyglypheaspsertrpglyglnglythrleuvalthrvalserser

115120125

<210>3

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>3

glnvalglnleuglnglntrpglyalaglyleuleulysproserglu

151015

thrleualaleuthrcysalavalser

2025

<210>4

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>4

glyglyserphethrasphistyr

15

<210>5

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>5

trpsertrpileargglnalaproglylysglyleuglutrpilegly

151015

glu

<210>6

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>6

ileasnhisserglyvalthr

15

<210>7

<211>38

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>7

asntyrasnproserleulysserargleuthrileservalaspthr

151015

serlysserglnpheserleuargleuthrservalthralaalaasp

202530

thralaleutyrtyrcys

35

<210>8

<211>22

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>8

alalysthrglyleutyrtyraspaspvaltrpglythrpheargpro

151015

argglyglypheaspser

20

<210>9

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>9

trpglyglnglythrleuvalthrvalserser

1510

<210>10

<211>339

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>10

gacatcgtgatgacccagtctccggactccctggctgtgtctctgggcgagagggccacc60

atcaactgcaagtccagccagagtattttatatagctccgacaataagaattacttagct120

tggtaccagcacaagccaggacagcctcctaagctcctcttttactgggcatctatccgg180

gaatccggggtccctgaccgattcagtggcggcgggtctgggacagatttcactctcacc240

atcagcagtctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaatattatagtcct300

ccttgcagttttggccaggggaccaagctggagatccaa339

<210>11

<211>113

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>11

aspilevalmetthrglnserproaspserleualavalserleugly

151015

gluargalathrileasncyslysserserglnserileleutyrser

202530

seraspasnlysasntyrleualatrptyrglnhislysproglygln

354045

proprolysleuleuphetyrtrpalaserilearggluserglyval

505560

proaspargpheserglyglyglyserglythraspphethrleuthr

65707580

ileserserleuglnalagluaspvalalavaltyrtyrcysglngln

859095

tyrtyrserproprocysserpheglyglnglythrlysleugluile

100105110

gln

<210>12

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>12

aspilevalmetthrglnserproaspserleualavalserleugly

151015

gluargalathrileasncyslysserser

2025

<210>13

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>13

glnserileleutyrserseraspasnlysasntyr

1510

<210>14

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>14

leualatrptyrglnhislysproglyglnproprolysleuleuphe

151015

tyr

<210>15

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>15

trpalaser

1

<210>16

<211>36

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>16

ilearggluserglyvalproaspargpheserglyglyglysergly

151015

thraspphethrleuthrileserserleuglnalagluaspvalala

202530

valtyrtyrcys

35

<210>17

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>17

glnglntyrtyrserproprocysser

15

<210>18

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>18

pheglyglnglythrlysleugluilegln

1510

<210>19

<211>363

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>19

gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60

tcctgtgcagcctctggattcacctttagtagttatgccatgagctgggtccgccaggct120

ccagggaaggggctggagtgggtctcaggtatttattggagtggtggtagcacatactac180

gcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacatatccaagaacacgctgtat240

ctgcaaatgaacagtctgagagccgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaggcgat300

tactatggttcgggggctcactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcc360

tca363

<210>20

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>20

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

serglyiletyrtrpserglyglyserthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspileserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalaaspaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargglyasptyrtyrglyserglyalahispheasptyrtrpgly

100105110

glnglythrleuvalthrvalserser

115120

<210>21

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>21

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaser

2025

<210>22

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>22

glyphethrphesersertyrala

15

<210>23

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>23

metsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalser

151015

gly

<210>24

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>24

iletyrtrpserglyglyserthr

15

<210>25

<211>38

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>25

tyrtyralaaspservallysglyargphethrileserargaspile

151015

serlysasnthrleutyrleuglnmetasnserleuargalaaspasp

202530

thralavaltyrtyrcys

35

<210>26

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>26

alaargglyasptyrtyrglyserglyalahispheasptyr

1510

<210>27

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>27

trpglyglnglythrleuvalthrvalserser

1510

<210>28

<211>336

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>28

gatattgtgatgacccagactccactctcctcacctgtcacccttggacagccggcctcc60

atctcctgcaggtctagccaaagcctcgtacacagtgatggaaacacctacttgagttgg120

cttcagcagaggccaggccagcctccaagactcctaatttatcagatttctaaccggttc180

tctggggtcccagacagattcagtggcagtggggcagggacagatttcacactgaaaatc240

agcagggtggaagctgaggatgtcggggtttactactgcatgcaaggtacacaatttcct300

cggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa336

<210>29

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>29

aspilevalmetthrglnthrproleuserserprovalthrleugly

151015

glnproalaserilesercysargserserglnserleuvalhisser

202530

aspglyasnthrtyrleusertrpleuglnglnargproglyglnpro

354045

proargleuleuiletyrglnileserasnargpheserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyalaglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglngly

859095

thrglnpheproargthrpheglyglnglythrlysvalgluilelys

100105110

<210>30

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>30

aspilevalmetthrglnthrproleuserserprovalthrleugly

151015

glnproalaserilesercysargserser

2025

<210>31

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>31

glnserleuvalhisseraspglyasnthrtyr

1510

<210>32

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>32

leusertrpleuglnglnargproglyglnproproargleuleuile

151015

tyr

<210>33

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>33

glnileser

1

<210>34

<211>36

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>34

asnargpheserglyvalproaspargpheserglyserglyalagly

151015

thraspphethrleulysileserargvalglualagluaspvalgly

202530

valtyrtyrcys

35

<210>35

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>35

metglnglythrglnpheproargthr

15

<210>36

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>36

pheglyglnglythrlysvalgluilelys

1510

<210>37

<211>351

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>37

gaggtgcagctggtggagtccgggggaggcttagttcagcctgggggatccctgagactc60

tcctgtgcagcctcagggttcacctttagtaataactggatgcactgggtccgccaggct120

ccagggaaggggctggagtggatctcagagattagaagtgatgggaatttcacaaggtac180

gcggactccatgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagagcacactgtat240

ttgcaaatgaacagtctgagagtcgaggacacgggtctgtattactgtgcaagagactac300

ccctatagcattgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca351

<210>38

<211>117

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>38

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserasnasn

202530

trpmethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpile

354045

sergluileargseraspglyasnphethrargtyralaaspsermet

505560

lysglyargphethrileserargaspasnalalysserthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargvalgluaspthrglyleutyrtyrcys

859095

alaargasptyrprotyrserileasptyrtrpglyglnglythrleu

100105110

valthrvalserser

115

<210>39

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>39

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaser

2025

<210>40

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>40

glyphethrpheserasnasntrp

15

<210>41

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>41

methistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpileser

151015

glu

<210>42

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>42

ileargseraspglyasnphethr

15

<210>43

<211>38

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>43

argtyralaaspsermetlysglyargphethrileserargaspasn

151015

alalysserthrleutyrleuglnmetasnserleuargvalgluasp

202530

thrglyleutyrtyrcys

35

<210>44

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>44

alaargasptyrprotyrserileasptyr

1510

<210>45

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>45

trpglyglnglythrleuvalthrvalserser

1510

<210>46

<211>333

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>46

gatattgtgatgacccagactccactctcctcacctgtcacccttggacagccggcctcc60

atctcctgcacatctagtcaaagcctcgtacacagtaatggaaacacctacttgagttgg120

cttcagcagaggccaggccagcccccaagactcctaatttatgagatttctaagcgggtc180

tctggggtcccagacagattcagtggcagtggggcagggacagatttcacactgaaaatc240

agcagggtggaagctgaggatgtcggggtttattactgcatgcaaggtaaacaacttcgg300

acttttggccaggggaccaagctggagatcaaa333

<210>47

<211>111

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>47

aspilevalmetthrglnthrproleuserserprovalthrleugly

151015

glnproalaserilesercysthrserserglnserleuvalhisser

202530

asnglyasnthrtyrleusertrpleuglnglnargproglyglnpro

354045

proargleuleuiletyrgluileserlysargvalserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyalaglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglngly

859095

lysglnleuargthrpheglyglnglythrlysleugluilelys

100105110

<210>48

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>48

aspilevalmetthrglnthrproleuserserprovalthrleugly

151015

glnproalaserilesercysthrserser

2025

<210>49

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>49

glnserleuvalhisserasnglyasnthrtyr

1510

<210>50

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>50

leusertrpleuglnglnargproglyglnproproargleuleuile

151015

tyr

<210>51

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>51

gluileser

1

<210>52

<211>36

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>52

lysargvalserglyvalproaspargpheserglyserglyalagly

151015

thraspphethrleulysileserargvalglualagluaspvalgly

202530

valtyrtyrcys

35

<210>53

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>53

metglnglylysglnleuargthr

15

<210>54

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>54

pheglyglnglythrlysleugluilelys

1510

<210>55

<211>363

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>55

gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctgggggctccgtgagactg60

tcttgtgcggcctcaggcttcattcttagcaactttgccatgagttgggtccgccaggct120

ccagggaaggggctggactgggtctcaggtaattttggtggtcgtgaaaatacatattac180

gcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacagttccaagagcacactgtat240

ctgcaaatgaacaatttgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgcgaggcgat300

taccatggttcgggggctcactttgactactggggccagggaatactggtcaccgtctcc360

tca363

<210>56

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>56

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

servalargleusercysalaalaserglypheileleuserasnphe

202530

alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuasptrpval

354045

serglyasnpheglyglyarggluasnthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspserserlysserthrleutyr

65707580

leuglnmetasnasnleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargglyasptyrhisglyserglyalahispheasptyrtrpgly

100105110

glnglyileleuvalthrvalserser

115120

<210>57

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>57

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

servalargleusercysalaalaser

2025

<210>58

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>58

glypheileleuserasnpheala

15

<210>59

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>59

metsertrpvalargglnalaproglylysglyleuasptrpvalser

151015

gly

<210>60

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>60

asnpheglyglyarggluasnthr

15

<210>61

<211>38

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>61

tyrtyralaaspservallysglyargphethrileserargaspser

151015

serlysserthrleutyrleuglnmetasnasnleuargalagluasp

202530

thralavaltyrtyrcys

35

<210>62

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>62

alaargglyasptyrhisglyserglyalahispheasptyr

1510

<210>63

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>63

trpglyglnglyileleuvalthrvalserser

1510

<210>64

<211>336

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>64

gatattgtgatgacccagagtccactctcctcacctgtcatccttggacagccggcctcc60

atctcctgcaggtctagtcaaagcctcctacacagtgatggaaacacctacttgagttgg120

cttcaccagaggccaggccagcctcctagactcctaatttatcagatttctaaccggttc180

tctggggtcccagacagattcagtggcagtgggacagggacagatttcacactgaaaatc240

agcagggtggaagctgaggatgccgggatttattactgcatgcaaggtacagaatttcct300

cggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa336

<210>65

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>65

aspilevalmetthrglnserproleuserserprovalileleugly

151015

glnproalaserilesercysargserserglnserleuleuhisser

202530

aspglyasnthrtyrleusertrpleuhisglnargproglyglnpro

354045

proargleuleuiletyrglnileserasnargpheserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglythrglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspalaglyiletyrtyrcysmetglngly

859095

thrglupheproargthrpheglyglnglythrlysvalgluilelys

100105110

<210>66

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>66

aspilevalmetthrglnserproleuserserprovalileleugly

151015

glnproalaserilesercysargserser

2025

<210>67

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>67

glnserleuleuhisseraspglyasnthrtyr

1510

<210>68

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>68

leusertrpleuhisglnargproglyglnproproargleuleuile

151015

tyr

<210>69

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>69

glnileser

1

<210>70

<211>36

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>70

asnargpheserglyvalproaspargpheserglyserglythrgly

151015

thraspphethrleulysileserargvalglualagluaspalagly

202530

iletyrtyrcys

35

<210>71

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>71

metglnglythrglupheproargthr

15

<210>72

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>72

pheglyglnglythrlysvalgluilelys

1510

<210>73

<211>384

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>73

gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttgatacagcctggggggtccctgagactc60

tcctgtgcaacctctggattcacctttagaacttcttccatgagttgggtccgtcgggct120

ccagggaaggggctggaatgggtctcagctattggtgctgaaagtcatgacacgcactac180

acagactccgcggagggccggttcaccatctccaaagactattcaaagaacacagtatat240

ctgcagatgaacggcctgagagtcgacgacacggccatatattattgtgcccatcactat300

tactatggctcgcggcagaaacccaaagattggggagatgcttttgatatgtggggccag360

gggacaatggtctccgtctcttca384

<210>74

<211>128

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>74

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuileglnproglygly

151015

serleuargleusercysalathrserglyphethrpheargthrser

202530

sermetsertrpvalargargalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralaileglyalagluserhisaspthrhistyrthraspserala

505560

gluglyargphethrileserlysasptyrserlysasnthrvaltyr

65707580

leuglnmetasnglyleuargvalaspaspthralailetyrtyrcys

859095

alahishistyrtyrtyrglyserargglnlysprolysasptrpgly

100105110

aspalapheaspmettrpglyglnglythrmetvalservalserser

115120125

<210>75

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>75

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuileglnproglygly

151015

serleuargleusercysalathrser

2025

<210>76

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>76

glyphethrpheargthrserser

15

<210>77

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>77

metsertrpvalargargalaproglylysglyleuglutrpvalser

151015

ala

<210>78

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>78

ileglyalagluserhisaspthr

15

<210>79

<211>38

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>79

histyrthraspseralagluglyargphethrileserlysasptyr

151015

serlysasnthrvaltyrleuglnmetasnglyleuargvalaspasp

202530

thralailetyrtyrcys

35

<210>80

<211>21

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>80

alahishistyrtyrtyrglyserargglnlysprolysasptrpgly

151015

aspalapheaspmet

20

<210>81

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>81

trpglyglnglythrmetvalservalserser

1510

<210>82

<211>321

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>82

gacatccagatgacccagtctccatcttctgtgtctgcatctgtaggagacagagtcacc60

atcacttgtcgggcgagtcaggatattagcacctggttaacctggtatcagcagagagca120

gggaaggcccctaacctcctgatctatggtgcatccactttggaagatggggtcccatcc180

aggttcagcggcagtggatccgggacagatttcactctcactatcgacagcctgcagcct240

gacgattttgcaacttactattgtcaacagtctcacagtttcccctacacttttggccag300

gggacccagctggggatctca321

<210>83

<211>107

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>83

aspileglnmetthrglnserproserservalseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcysargalaserglnaspileserthrtrp

202530

leuthrtrptyrglnglnargalaglylysalaproasnleuleuile

354045

tyrglyalaserthrleugluaspglyvalproserargphesergly

505560

serglyserglythraspphethrleuthrileaspserleuglnpro

65707580

aspaspphealathrtyrtyrcysglnglnserhisserpheprotyr

859095

thrpheglyglnglythrglnleuglyileser

100105

<210>84

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>84

aspileglnmetthrglnserproserservalseralaservalgly

151015

aspargvalthrilethrcysargalaser

2025

<210>85

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>85

glnaspileserthrtrp

15

<210>86

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>86

leuthrtrptyrglnglnargalaglylysalaproasnleuleuile

151015

tyr

<210>87

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>87

glyalaser

1

<210>88

<211>36

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>88

thrleugluaspglyvalproserargpheserglyserglysergly

151015

thraspphethrleuthrileaspserleuglnproaspasppheala

202530

thrtyrtyrcys

35

<210>89

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>89

glnglnserhisserpheprotyrthr

15

<210>90

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>90

pheglyglnglythrglnleuglyileser

1510

<210>91

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>91

taatacgactcactataggttcggggaagtagtccttgaccagg44

<210>92

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>92

taatacgactcactatagggatagaagttattcagcaggcacac44

<210>93

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>93

taatacgactcactataggcgtcaggctcagrtagctgctggccgc46

<210>94

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>94

aatacgactcactataggttcggggaagtagtccttgaccagg43

<210>95

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>95

taatacgactcactatagggatagaagttattcagcaggcacac44

<210>96

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>96

taatacgactcactataggcgtcaggctcagrtagctgctggccgc46

<210>97

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>97

tcaccatggactgsacctgga21

<210>98

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>98

ccatggacacactttgytccac22

<210>99

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>99

tcaccatggagtttgggctgagc23

<210>100

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>100

agaacatgaaacayctgtggttctt25

<210>101

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>101

atggggtcaaccgccatcct20

<210>102

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>102

acaatgtctgtctccttcctcat23

<210>103

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>103

gctcagctcctggggctcctg21

<210>104

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>104

ctggggctgctaatgctctgg21

<210>105

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>105

ttcctcctgctactctggctc21

<210>106

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>106

cagacccaggtcttcatttct21

<210>107

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>107

cctctcctcctcaccctcct20

<210>108

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>108

ctcctcactcagggcaca18

<210>109

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>109

atggcctggaycsctctcc19

<210>110

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>110

gccagggggaagacsgatg19

<210>111

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>111

tttcaactgctcatcagatggcgg24

<210>112

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>112

agctcctcagaggagggygg20

<210>113

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>113

caggtscagctggtrcagtc20

<210>114

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>114

cagrtcaccttgaaggagtc20

<210>115

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>115

saggtgcagctggtggagtc20

<210>116

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>116

caggtgcagctgcaggagtc20

<210>117

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>117

gargtgcagctggtgcagtc20

<210>118

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>118

caggtacagctgcagcagtc20

<210>119

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>119

cgmcatccrgwtgacccagt20

<210>120

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>120

cgatrttgtgatgacycag19

<210>121

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>121

cgaaatwgtgwtgacrcagtct22

<210>122

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>122

cgacatcgtgatgacccagt20

<210>123

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>123

ccagtctgtgctgactcagc20

<210>124

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>124

ccagtctgccctgactcagc20

<210>125

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>125

ctcctatgagctgacwcagc20

<210>126

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>126

gacsgatgggcccttggtgga21

<210>127

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>127

aagatgaagacagatggtgc20

<210>128

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>128

gggaacagagtgaccg16

<210>129

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>129

tcactatggactggatttgga21

<210>130

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>130

ccatggacayactttgytccac22

<210>131

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>131

gtaggagacatgcaaatagggcc23

<210>132

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>132

aacaaagctatgacatatagatc23

<210>133

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>133

atggagttggggctgagctgggtt24

<210>134

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>134

agttgttaaatgtttatcgcaga23

<210>135

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>135

aggtaattcatggagaaatagaa23

<210>136

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>136

agaacatgaagcayctgtggttctt25

<210>137

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>137

atggactggacctggagcatc21

<210>138

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>138

cctctgctgatgaaaaccagccc23

<210>139

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>139

caggtycagctkgtgcagtc20

<210>140

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>140

caratgcagctggtgcagtc20

<210>141

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>141

cagrtcaccttgarggagtctggt24

<210>142

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>142

gargtgcagctgktggagtc20

<210>143

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>143

gaggtacaactggtggagtc20

<210>144

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>144

gaggatcagctggtggagtc20

<210>145

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>145

caggtgcagctacagcagtg20

<210>146

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>146

cagctgcagctgcaggagtc20

<210>147

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成引物

<400>147

caggtgcagctggtgcaatc20

<210>148

<211>351

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>148

caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtggagccttcggggaccctgtccctc60

acctgcactgtgtctggtggctccatcagcaggagtaactggtggagttgggtccgccag120

cccccaggggaggggctggaatggattggagaaatccatcacattgggaggtccagctac180

aatccgtccctcaagagtcgagtcaccatgtctgtagacaagtcccagaaccagttctcc240

ctgaggctgacctctgtgaccgccgcggacacggccgtgtattactgtgcgaaaaatggc300

tactacgctatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcg351

<210>149

<211>117

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>149

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvalgluprosergly

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglyglyserileserargser

202530

asntrptrpsertrpvalargglnproproglygluglyleuglutrp

354045

ileglygluilehishisileglyargsersertyrasnproserleu

505560

lysserargvalthrmetservalasplysserglnasnglnpheser

65707580

leuargleuthrservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcys

859095

alalysasnglytyrtyralametaspvaltrpglyglnglythrthr

100105110

valthrvalserser

115

<210>150

<211>354

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>150

gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccacc60

ctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcgacttcctagcctggtaccagcagaaa120

cctggccaggctcccaggctcctcatctacgctacatccttcagggccactggcatctca180

gacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttctctctcaccatcaacagactggaa240

cctgaagattttgcagtgtattactgtcagcactatcgtagttcacctccgtggtacact300

tttgcccaggggaccaagctggacatgagacgtacggtggctgcaccatctgtc354

<210>151

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>151

gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly

151015

gluargalathrleusercysargalaserglnservalserserasp

202530

pheleualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleu

354045

iletyralathrserpheargalathrglyileseraspargpheser

505560

glyserglyserglythrasppheserleuthrileasnargleuglu

65707580

progluaspphealavaltyrtyrcysglnhistyrargserserpro

859095

protrptyrthrphealaglnglythrlysleuaspmetargargthr

100105110

valalaalaproserval

115

<210>152

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>152

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvalgluprosergly

151015

thrleuserleuthrcysthrvalser

2025

<210>153

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>153

glyglyserileserargserasntrp

15

<210>154

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>154

trpsertrpvalargglnproproglygluglyleuglutrpilegly

151015

glu

<210>155

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>155

glyglnglythrthrvalthrvalserser

1510

<210>156

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>156

ilehishisileglyargser

15

<210>157

<211>37

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>157

sertyrasnproserleulysserargvalthrmetservalasplys

151015

serglnasnglnpheserleuargleuthrservalthralaalaasp

202530

thralavaltyrtyr

35

<210>158

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>158

cysalalysasnglytyrtyralametaspvaltrp

1510

<210>159

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>159

gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly

151015

gluargalathrleusercysargalaser

2025

<210>160

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>160

glnservalserseraspphe

15

<210>161

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>161

leualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleuile

151015

tyr

<210>162

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>162

alathrser

1

<210>163

<211>35

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>163

pheargalathrglyileseraspargpheserglyserglysergly

151015

thrasppheserleuthrileasnargleugluprogluasppheala

202530

valtyrtyr

35

<210>164

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>164

cysglnhistyrargserserproprotrptyrthrphe

1510

<210>165

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>165

alaglnglythrlysleuaspmetargargthrvalalaalaproser

151015

val

<210>166

<211>37

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>166

asnserasnproserleulysserargvalileileservalasplys

151015

serlysasnhispheserleuthrleuasnservalthralaalaasp

202530

thralavaltyrtyr

35

<210>167

<211>351

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>167

caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggggaccctgtccctc60

acctgcgctgtctctggtgcctccattaccaatggtgcctggtggagttgggtccgccag120

cccccagggaaggggctggagtggattggagaaatctatcttaatgggaacaccaactcc180

aacccgtccctgaagagtcgagtcatcatatcagtggacaagtccaagaaccacttctcg240

ctgaccctgaactctgtgaccgccgcggacacggccgtgtattactgtgcgaagaacgct300

gcctacaaccttgagttctggggccagggagccctggtcaccgtctcctca351

<210>168

<211>117

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>168

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysprosergly

151015

thrleuserleuthrcysalavalserglyalaserilethrasngly

202530

alatrptrpsertrpvalargglnproproglylysglyleuglutrp

354045

ileglygluiletyrleuasnglyasnthrasnserasnproserleu

505560

lysserargvalileileservalasplysserlysasnhispheser

65707580

leuthrleuasnservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcys

859095

alalysasnalaalatyrasnleugluphetrpglyglnglyalaleu

100105110

valthrvalserser

115

<210>169

<211>327

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>169

gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccacc60

ctctcctgcagggccagtcagactgttagcagcccctacgtagcctggtaccagcagaaa120

cgtggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccaccagggccaccggcatccca180

gacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggag240

cctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatgatagatcatactattacactttt300

ggccaggggaccaagctggagatcaaa327

<210>170

<211>109

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>170

gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly

151015

gluargalathrleusercysargalaserglnthrvalserserpro

202530

tyrvalalatrptyrglnglnlysargglyglnalaproargleuleu

354045

iletyrglyalaserthrargalathrglyileproaspargpheser

505560

glyserglyserglythraspphethrleuthrileserargleuglu

65707580

progluaspphealavaltyrtyrcysglnglntyraspargsertyr

859095

tyrtyrthrpheglyglnglythrlysleugluilelys

100105

<210>171

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>171

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysprosergly

151015

thrleuserleuthrcysalavalser

2025

<210>172

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>172

glyalaserilethrasnglyalatrp

15

<210>173

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>173

trpsertrpvalargglnproproglylysglyleuglutrpilegly

151015

glu

<210>174

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>174

iletyrleuasnglyasnthr

15

<210>175

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>175

glyglnglythrleuvalthrvalserseralaserthrlys

1510

<210>176

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>176

cysalalysasnalaalatyrasnleugluphetrp

1510

<210>177

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>177

glyglnglyalaleuvalthrvalserser

1510

<210>178

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>178

gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly

151015

gluargalathrleusercysargalaser

2025

<210>179

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>179

glnthrvalserserprotyr

15

<210>180

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>180

valalatrptyrglnglnlysargglyglnalaproargleuleuile

151015

tyr

<210>181

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>181

glyalaser

1

<210>182

<211>35

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>182

thrargalathrglyileproaspargpheserglyserglysergly

151015

thraspphethrleuthrileserargleugluprogluasppheala

202530

valtyrtyr

35

<210>183

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>183

cysglnglntyraspargsertyrtyrtyrthrphe

1510

<210>184

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>184

glyglnglythrlysleugluilelys

15

<210>185

<211>360

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>185

caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaacctgtcgctc60

acctgcactgtctctgatgcctccatgagtgattatcactggagctggatccggcaggcc120

gccgggaagggactggagtggattgggcgtatgtacagcactgggagtccctactacaaa180

ccctccctcaaaggtcgggtcaccatgtcaatagacacgtccaagaaccagttctccctg240

aagctggcctctgtgaccgccgcagacacggccatctattattgtgcgagcggacaacat300

attggtggctgggtcccccctgacttctggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca360

<210>186

<211>120

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>186

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

asnleuserleuthrcysthrvalseraspalasermetserasptyr

202530

histrpsertrpileargglnalaalaglylysglyleuglutrpile

354045

glyargmettyrserthrglyserprotyrtyrlysproserleulys

505560

glyargvalthrmetserileaspthrserlysasnglnpheserleu

65707580

lysleualaservalthralaalaaspthralailetyrtyrcysala

859095

serglyglnhisileglyglytrpvalproproaspphetrpglygln

100105110

glythrleuvalthrvalserser

115120

<210>187

<211>339

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>187

gatattgtgatgacccagactccactctcctcacctgtcacccttggacagccggcctcc60

atctcctgcaggtctagtgaaggcctcgtatatagtgatggagacacctacttgagttgg120

tttcaccagaggccaggccagcctccaagactcctgatttataaaatttctaaccggttc180

tctggggtccccgacagattcagtggcagtggggcaggcacagatttcacactgaaaatc240

agcagggtggaggctgaggatgtcggggtttattactgcatgcaagctacacattttccg300

tggacgttcggccaggggaccaaagtggaagtcaaacgt339

<210>188

<211>113

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>188

aspilevalmetthrglnthrproleuserserprovalthrleugly

151015

glnproalaserilesercysargsersergluglyleuvaltyrser

202530

aspglyaspthrtyrleusertrpphehisglnargproglyglnpro

354045

proargleuleuiletyrlysileserasnargpheserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyalaglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnala

859095

thrhispheprotrpthrpheglyglnglythrlysvalgluvallys

100105110

arg

<210>189

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>189

glnvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

asnleuserleuthrcysthrvalser

2025

<210>190

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>190

aspalasermetserasptyrhis

15

<210>191

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>191

trpsertrpileargglnalaalaglylysglyleuglutrpilegly

151015

arg

<210>192

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>192

mettyrserthrglyserpro

15

<210>193

<211>37

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>193

tyrtyrlysproserleulysglyargvalthrmetserileaspthr

151015

serlysasnglnpheserleulysleualaservalthralaalaasp

202530

thralailetyrtyr

35

<210>194

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>194

cysalaserglyglnhisileglyglytrpvalproproaspphetrp

151015

<210>195

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>195

glyglnglythrleuvalthrvalserser

1510

<210>196

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>196

aspilevalmetthrglnthrproleuserserprovalthrleugly

151015

glnproalaserilesercysargserser

2025

<210>197

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>197

gluglyleuvaltyrseraspglyaspthrtyr

1510

<210>198

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>198

leusertrpphehisglnargproglyglnproproargleuleuile

151015

tyr

<210>199

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>199

lysileser

1

<210>200

<211>35

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>200

asnargpheserglyvalproaspargpheserglyserglyalagly

151015

thraspphethrleulysileserargvalglualagluaspvalgly

202530

valtyrtyr

35

<210>201

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>201

cysmetglnalathrhispheprotrpthrphe

1510

<210>202

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>202

glyglnglythrlysvalgluvallysarg

1510

<210>203

<211>333

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>203

gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60

tcctgtgcagcctctggattcacctttagttcatatggcttgacctggatacgccaggct120

ccggggaagggcctggagtgggtctcaagtatcagtggcagtggcaataacacatactac180

gcagactctgtgaagggccggttcaccatctccagagacaaagtcaagaagacactatat240

ctacaaatggacagcctgacagtcggagacacggccgtctattactgcttaggagtcggt300

cagggccacggaattccggtcatcgtctcctca333

<210>204

<211>111

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>204

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

glyleuthrtrpileargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

serserileserglyserglyasnasnthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargasplysvallyslysthrleutyr

65707580

leuglnmetaspserleuthrvalglyaspthralavaltyrtyrcys

859095

leuglyvalglyglnglyhisglyileprovalilevalserser

100105110

<210>205

<211>336

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>205

gatattgtgatgacccagactccactctcctcacctgtcacccttggacagccggcctcc60

atctcctgcaggtctagtcagagcctcgtacaccgtgatggaaacacctacttgagttgg120

tttctgcagaggccaggccaggctccaagactcctaatttatcggatttctaaccggttc180

tctggggtcccagacagattcagtggcagtggggcagggacggatttcacactgaaaatc240

agcagggtggaagctgaggatgtcggcgtttactactgcatgcaagctacacaaatcccc300

aacacttttggccaggggaccaagctggagatcaag336

<210>206

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>206

aspilevalmetthrglnthrproleuserserprovalthrleugly

151015

glnproalaserilesercysargserserglnserleuvalhisarg

202530

aspglyasnthrtyrleusertrppheleuglnargproglyglnala

354045

proargleuleuiletyrargileserasnargpheserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyalaglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnala

859095

thrglnileproasnthrpheglyglnglythrlysleugluilelys

100105110

<210>207

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>207

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaser

2025

<210>208

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>208

glyphethrphesersertyrgly

15

<210>209

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>209

leuthrtrpileargglnalaproglylysglyleuglutrpvalser

151015

ser

<210>210

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>210

ileserglyserglyasnasnthr

15

<210>211

<211>37

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>211

tyrtyralaaspservallysglyargphethrileserargasplys

151015

vallyslysthrleutyrleuglnmetaspserleuthrvalglyasp

202530

thralavaltyrtyr

35

<210>212

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>212

cysleuglyvalglygln

15

<210>213

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>213

glyhisglyileprovalilevalserser

1510

<210>214

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>214

aspilevalmetthrglnthrproleuserserprovalthrleugly

151015

glnproalaserilesercysargserser

2025

<210>215

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>215

glnserleuvalhisargaspglyasnthrtyr

1510

<210>216

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>216

leusertrppheleuglnargproglyglnalaproargleuleuile

151015

tyr

<210>217

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>217

argileser

1

<210>218

<211>35

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>218

asnargpheserglyvalproaspargpheserglyserglyalagly

151015

thraspphethrleulysileserargvalglualagluaspvalgly

202530

valtyrtyr

35

<210>219

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>219

cysmetglnalathrglnileproasnthrphe

1510

<210>220

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>220

glyglnglythrlysleugluilelys

15

<210>221

<211>363

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>221

gaggtgcagctggtggagtctggaggaggcttaatccagccgggggggtccctaagactc60

tcctgtgcagcctcgggcttcctcatcagtagttatttcatgagctgggtccgccaggct120

ccagggaaggggccggagtgggtctcagttatttatagcgatggtagtacatattacgta180

gactccgtgaagggccgattcaccatctccacagacaattccaagaacacactatatctt240

cagatgaacagcctgagagccgaggacacggcccgatattactgtgcgacacggcatttg300

aattatgacggtgaccactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagcctccacc360

aag363

<210>222

<211>121

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>222

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuileglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglypheleuilesersertyr

202530

phemetsertrpvalargglnalaproglylysglyproglutrpval

354045

servaliletyrseraspglyserthrtyrtyrvalaspservallys

505560

glyargphethrileserthraspasnserlysasnthrleutyrleu

65707580

glnmetasnserleuargalagluaspthralaargtyrtyrcysala

859095

thrarghisleuasntyraspglyasphistrpglyglnglythrleu

100105110

valthrvalserseralaserthrlys

115120

<210>223

<211>348

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>223

gatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccttggacagccggcctcc60

atctcctgcaggtctagtcaaagcctcgtacacagtgacggaaacacctacttgaattgg120

tttcaccagaggccaggccaatctccaaggcgcctaatttataaggtttctaagcgggac180

tctggggtcccagacagattcagcggcagtgggtcaggtagtgatttcacactgaaaatc240

agcagggtggaggctgaggatgttggaatttattactgcatgcaaggtacacattggccg300

acgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgaactgtggctgca348

<210>224

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>224

aspvalvalmetthrglnserproleuserleuprovalthrleugly

151015

glnproalaserilesercysargserserglnserleuvalhisser

202530

aspglyasnthrtyrleuasntrpphehisglnargproglyglnser

354045

proargargleuiletyrlysvalserlysargaspserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglyseraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyiletyrtyrcysmetglngly

859095

thrhistrpprothrpheglyglnglythrlysvalgluilelysarg

100105110

thrvalalaala

115

<210>225

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>225

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuileglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaser

2025

<210>226

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>226

glypheleuilesersertyrphe

15

<210>227

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>227

metsertrpvalargglnalaproglylysglyproglutrpvalser

151015

val

<210>228

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>228

iletyrseraspglyserthr

15

<210>229

<211>37

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>229

tyrtyrvalaspservallysglyargphethrileserthraspasn

151015

serlysasnthrleutyrleuglnmetasnserleuargalagluasp

202530

thralaargtyrtyr

35

<210>230

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>230

cysalathrarghisleuasntyraspglyasphistrp

1510

<210>231

<211>26

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>231

aspvalvalmetthrglnserproleuserleuprovalthrleugly

151015

glnproalaserilesercysargserser

2025

<210>232

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>232

glnserleuvalhisseraspglyasnthrtyr

1510

<210>233

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>233

leuasntrpphehisglnargproglyglnserproargargleuile

151015

tyr

<210>234

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>234

lysvalser

1

<210>235

<211>35

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多肽

<400>235

lysargaspserglyvalproaspargpheserglyserglysergly

151015

seraspphethrleulysileserargvalglualagluaspvalgly

202530

iletyrtyr

35

<210>236

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>236

cysmetglnglythrhistrpprothrphe

1510

<210>237

<211>14

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>237

glyglnglythrlysvalgluilelysargthrvalalaala

1510

<210>238

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成肽

<400>238

glyleuasnaspilepheglualaglnlysileglutrphisglu

151015

1