本專利主要用于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的質(zhì)量控制，并可為相關(guān)研究提供評(píng)估細(xì)胞遷移能力的方法，尤其是一種用于篩選強(qiáng)遷移能力的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的流式試劑盒。
背景技術(shù)：
：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSC,umbilicalcordmesenchymalstemcells)是間充質(zhì)干細(xì)胞家族的重要成員，屬于多能干細(xì)胞。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有較高的分化潛能，可向軟骨、脂肪、內(nèi)皮等多個(gè)方向分化，并具有一定的免疫調(diào)控作用，此外，UC-MSC與廣為人知的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC，bonemarrowmesenchymalstemcells)相比，具有來(lái)源豐富、制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。目前，UC-MSC制劑在骨關(guān)節(jié)疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病等疾病的治療中均展現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用前景，CFDA也于2015年8月21日發(fā)布了《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》。根據(jù)《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》中“干細(xì)胞制劑的質(zhì)量控制—干細(xì)胞制劑的檢驗(yàn)—細(xì)胞檢驗(yàn)”所述，應(yīng)對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行純度檢測(cè)，以確保干細(xì)胞治療的安全性和有效性。然而，實(shí)踐表明通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)得到相近純度的不同細(xì)胞樣本，卻在遷移能力等方面存在較大差異，這將直接影響制劑的有效性。此外，考慮到干細(xì)胞制劑涉及到臨床應(yīng)用，最大限度保障患者人身安全更是純度檢測(cè)過(guò)程中的重中之重。因此確立一套更為精準(zhǔn)有效且能反應(yīng)細(xì)胞制劑安全性與有效性的細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)方法已成為業(yè)內(nèi)公認(rèn)的難題。目前業(yè)內(nèi)普遍采用P2-P5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞用于臨床前研究，實(shí)踐表明每根臍帶經(jīng)剪切分離法平均僅可獲得約1.98*107的P1代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，因此降低質(zhì)量控制過(guò)程中對(duì)細(xì)胞樣本的消耗顯得尤為重要。然而通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)的方法對(duì)UC-MSC的表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需滿足以下多種條件方能保證檢查的準(zhǔn)確度。首先，目前業(yè)內(nèi)公認(rèn)的最優(yōu)檢測(cè)體系為每管含0.5mL密度為1*106的細(xì)胞樣本，檢測(cè)管數(shù)由需要檢測(cè)的表面標(biāo)志物種類決定；其次，考慮到使用不同熒光染料進(jìn)行多色標(biāo)記時(shí)，發(fā)射光會(huì)溢漏至其他檢測(cè)通道中，需要使用單色光對(duì)照管和FMO對(duì)照管以獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；若使用單色染料進(jìn)行檢測(cè)，由于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，需檢測(cè)多種陽(yáng)性表面標(biāo)志物，同樣會(huì)導(dǎo)致樣本管數(shù)增加，造成樣本損失。此外，考慮到目前流式細(xì)胞儀的市場(chǎng)應(yīng)用情況，目前主流的流式細(xì)胞儀的配置多為488nm和633nm雙波長(zhǎng)激發(fā)光，除兩個(gè)散射光檢測(cè)通道外，一般只配備4-8個(gè)發(fā)射光檢測(cè)通道。總的來(lái)說(shuō)，如何在控制細(xì)胞樣本消耗量和保證檢測(cè)精度之間找到平衡點(diǎn)，設(shè)計(jì)出一套適用于主流流式細(xì)胞儀的實(shí)驗(yàn)方案成為了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞純度檢測(cè)的一大難點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種用于篩選具有較強(qiáng)遷移能力的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的流式檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明通過(guò)對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，從而使檢測(cè)結(jié)果與細(xì)胞樣本的遷移能力與有效性直接關(guān)聯(lián)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種用于篩選具有較強(qiáng)遷移能力的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的流式檢測(cè)試劑盒，試劑盒組成：具體說(shuō)明如下：⑴StandardMixture：將ZPH-MMA30K型30微米標(biāo)準(zhǔn)微球溶于1.5mL蒸餾水，與F-13838型15微米標(biāo)準(zhǔn)微球相混合，超聲處理30s后振蕩混勻，存放于4℃條件下，得到StandardMixture；⑵IsotypeMixture：將350μL的PE-IgG1k(554680)抗體、250μL的APC-IgG1k(554681)抗體、1150μL的FITC-IgG1k(555748)抗體、250μL的PerCP-Cy5.5-IgG1k(550795)抗體相混合，避光存放于4℃條件下，得到IsotypeMixture；⑶PositiveMixture：將295μL的PE-CD105(560839)抗體、295μL的APC-CD73(560847)抗體、115μL的FITC-CD90(555595)抗體、295μL的PerCP-Cy5.5-CD166(562131)抗體相混合，避光存放于4℃條件下，得到PositiveMixture；⑷NegativeMixture：將240μL的FITC-CD11b(562793)抗體、952μL的PE-CD34/FITC-HLA-DR(333181)抗體、952μL的PE-CD45(555483)抗體、952μL的PE-CD19(555413)抗體、952μL的PE-CD80(557227)抗體、952μL的PE-CD86(560957)抗體相混合，避光存放于4℃條件下。而且，操作步驟如下：(1)取1.5*106量的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞樣本，經(jīng)離心、洗滌，用PBS重懸后制成密度為5*106cells/mL的細(xì)胞懸液A；(2)取4支一次性流式上樣管，分別命名為STD管、ISO管、POS管、NEG管；(3)向STD管加入0.5mLPBS，向ISO管、POS管、NEG管分別加入100μL細(xì)胞懸液A；(4)向ISO管、POS管、NEG管分別加入20μLIsotypeMixture、10μLPositiveMixture、50μLNegativeMixture，在15℃條件下避光孵育30min；(5)向ISO管、POS管、NEG管均加入2mLPBS，在15℃條件下200g離心3min后去除上清液，重復(fù)本步驟2次；(6)將StandardMixture超聲處理30s后振蕩混勻后取25μL加入至STD管，向ISO管、POS管、NEG管分別加入500μLPBS，將STD管、ISO管、POS管、NEG管振蕩混勻；(7)依照STD管、ISO管、POS管、NEG管的順序上機(jī)檢測(cè)。本發(fā)明具有的有益效果：本發(fā)明通過(guò)檢測(cè)更多種有實(shí)際意義的細(xì)胞表面標(biāo)志物，從而最大限度的保障臨床患者的安全。本發(fā)明在不影響準(zhǔn)確度且不減少標(biāo)志物種類的前提下減少檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物過(guò)程中對(duì)細(xì)胞樣本的消耗量。本發(fā)明在不影響準(zhǔn)確度且不減少標(biāo)志物種類的前提下通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案降低對(duì)儀器設(shè)備的要求。本發(fā)明通過(guò)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)“Gate”和增加檢測(cè)CD166使檢測(cè)結(jié)果直接與細(xì)胞遷移能力與有效性相關(guān)聯(lián)；本發(fā)明確保多種免疫排斥相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)志物如CD80\CD86為陰性，從而保證臨床患者人身安全；本發(fā)明減少了檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的過(guò)程中對(duì)細(xì)胞樣本的消耗量。附圖說(shuō)明圖1為不同樣本遷移能力比較示意圖；圖2為SAM2中STD-FSC/SSC散點(diǎn)圖；圖3為SAM2中ISO-FSC/SSC散點(diǎn)圖；圖4為SAM2中ISO-PE/FITC散點(diǎn)圖；圖5為SAM2中ISO-PerCP-Cy5.5/APC散點(diǎn)圖；圖6為SAM2中POS-PE/FITC散點(diǎn)圖；圖7為SAM2中POS-PerCP-Cy5.5/APC散點(diǎn)圖；圖8為SAM2中NEG-PE/FITC散點(diǎn)圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明通過(guò)15μm和30μm標(biāo)準(zhǔn)直徑的微球來(lái)輔助設(shè)定FSC-SSC圖中需要采集熒光信號(hào)的區(qū)域，即業(yè)內(nèi)稱呼的“Gate”；增加了對(duì)于CD166、CD86、CD80的檢測(cè)；使用了PE-CD105、APC-CD73、FITC-CD90、PerCP-Cy5.5-CD166的PositiveMixture及FITC-CD11b、PE-CD34、PE-CD45、PE-CD19、PE-CD80、PE-CD86、FITC-HLA-DR的NegativeMixture；StandardMixture、IsotypeMixture、PositiveMixture、NegativeMixture的配方；進(jìn)行檢測(cè)時(shí)的實(shí)驗(yàn)步驟及數(shù)據(jù)處理方法，包括但不限于各種試劑與樣本管之間的滴加關(guān)系、純度計(jì)算方式、如何通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)微球來(lái)設(shè)定信號(hào)采集區(qū)域等。一種用于篩選具有較強(qiáng)活性的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的流式檢測(cè)試劑盒，具體說(shuō)明如下：一、試劑盒組成：1.StandardMixture：將ZPH-MMA30K型標(biāo)準(zhǔn)微球溶于1.5mL蒸餾水，與F-13838型15微米標(biāo)準(zhǔn)微球相混合，超聲處理30s后振蕩混勻，存放于4℃條件下，得到StandardMixture(共2.5mL，100tests，25μL/test)；2.IsotypeMixture：將350μL的554680抗體、250μL的554681抗體、1150μL的555748抗體、250μL的550795抗體相混合，避光存放于4℃條件下，得到IsotypeMixture(各組分品牌均為BD，共2mL，100tests，20μL/test)；3.PositiveMixture：將295μL的560839抗體、295μL的560847抗體、115μL的555595抗體、295μL的562131抗體相混合，避光存放于4℃條件下，得到PositiveMixture(各組分品牌均為BD，共1mL，100tests，10μL/test)；4.NegativeMixture：將240μL的562793抗體、952μL的333181抗體、952μL的555483抗體、952μL的555413抗體、952μL的557227抗體、952μL的560957抗體相混合，避光存放于4℃條件下，得到NegativeMixture(各組分品牌均為BD，共5mL，100tests，50μL/test)。二、實(shí)驗(yàn)步驟1、取1.5*106量的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞樣本，經(jīng)離心、洗滌，用PBS重懸后制成密度為5*106cells/mL的細(xì)胞懸液A；2、取4支一次性流式上樣管，分別命名為STD管、ISO管、POS管、NEG管；3、向STD管加入0.5mLPBS，向ISO管、POS管、NEG管分別加入100μL細(xì)胞懸液A；4、向ISO管、POS管、NEG管分別加入20μLIsotypeMixture、10μLPositiveMixture、50μLNegativeMixture，在15℃條件下避光孵育30min；5、向ISO管、POS管、NEG管均加入2mLPBS，在15℃條件下200g離心3min后去除上清液，重復(fù)本步驟2次；6、將StandardMixture超聲處理30s后振蕩混勻后取25μL加入至STD管，向ISO管、POS管、NEG管分別加入500μLPBS，將STD管、ISO管、POS管、NEG管振蕩混勻；7、依照STD管、ISO管、POS管、NEG管的順序上機(jī)檢測(cè)。三、數(shù)據(jù)處理1.以BD-Diva7.0系統(tǒng)為例，首先檢測(cè)STD管，設(shè)立FSC/SSC散點(diǎn)圖(圖2)，調(diào)整電壓至令STD管中兩群顆粒的FSC值分布于50*103-150*103之間，以FSC值為50*103-150*103，SSC值為20*103-200*103設(shè)定“Gate”為P1；2.在STD管的電壓下檢測(cè)ISO管，取P1內(nèi)高密度的區(qū)域?yàn)镻2(圖3)，在P2下創(chuàng)建PE/FITC散點(diǎn)圖(圖4)和PerCP-Cy5.5/APC散點(diǎn)圖(圖5)，調(diào)整電壓將細(xì)胞群的熒光強(qiáng)度控制于3*103左右；3.在上述電壓下檢測(cè)POS管，調(diào)節(jié)單色光補(bǔ)償后，分別記錄PE/FITC散點(diǎn)圖(圖6)中雙陽(yáng)性區(qū)域的數(shù)值為A1，PerCP-Cy5.5/APC散點(diǎn)圖(圖7)中全部APC陽(yáng)性區(qū)域的數(shù)值為A2，PerCP-Cy5.5/APC散點(diǎn)圖中全部PerCP-Cy5.5陽(yáng)性區(qū)域的數(shù)值為A3；4.在上述電壓下檢測(cè)NEG管，記錄PE/FITC散點(diǎn)圖(圖8)中雙陽(yáng)性區(qū)域的數(shù)值為A4。四、數(shù)據(jù)分析與參考標(biāo)準(zhǔn)1、活性計(jì)算公式為：活性％＝[P1*P2*(100-A4)*A1*A2*A3]％(注：此公式中，若Pn/An的值為X％，運(yùn)算時(shí)直接采用X來(lái)計(jì)算)1.判定標(biāo)準(zhǔn)為：①若活性大于70％，且A4小于2％，且A1*A2大于95％，則判定該細(xì)胞樣本為合格；②若活性小于70％，或A4大于2％，或A1*A2小于95％，則判定該細(xì)胞樣本為不合格。五、實(shí)驗(yàn)舉例及結(jié)果驗(yàn)證1.選取三例典型樣本分別命名為SAM1、SAM2、SAM3，檢測(cè)數(shù)據(jù)如下：樣本號(hào)P1P2A1A2A3A4活性SAM186.9％91.6％96.9％99.2％98.7％1.2％74.61％SAM271.4％86.8％97.2％98.9％96.7％1.0％57.03％SAM384.2％88.3％97.3％99.0％82.3％1.2％58.23％2.通過(guò)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞活性，結(jié)果如下(結(jié)果比較見(jiàn)附圖1)：當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3