本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種萊茵衣藻富硒突變體的篩選方法。

背景技術(shù)：

硒是一種生物必需的微量元素，若人體長(zhǎng)期缺硒并且得不到補(bǔ)充，那么與硒有關(guān)的代謝過(guò)程就會(huì)被阻滯，從而導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生。微量的硒元素能提高人體免疫力，激發(fā)人體產(chǎn)生免疫球蛋白及抗體，增強(qiáng)特異性免疫。同時(shí)硒還具有抗氧化的作用，是抗氧化物酶谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的重要組成成分，具有清除體內(nèi)過(guò)多的活性氧自由基，切斷過(guò)氧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜和染色體的結(jié)構(gòu)不被破壞，以及保護(hù)核糖核酸等大分子生物活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，起到抗衰老、抗癌的作用。

硒是一種半金屬，存在形式多樣，主要以無(wú)機(jī)硒的形式存在，在動(dòng)物體內(nèi)的生物利用率低且容易引起硒中毒，有機(jī)硒才是人和動(dòng)物補(bǔ)充硒的主要形式。自然界中存在自身能富集硒的植物與藻類，如紫云英植物，能將硒轉(zhuǎn)化為具有生物活性的硒化合物。出于對(duì)健康的考慮，現(xiàn)已將這些植物開(kāi)發(fā)成為富硒的益于健康的產(chǎn)品。同時(shí)富硒植物和藻類也可作為環(huán)境中富硒水體和土壤的生物凈化器。

藻類對(duì)硒的生物循環(huán)起著重要的作用，藻類能富集無(wú)機(jī)硒，轉(zhuǎn)化成其他生物可利用的有機(jī)硒，為各級(jí)消費(fèi)者提供硒營(yíng)養(yǎng)。但是，并不是越高的硒濃度越有利于藻類的生長(zhǎng)。研究表明，硒只在低濃度較窄范圍內(nèi)促進(jìn)藻類的生長(zhǎng)，超過(guò)這個(gè)濃度范圍就會(huì)對(duì)藻類產(chǎn)生傷害，抑制藻類生長(zhǎng)，造成藻類硒中毒死亡。硒的存在形式不同，對(duì)藻類產(chǎn)生毒性的濃度范圍有很大差異。Morlon等人用亞硒酸鹽研究了不同濃度范圍對(duì)衣藻的毒性，發(fā)現(xiàn)了當(dāng)亞硒酸鹽濃度達(dá)到0.05mmol/L時(shí)，對(duì)衣藻的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。Laure等用硒酸鹽研究了不同濃度范圍對(duì)衣藻的毒性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)硒酸鹽濃度達(dá)到0.415mmol/L時(shí)，對(duì)衣藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。藻株種類的不同也會(huì)造成毒性濃度范圍的差異。在硒酸鹽濃度超過(guò)1mg/L時(shí)，會(huì)對(duì)小球藻產(chǎn)生抑制作用，當(dāng)硒酸鹽濃度達(dá)到12mg/L時(shí)，藻細(xì)胞幾乎停止了生長(zhǎng)，但也有研究顯示小球藻對(duì)硒的最大耐受濃度可達(dá)到100mg/L。目前研究表明，在較低的硒濃度下藻類的富硒量可隨硒濃度的增高而增大，較高濃度的硒，隨硒濃度增加藻類的富硒量反而隨之下降。對(duì)于藻類來(lái)說(shuō)，過(guò)高或過(guò)低的硒濃度都不利于藻對(duì)硒的富集。

萊茵衣藻因其獨(dú)特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能特性使其成為了研究富硒代謝機(jī)制的模式生物。萊茵衣藻與酵母有許多相似之處，被稱為“綠色酵母”，是單細(xì)胞真核生物，細(xì)胞培養(yǎng)容易，生長(zhǎng)速度快，繁殖快，衣藻細(xì)胞直徑約10μm，細(xì)胞質(zhì)中緊貼原生質(zhì)膜有一個(gè)大型杯狀葉綠體，包圍著細(xì)胞核，具有兩根等長(zhǎng)的鞭毛位于細(xì)胞的頂端，并在細(xì)胞側(cè)面生長(zhǎng)有可感光的眼點(diǎn)?？梢哉f(shuō)衣藻細(xì)胞既具有動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)，也具有植物細(xì)胞的特性，因此可作為研究許多細(xì)胞學(xué)問(wèn)題的模式生物。更重要的是衣藻基因組的測(cè)序已經(jīng)完成，衣藻基因由核基因組和葉綠體基因組組成。衣藻核基因組是單倍體，含有17條染色體，富含GC堿基對(duì)，外源基因能以隨機(jī)同源重組的方式插入衣藻核基因組，具有成熟的衣藻核轉(zhuǎn)化體系，方便研究外源基因功能與衣藻富硒代謝機(jī)制。并且得到的富硒衣藻突變體，還可以進(jìn)一步用于清除水體中的硒污染，通過(guò)檢測(cè)衣藻中硒的富集量，判斷水體的硒的污染情況。但是現(xiàn)有技術(shù)中缺乏對(duì)萊茵衣藻富硒突變體的篩選方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種萊茵衣藻富硒突變體的篩選方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中缺乏對(duì)萊茵衣藻富硒突變體篩選方法的技術(shù)問(wèn)題，達(dá)到了提供一種萊茵衣藻富硒突變體的篩選方法的技術(shù)效果。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種萊茵衣藻富硒突變體的篩選方法，所述篩選方法包括：

根據(jù)不同SeO₂濃度對(duì)萊茵衣藻生長(zhǎng)的影響，獲取合適的富硒突變體篩選濃度；

獲得萊茵衣藻突變體，篩選富硒突變體；

鑒定篩選出的富硒突變體的突變基因。

優(yōu)選的，根據(jù)不同SeO₂濃度對(duì)萊茵衣藻生長(zhǎng)的影響，獲取合適的富硒突變體篩選濃度，具體包括：

對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；

對(duì)培養(yǎng)后的萊茵衣藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)；

取已計(jì)數(shù)的萊茵衣藻細(xì)胞預(yù)處理；

將預(yù)處理后的萊茵衣藻細(xì)胞分別滴到含有不同SeO₂濃度的TAP固體平板上，觀察所述萊茵衣藻細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況；

待所述萊茵衣藻細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后，根據(jù)萊茵衣藻細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，獲取合適的富硒突變體篩選濃度。

優(yōu)選的，所述將預(yù)處理后的萊茵衣藻細(xì)胞分別滴到含有不同SeO₂濃度的TAP固體平板上，觀察所述萊茵衣藻細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況中，所述不同SeO₂濃度，具體為：

所述不同SeO₂濃度呈梯狀，所述不同SeO₂濃度包括：0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、5.0mmol/L、10.0mmol/L。

優(yōu)選的，所述待所述萊茵衣藻細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后，根據(jù)萊茵衣藻細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，獲取合適的富硒突變體篩選濃度，具體為：

對(duì)衣藻群體生長(zhǎng)狀況的記錄，選擇篩選富硒異常突變體的最佳SeO₂濃度為5.0mmol/L，作為富硒突變體篩選濃度。

優(yōu)選的所述獲得萊茵衣藻突變體，篩選富硒突變體，包括：

將萊茵衣藻細(xì)胞轉(zhuǎn)化得到可見(jiàn)明顯的單克隆轉(zhuǎn)化子；

將所述單克隆轉(zhuǎn)化子置于新鮮的TAP固體平板上，在光周期下生長(zhǎng)；

將新生長(zhǎng)出來(lái)的固體衣藻置于具有所述富硒突變體篩選濃度硒的TAP固定平板上，在光周期下培養(yǎng)，初次篩選得到富硒異常的突變體，并標(biāo)記；

將標(biāo)記的富硒異常的突變體按編號(hào)在TAP固體平板上保種；

將保種的富硒異常的突變體置于新鮮的TAP固體平板上生長(zhǎng)，生長(zhǎng)3-4天后在狀態(tài)良好期間，將得到的單克隆轉(zhuǎn)化子置于具有所述富硒突變體篩選濃度的SeO₂的TAP平板上，光周期下培養(yǎng)2-3天，記錄萊茵衣藻的生長(zhǎng)狀態(tài)；并將記錄結(jié)果與初次篩選的結(jié)果比對(duì)，若一致則認(rèn)為初次篩選得到的富硒異常的突變體為插入突變?cè)斐傻姆€(wěn)定突變體。

優(yōu)選的，所述將萊茵衣藻細(xì)胞轉(zhuǎn)化得到可見(jiàn)明顯的單克隆轉(zhuǎn)化子，包括：

將含有目的片段AphVⅢⅢ的pJMG載體用EcoRⅠ酶切，膠回收目的片段；

在連續(xù)光照條件下，TAP液體培養(yǎng)基吹氣培養(yǎng)野生型衣藻21gr細(xì)胞，至細(xì)胞濃度為1-2×10⁷個(gè)/ml，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至三角搖瓶中，使得初始濃度為1×10⁶個(gè)/ml，連續(xù)光照培養(yǎng)24h左右；

對(duì)衣藻細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度為N個(gè)/ml，每個(gè)轉(zhuǎn)化需250μl終濃度為2×10⁸個(gè)/ml的衣藻細(xì)胞，則轉(zhuǎn)化所需的衣藻細(xì)胞體積為(M+1)×2×10⁸÷N(ml)，以2500rpm的轉(zhuǎn)速離心3min收集衣藻細(xì)胞；

去上清，用預(yù)冷的含60mM山梨醇的TAP培養(yǎng)基重懸，以2500rpm的轉(zhuǎn)速離心3min；去上清，加入一定體積的含60mM山梨醇的TAP培養(yǎng)基重懸，使細(xì)胞最終體積為：(M+1)×250ul；

取250ul按上述過(guò)程處理的衣藻細(xì)胞和目的DNA片段，加入至同一個(gè)預(yù)冷的電擊杯中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化；將電擊后的衣藻細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10ml含60mM山梨醇的TAP培養(yǎng)基的離心管中，避光過(guò)夜恢復(fù)；

過(guò)夜恢復(fù)的細(xì)胞在以2500rpm的轉(zhuǎn)速離心3min，加少量TAP液體培養(yǎng)基重懸，加入20％預(yù)先處理過(guò)的玉米淀粉吹勻，用含有巴龍酶素的TAP固體培養(yǎng)基涂板；倒置在光周期下培養(yǎng)5-7天，可見(jiàn)明顯的單克隆轉(zhuǎn)化子。

優(yōu)選的，所述將所述單克隆轉(zhuǎn)化子置于新鮮的TAP固體平板上，在光周期下生長(zhǎng)，具體為：

所述將所述單克隆轉(zhuǎn)化子挑出置于新鮮的TAP固體平板上，對(duì)每一個(gè)所述單克隆轉(zhuǎn)化子編號(hào)，在光周期下生長(zhǎng)3-4天。

優(yōu)選的，所述獲得萊茵衣藻突變體，篩選富硒突變體，還包括突變性狀的進(jìn)一步確定，所述突變性狀的進(jìn)一步確定包括：

將野生型萊茵衣藻與得到的萊茵衣藻突變體同時(shí)接種到新鮮TAP固體培養(yǎng)基上，光周期下培養(yǎng)3-4天；

將培養(yǎng)后的野生型萊茵衣藻與得到的萊茵衣藻突變體接種到具有濃度為所述富硒突變體篩選濃度SeO₂的TAP固體平板上；

光周期下倒置培養(yǎng)2天后，移置于暗處繼續(xù)培養(yǎng)；

若野生型萊茵衣藻全部死亡，而得到的萊茵衣藻突變體仍有生長(zhǎng)趨勢(shì)，則得到的富硒異常的突變體為插入突變?cè)斐傻姆€(wěn)定突變體。

優(yōu)選的，所述鑒定篩選出的富硒突變體的突變基因，包括：

提取萊茵衣藻突變體基因組；

RESDA-PCR擴(kuò)增萊茵衣藻富硒突變體突變基因的插入片段及其側(cè)翼序列；

擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后送測(cè)序，并進(jìn)行序列比對(duì)，獲得突變基因的序列信息及插入突變位點(diǎn)。

優(yōu)選的，所述RESDA-PCR擴(kuò)增萊茵衣藻富硒突變體突變基因的插入片段及其側(cè)翼序列；擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后送測(cè)序，并進(jìn)行序列比對(duì)，獲得突變基因的序列信息及插入突變位點(diǎn)，具體包括：

根據(jù)已知的插入片段AphVⅢ的DNA序列，在插入片段的兩端設(shè)計(jì)兩條不重疊的嵌合引物和幾條簡(jiǎn)并引物；

通過(guò)RESDA-PCR兩輪的擴(kuò)增得到含插入片段側(cè)翼序列的擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收后進(jìn)行測(cè)序；

在phytozome網(wǎng)站上與衣藻基因組進(jìn)行序列比對(duì)，獲得突變基因的序列信息及插入突變位點(diǎn)。

本申請(qǐng)有益效果如下：

(1)本發(fā)明提供的一種萊茵衣藻富硒突變體的篩選方法，步驟簡(jiǎn)單、篩選效率高。

(2)所述篩選方法中鑒定出的富硒突變體篩選濃度5.0mmol/L SeO₂，能夠快速、準(zhǔn)確的篩選出能在高硒濃度生長(zhǎng)的衣藻突變體。

(3)所述篩選方法中通過(guò)RESDA-PCR可以鑒定出突變基因及插入突變位點(diǎn)，用于研究衣藻富硒代謝機(jī)制。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例。

圖1為本申請(qǐng)一較佳實(shí)施方式一種萊茵衣藻富硒突變體的篩選方法的流程圖；

圖2為本申請(qǐng)中不同SeO₂濃度對(duì)萊茵衣藻生長(zhǎng)的不同影響示意圖；

圖3為本申請(qǐng)富硒突變體的篩選的示意圖；

圖4為本申請(qǐng)富硒突變體性狀的進(jìn)一步確定的示意圖；

圖5為本申請(qǐng)中衣藻富硒突變體srr1基因組DNA電泳圖；

圖6為本申請(qǐng)RESDA-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果的示意圖；

圖7為本申請(qǐng)srr1突變體發(fā)生突變的基因結(jié)構(gòu)及插入突變位點(diǎn)的示意圖。

具體實(shí)施方式

為了更好的理解上述技術(shù)方案，下面將結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖以及具體的實(shí)施方式對(duì)上述技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。

本申請(qǐng)?zhí)峁┑囊环N萊茵衣藻富硒突變體的篩選方法，請(qǐng)參閱圖1，所述篩選方法包括：

步驟S100，根據(jù)不同SeO₂濃度對(duì)萊茵衣藻生長(zhǎng)的影響，獲取合適的富硒突變體篩選濃度；

所述步驟S100中根據(jù)不同SeO₂濃度對(duì)萊茵衣藻生長(zhǎng)的影響，獲取合適的富硒突變體篩選濃度，具體包括：

步驟S110，對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；

所述步驟S110中所述對(duì)萊茵衣藻細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，具體為：

將適量的衣藻細(xì)胞接種到R液體培養(yǎng)基中，20℃-25℃、光周期為14h光照或10h黑暗下培養(yǎng)3-4天，將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的衣藻細(xì)胞轉(zhuǎn)接到M液體培養(yǎng)基中進(jìn)行同步化培養(yǎng)48-72h。

步驟S120，對(duì)培養(yǎng)后的萊茵衣藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)；

步驟S130，取已計(jì)數(shù)的萊茵衣藻細(xì)胞預(yù)處理；

步驟S130中所述取已計(jì)數(shù)的萊茵衣藻細(xì)胞預(yù)處理，具體為：

取適量體積的已計(jì)數(shù)衣藻細(xì)胞至離心管中，以2500rpm的轉(zhuǎn)速離心3min，去上清，用適量的M培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使衣藻細(xì)胞濃度達(dá)到1×10⁸cells/ml。

步驟S140，將預(yù)處理后的萊茵衣藻細(xì)胞分別滴到含有不同SeO₂濃度的TAP固體平板上，觀察所述萊茵衣藻細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況；

步驟S150，待所述萊茵衣藻細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后，根據(jù)萊茵衣藻細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，獲取合適的富硒突變體篩選濃度。

例一

1)將SeO2的濃度分別設(shè)為0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、5.0mmol/L、10.0mmol/L，以不加SeO₂為對(duì)照。

2)將適量的衣藻細(xì)胞接種到R液體培養(yǎng)基中，20℃-25℃、光周期(14h光照/10h黑暗)下培養(yǎng)3天，將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的衣藻細(xì)胞轉(zhuǎn)接到M液體培養(yǎng)基中進(jìn)行同步化培養(yǎng)48-72h；

3)對(duì)同步化的衣藻細(xì)胞計(jì)數(shù)。

4)取5ml的已計(jì)數(shù)衣藻細(xì)胞至離心管中，以2500rpm的轉(zhuǎn)速離心3min，去上清，用適量的M培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使衣藻細(xì)胞濃度達(dá)到1×10⁸cells/ml。

5)取50μl上述濃度的衣藻細(xì)胞，分別滴到含有不同SeO₂濃度的TAP固體平板上，觀察衣藻的生長(zhǎng)狀況。

待所述萊茵衣藻細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后，根據(jù)萊茵衣藻細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，獲取合適的富硒突變體篩選濃度。

請(qǐng)參閱圖1，在培養(yǎng)的第一天，SeO₂濃度低于5.0mmol/L的各平板上衣藻生長(zhǎng)正常，與不含SeO₂的對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異；SeO₂濃度為5.0mmol/L、10.0mmol/L的平板上衣藻細(xì)胞大部分處于死亡狀態(tài)。培養(yǎng)第四天，SeO₂濃度低于0.2的平板上，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，0.4的平板上有一部分細(xì)胞開(kāi)始死亡，0.8、1.0的平板上，衣藻細(xì)胞大多數(shù)死亡，5.0、10.0平板上的衣藻細(xì)胞幾乎全部死亡。培養(yǎng)第七天，濃度低于0.1平板上的衣藻群體生長(zhǎng)良好，高于0.2的細(xì)胞大多數(shù)死亡。以上結(jié)果表明：SeO₂濃度低于0.1時(shí)，不同硒濃度對(duì)衣藻細(xì)胞群體生長(zhǎng)的影響無(wú)明顯差異，SeO₂濃度高于于0.2時(shí)，不同的硒濃度會(huì)對(duì)衣藻細(xì)胞的群體生長(zhǎng)產(chǎn)生不同的影響。SeO₂濃度為0.2-1.0這個(gè)范圍內(nèi)，衣藻細(xì)胞首先會(huì)生長(zhǎng)一段時(shí)間，隨著濃度的不同，細(xì)胞大部分死亡的時(shí)間也不大相同，在高SeO₂濃度下，衣藻細(xì)胞直接死亡，不會(huì)有生長(zhǎng)后死亡的過(guò)渡時(shí)期。根據(jù)對(duì)衣藻群體生長(zhǎng)狀況的記錄，選擇篩選富硒異常突變體的最佳SeO₂濃度為5.0mmol/L。

步驟S200，獲得萊茵衣藻突變體，篩選富硒突變體；

所述步驟S200中所述獲得萊茵衣藻突變體，篩選富硒突變體，請(qǐng)參閱圖3，包括：

步驟S210，將萊茵衣藻細(xì)胞轉(zhuǎn)化得到可見(jiàn)明顯的單克隆轉(zhuǎn)化子；

所述步驟S210，所述將萊茵衣藻細(xì)胞轉(zhuǎn)化得到可見(jiàn)明顯的單克隆轉(zhuǎn)化子，包括：

將含有目的片段AphVⅢ的pJMG載體用EcoRⅠ酶切，膠回收目的片段；

在連續(xù)光照條件下，TAP液體培養(yǎng)基吹氣培養(yǎng)野生型衣藻21gr細(xì)胞，至細(xì)胞濃度為1-2×10⁷個(gè)/ml，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至三角搖瓶中，使得初始濃度為1×10⁶個(gè)/ml，連續(xù)光照培養(yǎng)24h左右；

對(duì)衣藻細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度為N個(gè)/ml，每個(gè)轉(zhuǎn)化需250μl終濃度為2×10⁸個(gè)/ml的衣藻細(xì)胞，則轉(zhuǎn)化所需的衣藻細(xì)胞體積為(M+1)×2×108÷N(ml)，以2500rpm的轉(zhuǎn)速離心3min收集衣藻細(xì)胞；

去上清，用預(yù)冷的含60mM山梨醇的TAP培養(yǎng)基重懸，以2500rpm的轉(zhuǎn)速離心3min；去上清，加入一定體積的含60mM山梨醇的TAP培養(yǎng)基重懸，使細(xì)胞最終體積為：(M+1)×250ul；

取250ul按上述過(guò)程處理的衣藻細(xì)胞和目的DNA片段(約100ng)，加入至同一個(gè)預(yù)冷的電擊杯中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化；將電擊后的衣藻細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10ml含60mM山梨醇的TAP培養(yǎng)基的離心管中，避光過(guò)夜恢復(fù)；

過(guò)夜恢復(fù)的細(xì)胞在以2500rpm的轉(zhuǎn)速離心3min，加少量TAP液體培養(yǎng)基重懸，加入20％預(yù)先處理過(guò)的玉米淀粉吹勻，用含有巴龍酶素的TAP固體培養(yǎng)基涂板；倒置在光周期下培養(yǎng)5-7天，可見(jiàn)明顯的單克隆轉(zhuǎn)化子。

步驟S220，將所述單克隆轉(zhuǎn)化子置于新鮮的TAP固體平板上，在光周期下生長(zhǎng)；

所述步驟S220中所述將所述單克隆轉(zhuǎn)化子置于新鮮的TAP固體平板上，在光周期下生長(zhǎng)，具體為：

所述將所述單克隆轉(zhuǎn)化子挑出置于新鮮的TAP固體平板上，對(duì)每一個(gè)所述單克隆轉(zhuǎn)化子編號(hào)，在光周期下生長(zhǎng)3-4天。

步驟S230，將新生長(zhǎng)出來(lái)的固體衣藻置于具有所述富硒突變體篩選濃度硒的TAP固定平板上，在光周期下培養(yǎng)，初次篩選得到富硒異常的突變體，并標(biāo)記；

步驟S240，將標(biāo)記的富硒異常的突變體按編號(hào)在TAP固體平板上保種；

步驟S250，將保種的富硒異常的突變體置于新鮮的TAP固體平板上生長(zhǎng)，生長(zhǎng)3-4天后在狀態(tài)良好期間，將得到的單克隆轉(zhuǎn)化子置于具有所述富硒突變體篩選濃度的SeO₂的TAP平板上，光周期下培養(yǎng)2-3天，記錄萊茵衣藻的生長(zhǎng)狀態(tài)；并將記錄結(jié)果與初次篩選的結(jié)果比對(duì)，若一致則認(rèn)為初次篩選得到的富硒異常的突變體為插入突變?cè)斐傻姆€(wěn)定突變體。

所述獲得萊茵衣藻突變體，篩選富硒突變體，還包括突變性狀的進(jìn)一步確定，所述突變性狀的進(jìn)一步確定包括：

將野生型萊茵衣藻與得到的萊茵衣藻突變體同時(shí)接種到新鮮TAP固體培養(yǎng)基上，光周期下培養(yǎng)3-4天；請(qǐng)參閱圖4，左邊是野生型21gr，右邊是篩選得到的突變體，在培養(yǎng)第一天，野生型細(xì)胞幾乎全部死亡，而突變體仍有生長(zhǎng)趨勢(shì)。

將培養(yǎng)后的野生型萊茵衣藻與得到的萊茵衣藻突變體接種到具有濃度為所述富硒突變體篩選濃度SeO₂的TAP固體平板上；

光周期下倒置培養(yǎng)2天后，移置于暗處繼續(xù)培養(yǎng)；

若野生型萊茵衣藻全部死亡，而得到的萊茵衣藻突變體仍有生長(zhǎng)趨勢(shì)，則得到的富硒異常的突變體為插入突變?cè)斐傻姆€(wěn)定突變體。

步驟S300，鑒定篩選出的富硒突變體的突變基因。

所述步驟S300中所述鑒定篩選出的富硒突變體的突變基因，包括：

提取萊茵衣藻突變體基因組；

RESDA-PCR擴(kuò)增萊茵衣藻富硒突變體突變基因的插入片段及其側(cè)翼序列；

擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后送測(cè)序，并進(jìn)行序列比對(duì)，獲得突變基因的序列信息及插入突變位點(diǎn)。

所述提取萊茵衣藻突變體基因組，具體包括：

(1)在光周期條件下，用R或TAP液體培養(yǎng)基吹氣培養(yǎng)突變體藻株，細(xì)胞達(dá)到5×10⁶個(gè)時(shí)，收集衣藻細(xì)胞；用少量液體培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×10⁷個(gè)/ml，取1ml細(xì)胞至離心管中，14000rpm離心1min，去上清，將收集好的細(xì)胞置于液氮中。

(2)向收集好的細(xì)胞中加入600μl CTAB裂解液，用槍吹打均勻；在65℃水浴1-2h，每隔10-15min上下晃動(dòng)離心管，使衣藻細(xì)胞充分裂解；

(3)再加入650μl體積比為25:24:1的苯酚：氯仿：異戊醇，將離心管上下晃動(dòng)混勻5min，14000rpm離心10min，吸取上清液至新的離心管；

(4)向離心管中加入等體積的氯仿：異戊醇(24:1)，將離心管上下晃動(dòng)混勻5min，以14000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，吸取上清液至新的離心管；

(5)向上述離心管中加入0.7倍體積的異丙醇，上下晃動(dòng)離心管將溶液混勻，-20℃放置10-20min，觀察到有白色絮狀的基因組DNA析出；以14000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min，去上清留沉淀；

(6)加入1ml70％乙醇，洗滌白色沉淀，去除雜質(zhì)，重復(fù)洗滌3-4次，每次以14000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min；在最后一次洗滌時(shí)，將殘留的乙醇溶液吸干；

(7)將EP管置于60℃干燥箱中干燥幾分鐘，加入50ul的TB溶液或ddH2O，并加入濃度為10mg/ml的1ul的RNase，37℃恒溫箱中消化過(guò)夜。

所述RESDA-PCR擴(kuò)增萊茵衣藻富硒突變體突變基因的插入片段及其側(cè)翼序列；擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后送測(cè)序，并進(jìn)行序列比對(duì)，獲得突變基因的序列信息及插入突變位點(diǎn)，具體為根據(jù)已知的插入片段AphVⅢ的DNA序列，在插入片段的兩端設(shè)計(jì)兩條不重疊的嵌合引物和幾條簡(jiǎn)并引物；通過(guò)RESDA-PCR兩輪的擴(kuò)增得到含插入片段側(cè)翼序列的擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收后進(jìn)行測(cè)序；在phytozome網(wǎng)站上與衣藻基因組進(jìn)行序列比對(duì)，獲得突變基因的序列信息及插入突變位點(diǎn)。

具體包括：

(1)引物設(shè)計(jì)：由于采用隨機(jī)插入已知片段的方法獲得突變體，含有抗性基因的插入片段AphVⅢ的DNA序列已知，因此在插入片段的兩端設(shè)計(jì)兩條不重疊的嵌合引物(F2、F8)和幾條簡(jiǎn)并引物(DegAluⅠQ0、DegPstⅠQ0、DegSacⅡQ0、DegTaqⅠQ0、Q0)。

(2)采用兩輪RESDA-PCR來(lái)獲得衣藻突變體的突變基因。本申請(qǐng)中采用的RESDA-PCR與普通的PCR不同的是，RESDA-PCR分為兩輪。

第一輪PCR反應(yīng)體系的條件見(jiàn)表1。

表1第一輪PCR反應(yīng)體系

第一輪PCR完成后，將PCR產(chǎn)物稀釋25倍，用作下一輪PCR的模板。

第二輪PCR反應(yīng)體系的條件見(jiàn)表2。

表2第二輪PCR反應(yīng)體系

RESDA-PCR完成后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果如圖6所示。將大于插入片段(250bp)的DNA條帶全部切下，送樣測(cè)序。

(3)測(cè)序結(jié)果通過(guò)在衣藻網(wǎng)站(phytozome)上進(jìn)行序列比對(duì)，可以獲得突變基因的序列信息及插入突變位點(diǎn)。通過(guò)本發(fā)明篩選體系所得到的其中一個(gè)富硒突變體(命名為srr1)，通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該突變體是由于AphVⅢ插入到第14號(hào)染色體的Cre14.g619000基因上造成的突變。圖7為的突變基因SRR1的結(jié)構(gòu)及具體插入位點(diǎn)。

本申請(qǐng)有益效果如下：

(1)本發(fā)明提供的一種萊茵衣藻富硒突變體的篩選方法，步驟簡(jiǎn)單、篩選效率高。

(2)所述篩選方法中鑒定出的富硒突變體篩選濃度5.0mmol/L SeO₂，能夠快速、準(zhǔn)確的篩選出能在高硒濃度生長(zhǎng)的衣藻突變體。

(3)所述篩選方法中通過(guò)RESDA-PCR可以鑒定出突變基因及插入突變位點(diǎn)，用于研究衣藻富硒代謝機(jī)制。

最后所應(yīng)說(shuō)明的是，以上具體實(shí)施方式僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。