本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及轉(zhuǎn)基因玉米MON88017構(gòu)建特異定量PCR精準檢測的引物組和探針及其方法。

背景技術(shù)：

目前關(guān)于轉(zhuǎn)基因玉米MON88017的檢測技術(shù)，集中在普通定性PCR分析方法，尚無關(guān)于擴增檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON88017及產(chǎn)品的構(gòu)建特異性某特定位點(基因序列)的高靈敏度定量PCR精準檢測技術(shù)。因此提供一種擴增效率高、準確度高的定量PCR精準檢測技術(shù)用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON88017及其產(chǎn)品，成為了本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因玉米MON88017構(gòu)建特異定量PCR精準檢測的引物組和探針，能特異性地檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON88017。

本發(fā)明還提供了利用上述引物組和探針檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON88017的方法。該方法擴增效率高，準確度高，靈敏度良好，有效解決了現(xiàn)有技術(shù)中無轉(zhuǎn)基因玉米MON88017高靈敏度定量PCR精準檢測技術(shù)的問題。

本發(fā)明帶提供了了該方法在轉(zhuǎn)基因玉米MON88017及其產(chǎn)品檢測的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

轉(zhuǎn)基因玉米MON88017構(gòu)建特異定量PCR精準檢測的引物組和探針，該引物組包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物的序列分別如下：

上游引物序列：Construct MON88017-Forward：

5'-GGGCTTAGATGAGAAACTTCACGAT-3'；

下游引物序列：Construct MON88017-Reverse：

5'-CCGACTCTCTTCTCAAGCATATGA-3'；

該探針為熒光探針，熒光探針的序列為：Construct MON88017-Probe：

5'-FAM-CGCGCCAAAGCTTACTCGAGGTCA-TAMARA-3'。

本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因玉米MON88017構(gòu)建特異定量PCR精準檢測的方法，包括以下步驟：

步驟1：合成上游引物、下游引物及探針；

步驟2：制備MON88017玉米品種的DNA稀釋液；

步驟3：配制PCR反應(yīng)體系；

步驟4：進行PCR擴增反應(yīng)，定量PCR檢測。

優(yōu)選地，步驟1合成的上游引物、下游引物及探針的濃度均為10μmol/l；

優(yōu)選地，步驟2中DNA稀釋液的濃度為50ng/μl。

優(yōu)選地，步驟3中，配制PCR反應(yīng)體系即將3μl的DNA稀釋液加入到反應(yīng)體系中，反應(yīng)體系包括以下組分：

優(yōu)選地，步驟4中，PCR擴增反應(yīng)和定量PCR檢測的條件為：95℃預(yù)變性10min，1個循環(huán)；95℃變性15s，60℃退火60s，40個循環(huán)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明檢測方式科學(xué)合理，操作簡便。

本發(fā)明的引物組和探針在本發(fā)明設(shè)定的檢測方法下能夠定量地檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON88017及其產(chǎn)品，本發(fā)明的檢測方法各指標均滿足國際認可的精準基因定量檢驗方法的范圍，本發(fā)明的引物組和探針特異性好，檢測方法擴增效率高，準確度高，靈敏度良好。解決了現(xiàn)有技術(shù)中無轉(zhuǎn)基因玉米MON88017高靈敏度定量PCR精準檢測技術(shù)的問題，彌補和完善我國轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品定量檢測技術(shù)體系；更好地保護消費者對轉(zhuǎn)基因玉米MON88017及其產(chǎn)品的知情權(quán)和選擇權(quán)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的特異性檢測圖譜。

圖2為本發(fā)明的靈敏度擴增圖。

圖3為本發(fā)明在99％置信水平下靈敏度實驗擴增圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖說明和實施例對本發(fā)明作進一步說明，本發(fā)明的方式包括但不僅限于以下實施例。

實施例1

本實施例中定量檢測采用的是ABI公司生產(chǎn)的7500型熒光定量PCR儀器。

轉(zhuǎn)基因玉米MON88017構(gòu)建特異定量PCR精準檢測方法，包括以下步驟：

步驟1：合成上游引物、下游引物及與引物配合使用的熒光探針，

上游引物序列：Construct MON88017-Forward：

5'-GGGCTTAGATGAGAAACTTCACGAT-3'；

下游引物序列：Construct MON88017-Reverse：

5'-CCGACTCTCTTCTCAAGCATATGA-3'；

熒光探針序列：Construct MON88017-Probe：

5'-FAM-CGCGCCAAAGCTTACTCGAGGTCA-TAMARA-3'。

其中，上游引物、下游引物及熒光探針的合成濃度均為10μmol/l。

以上的上游引物、下游引物和熒光探針的核苷酸序列是針對轉(zhuǎn)基因玉米MON88017及產(chǎn)品的構(gòu)建特異性某特定位點，即MON88017轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體的啟動子ract與質(zhì)粒位點設(shè)計；通過該設(shè)計就可以精準檢測轉(zhuǎn)基因玉米中MON88017的構(gòu)建特異DNA分子片段。

步驟2：制備MON88017品種的DNA稀釋液：采用常規(guī)的DNA提取手段，從轉(zhuǎn)基因玉米MON88017中提取出濃度為50ng/μl的DNA稀釋液。

步驟3：配制PCR反應(yīng)體系：即將3μl制備好的DNA稀釋液加入反應(yīng)體系中即可。

以上反應(yīng)體系包括以下組分：

步驟4：PCR擴增反應(yīng)和定量PCR檢測：

根據(jù)步驟3的PCR反應(yīng)體系，在以下PCR反應(yīng)條件下對產(chǎn)物進行擴增并檢測：95℃預(yù)變性10min，1個循環(huán)；95℃變性15s，60℃退火60s，40個循環(huán)。

實施例2

擴增效率實驗

對本實施例的方法數(shù)據(jù)連續(xù)重復(fù)做29個平行樣品，對該29個樣品進行了檢測，其檢測數(shù)據(jù)如表1。

表1

采用本發(fā)明能夠精準檢測轉(zhuǎn)基因玉米中MON88017構(gòu)建特異DNA片段及其含量，獲得標準曲線斜率，在-3.6～-3.1之間，相關(guān)系數(shù)大于0.99，擴增效率為102.102％，在90％～110％的范圍內(nèi)。待檢樣品的定量檢測結(jié)果(1.6％)非常接近真實值(1.5％)，檢測結(jié)果的相對偏差(6.7％)小于國際認可的25％，檢測結(jié)果的不確定度小于10％。

以上結(jié)果表明，本發(fā)明具有良好的擴增效率。

實施例3

特異性檢測

構(gòu)建特異性所用材料：

轉(zhuǎn)基因玉米：T25，MON810，Bt11，Bt176，GA21，TC1507，59122，MON89788，NK603，MON863，BvLa；

轉(zhuǎn)基因水稻：KF6，KMD，TT51-1，TA2-1；

轉(zhuǎn)基因煙草：TMV；

轉(zhuǎn)基因甜菜：H7-1；

轉(zhuǎn)基因大豆：GTS40-3-2；

轉(zhuǎn)基因棉花：MON15985，LLC25，MON1531，MON88913，GHB614，MON1445；

轉(zhuǎn)基因油菜：GT73，T45，MS8，RF1，RF2，RF3.MS1，MS8

采用本發(fā)明的引物組和探針對上述試樣的DNA進行分析。

結(jié)果如圖1所示，采用本發(fā)明引物組和探針檢測轉(zhuǎn)基因玉米非MON88017品種、轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因油菜以及非轉(zhuǎn)基因玉米、水稻、油菜、大豆(圖中水平曲線)和轉(zhuǎn)基因玉米MON88017品系試驗材料，只有轉(zhuǎn)基因玉米MON88017品種材料被檢出(圖1中斜向上的曲線)。

結(jié)果表明，只有轉(zhuǎn)基因玉米MON88017樣品中能收集到檢測的熒光信號，而空白對照和其他樣品中均未能收集到熒光信號。表明本發(fā)明引物組及探針特異性非常高。

實施例4

靈敏度試驗

99％置信水平下MON88017玉米構(gòu)建特異檢測方法靈敏度(檢測下限5copies)實驗數(shù)據(jù)如表2。

表2

如圖3所示，99％置信水平下靈敏度實驗擴增圖：利用本發(fā)明96次重復(fù)檢測反應(yīng)體系中含有的5copies的MON88017構(gòu)建特異DNA片段，共95次試驗檢測出MON88017構(gòu)建特異DNA片段，其中僅1次未能檢測到5copies的MON88017構(gòu)建DNA片段(第59次，見表2)。

值得說明的是附圖中△Rn代表熒光原始信號減去背景信號的值。

以上結(jié)果表明，本發(fā)明的靈敏度良好。

綜上所述，本發(fā)明的各指標均滿足國際認可的精準基因定量檢驗方法的范圍，本發(fā)明的擴增效率高、準確度高，靈敏度良好。

上述實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式之一，不應(yīng)當用于限制本發(fā)明的保護范圍，但凡在本發(fā)明的主體設(shè)計思想和精神上作出的毫無實質(zhì)意義的改動或潤色，其所解決的技術(shù)問題仍然與本發(fā)明一致的，均應(yīng)當包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心

<120> 轉(zhuǎn)基因玉米MON88017構(gòu)建特異定量PCR精準檢測的引物組和探針及其方法

<130> 20161117

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gggcttagat gagaaacttc acgat 25

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgactctct tctcaagcat atga 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcgccaaag cttactcgag gtca 24