本發(fā)明涉及微生物保存技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種凍干保護(hù)劑及其制備方法，使用方法。

背景技術(shù)：

乳酸菌是食品工業(yè)中一種重要的微生物，廣泛應(yīng)用于乳制品及肉制品發(fā)酵。為便于生產(chǎn)，高活力菌種常用冷凍干燥方法保存，其中凍干技術(shù)及相關(guān)冷凍保護(hù)劑開發(fā)非常關(guān)鍵。

但因目前國內(nèi)真空冷凍干燥微生物的技術(shù)還不夠完善，凍干產(chǎn)品的活菌數(shù)還不夠高，冷凍干燥技術(shù)還處于發(fā)展階段。乳酸菌若直接進(jìn)行冷凍干燥，死亡率將達(dá)90％以上，因此選擇合適的凍干保護(hù)劑至關(guān)重要。

凍干保護(hù)劑的保護(hù)作用與它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系,其特征是具備三個以上的氫鍵或一些離子基團(tuán),它們能夠取代水與細(xì)菌蛋白質(zhì)結(jié)合,保證了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,防止凍干時(shí)胞內(nèi)胞外冰晶的形成。保護(hù)劑的持水性可使凍干過程中細(xì)胞的水分不至于急劇下降,而使細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)免遭破壞,保護(hù)劑能將菌體包裹其中,減少菌體與氧接觸,降低細(xì)胞代謝,選擇保護(hù)劑的技術(shù)是制備冷凍干燥濃縮發(fā)酵劑的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。

但由于不同種乳酸菌細(xì)胞的特異性、不同種保護(hù)劑的理化性質(zhì)的特異性及二者相互作用的復(fù)雜性，單一保護(hù)劑單獨(dú)使用并不能滿足菌體抵抗外界惡劣條件的要求，而復(fù)配保護(hù)劑雖然保護(hù)效果較明顯但是篩選工作量極大，且同種復(fù)配型保護(hù)劑針對不同種乳酸菌保護(hù)效果也會不同，這又從另一方面增加了尋找冷凍保護(hù)劑的復(fù)雜程度，傳統(tǒng)的尋找外源性冷凍保護(hù)劑工作量大，方法繁瑣，且成本花費(fèi)高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決上述問題所采用的技術(shù)方案是一種凍干保護(hù)劑及其制備方法，使用方法。

本發(fā)明提供的一種冷凍保護(hù)劑的制備方法，包括以下步驟：

將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌體進(jìn)行階梯降溫處理；

將菌體進(jìn)行洗滌離心處理,收集菌體；

將菌體破碎；

離心收集上清液，并進(jìn)行凍干處理，獲得冷凍保護(hù)劑。

優(yōu)選的，所述的梯度降溫處理包括在31℃-0、0--45℃、-45--80℃，每個溫度梯度下冷凍處理0.5-5h。

優(yōu)選的，所述將菌體進(jìn)行洗滌離心處理,收集菌體包括:

將菌體在轉(zhuǎn)速為5000rpm，離心時(shí)間為10-20min，溫度為0-6℃下進(jìn)行離心；

用緩沖液洗滌，緩沖液為摩爾濃度0.05M的pH為6.63的Tris-HCl溶液，其中,菌體的質(zhì)量和緩沖液的體積配比為1g：(30-50)ml。

優(yōu)選的，所述將菌體破碎包括:

采用超聲破碎,破碎條件為:功率為300-350w，超聲5s，停止5s，共超聲30min-60min。

優(yōu)選的，所述離心收集上清液，并進(jìn)行凍干處理，獲得冷凍保護(hù)劑包括:

離心條件為6000-20000rpm，時(shí)間為10-20min，溫度為4℃。

優(yōu)選的，所述菌體為嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌、乳酸片球菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、雙歧桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種中的任一一種。

本發(fā)明的目的還在于提供一種凍干保護(hù)劑，是采用上述冷凍保護(hù)劑的制備方法制備的。

本發(fā)明的目的還在于提供一種凍干保護(hù)劑的使用方法，包括以下步驟：

用緩沖液將凍干保護(hù)劑稀釋，至蛋白濃度為5-10μg/μl，獲得凍干保護(hù)劑溶液；

將凍干保護(hù)劑溶液與菌體發(fā)酵液進(jìn)行混合凍干，其中，凍干保護(hù)劑溶液與菌體發(fā)酵液的體積比為1:(4-10)。

優(yōu)選的，所述的菌體發(fā)酵液為對數(shù)期的菌體發(fā)酵液。

本發(fā)明提供一種經(jīng)預(yù)凍處理乳酸菌的細(xì)胞破碎物作為其自身和其它乳酸菌菌種冷凍保護(hù)劑的方法。雖然冷刺激對乳酸菌造成了損傷,但低溫預(yù)處理卻可以使乳酸菌細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列脅迫應(yīng)答反應(yīng)，尤其是參與到胞內(nèi)各種代謝途徑的各種蛋白酶類，如糖酵解及丙酮酸代謝途徑、糖類代謝途徑、肽聚糖及嘌呤合成代謝途徑、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后修飾水平及脅迫相關(guān)蛋白酶類，能夠部分甚至完全恢復(fù)細(xì)胞的正常生理結(jié)構(gòu)功能，從而使細(xì)胞獲得抗凍特性。由低溫預(yù)處理下這些代謝途徑產(chǎn)生的一些直接或間接參與恢復(fù)細(xì)胞的正常生理結(jié)構(gòu)功能的一些物質(zhì)，如糖和糖醇類、氨基酸類、肽和蛋白質(zhì)類，同時(shí)可以直接用作冷凍保護(hù)劑，或被細(xì)胞吸收用以維持細(xì)胞正常滲透壓，或在細(xì)胞外形成保護(hù)層，是一種很好的復(fù)配型保護(hù)劑，能夠有效的增加凍干后的存活率。這類保護(hù)劑直接來源于經(jīng)低溫冷凍預(yù)處理后的相應(yīng)乳酸菌細(xì)胞，經(jīng)超聲破碎處理直接獲得；原料易得，制備工藝簡單，成本花費(fèi)低，冷凍保護(hù)效果好，具有較強(qiáng)的工業(yè)化實(shí)施性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的實(shí)施例1-22中制備凍干保護(hù)劑的工藝流程圖。

具體實(shí)施方式

為使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

本發(fā)明提供了該類冷凍保護(hù)劑的制備及使用方法，包括如下步驟：

(a)對培養(yǎng)至對數(shù)期的乳酸菌進(jìn)行冷凍預(yù)處理；其中所述的乳酸菌包括選自下組的至少一種：乳酸乳球菌、乳酸片球菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、雙歧桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種；培養(yǎng)條件為：溫度31-37℃，時(shí)間12-36h。應(yīng)當(dāng)理解的是,上述菌種的培養(yǎng)方式可以采用現(xiàn)有的培養(yǎng)技術(shù),目的是需要將菌種培養(yǎng)至對數(shù)期。

乳酸菌冷凍預(yù)處理的條件為：梯度降溫處理為0-31℃、0--45℃、-45--80℃，每個溫度梯度下冷凍處理0.5-5h。

(b)離心收集冷凍預(yù)處理后的乳酸菌菌體，并加入一定配比的緩沖液進(jìn)行反復(fù)洗滌；收集菌體離心條件為5000rpm，時(shí)間為10-20min，溫度為4℃；洗滌所用緩沖液為摩爾濃度0.05M的pH為6.63的Tris-HCl溶液，配比為1g菌體：(30-50)ml緩沖液，洗滌3次。

(c)對洗滌后的乳酸菌細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎；細(xì)胞超聲破碎條件為：功率300-350w，超聲5s，停止5s，共超聲30min-60min直至懸液澄清。

(d)離心收集超聲破碎后的上清液，進(jìn)行真空冷凍干燥；離心條件為6000-20000rpm，時(shí)間為10-20min，溫度為4℃。

(e)凍干結(jié)束后收集產(chǎn)品，即為用于冷凍干燥該種乳酸菌自身的凍干保護(hù)劑，然后進(jìn)行4℃保存。

(f)取(e)中產(chǎn)品，用(b)中Tris-HCl溶液稀釋，使其稀釋后測定的蛋白濃度指標(biāo)為5-10μg/μl，取5ml稀釋后的產(chǎn)品溶液，添加到20ml的預(yù)先已培養(yǎng)至對數(shù)期的乳酸菌發(fā)酵液中(保護(hù)劑與乳酸菌發(fā)酵液的體積配比范圍為1:(4-10)，在此范圍內(nèi)均具有保護(hù)效果)，乳酸乳球菌、乳酸片球菌、植物乳桿菌培養(yǎng)基的配方均采用MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度31℃，初始pH7.4；

干酪乳桿菌、雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件參考文獻(xiàn)；然后放入冷凍干燥機(jī)中凍干，用于測定產(chǎn)品的凍干保護(hù)效果。

同時(shí)設(shè)置兩個對照組：

對照組1取5ml無菌水，添加到20ml發(fā)酵液中，作為不添加保護(hù)劑組；

對照組2取正常組細(xì)胞，不作任何處理(不經(jīng)梯度降溫冷凍處理)，按照上述步驟提取其胞內(nèi)物質(zhì)，驗(yàn)證其胞內(nèi)物質(zhì)有無凍干保護(hù)作用。

(g)添加保護(hù)劑組樣品和不添加保護(hù)劑組樣品(實(shí)驗(yàn)組和2個對照組)凍干后同時(shí)取出，在37℃水浴鍋中進(jìn)行溫浴解凍，各取0.5ml樣液，加入4.5ml生理鹽水，依次進(jìn)行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-8、10^-9，取合適的稀釋梯度進(jìn)行涂平板，每個梯度三次重復(fù)，計(jì)活菌數(shù)，與對照組比較，考察保護(hù)劑的保護(hù)效果。

下面通過培養(yǎng)不同的乳酸菌種，制備相應(yīng)的冷凍保護(hù)劑，然后將該冷凍保護(hù)劑應(yīng)用于自身作為冷凍保護(hù)劑或用于其它種類的乳酸菌作為冷凍保護(hù)劑。

實(shí)施例1-實(shí)施例7為提取冷凍預(yù)處理后的乳酸乳球菌的胞內(nèi)物質(zhì)作為保護(hù)劑保護(hù)其自身及其它5種乳酸菌凍干過程的實(shí)驗(yàn)例。

實(shí)施例1

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備乳酸乳球菌胞內(nèi)物質(zhì)作為保護(hù)劑。具體地，乳酸乳球菌31℃培養(yǎng)16h后，進(jìn)行冷凍預(yù)處理，梯度降溫條件為8℃、-16℃、-67℃、依次各處理5h；5000rpm、離心20min,4℃,收集菌體，菌體用技術(shù)方案步驟(b)中Tris-HCl緩沖液洗滌三次，菌體、緩沖液質(zhì)量體積配比為1:50；然后進(jìn)行超聲破碎，功率300w，超聲5s，停止5s，共超聲60min；離心收集超聲破碎后的上清液，離心條件為6000rpm，時(shí)間為20min，溫度為4℃；對上清液進(jìn)行真空冷凍干燥，冷阱溫度-70℃，真空度1Pa，得到冷凍保護(hù)劑；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對乳酸乳球菌凍干過程的保護(hù)作用，驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1乳酸乳球菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對其自身凍干后的微生物量的影響

如表1所示，以6000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液，最終得到的凍干產(chǎn)品作為保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組的乳酸乳球菌存活率提高了1.3倍，而從對照組2可以看出不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對其自身不具有凍干保護(hù)作用。

實(shí)施例2：

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備乳酸乳球菌胞內(nèi)物質(zhì)作為保護(hù)劑。具體地，乳酸乳球菌31℃培養(yǎng)16h后，進(jìn)行冷凍預(yù)處理，梯度降溫條件為31℃、0℃、-45℃、依次各處理2h；5000rpm、離心10min,6℃,收集菌體，菌體用技術(shù)方案步驟(b)中Tris-HCl緩沖液洗滌三次，菌體、緩沖液質(zhì)量體積配比為1:30；然后進(jìn)行超聲破碎，功率350w，超聲5s，停止5s，共超聲30min；離心收集超聲破碎后的上清液，離心條件為16000rpm，時(shí)間為10min，溫度為4℃；對上清液進(jìn)行真空冷凍干燥，冷阱溫度-70℃，真空度1Pa，得到冷凍保護(hù)劑；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對乳酸乳球菌凍干過程的保護(hù)作用，驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2乳酸乳球菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對其自身凍干后的微生物量的影響

如表2所示，以16000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液，最終得到的凍干產(chǎn)品作為保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組的對照1的乳酸乳球菌存活率提高了3.9倍，同樣對照組2說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對其自身不具有凍干保護(hù)作用。

實(shí)施例3：

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備乳酸乳球菌胞內(nèi)物質(zhì)作為乳酸片球菌的冷凍干燥保護(hù)劑。具體地，乳酸乳球菌31℃培養(yǎng)16h后，進(jìn)行冷凍預(yù)處理，梯度降溫條件為0℃、-45、-80℃、依次各處理0.5h；5000rpm、離心10min,0℃,收集菌體，菌體用技術(shù)方案步驟(b)中Tris-HCl緩沖液洗滌三次，菌體、緩沖液質(zhì)量體積配比為1:30；然后進(jìn)行超聲破碎，功率350w，超聲5s，停止5s，共超聲30min；離心收集超聲破碎后的上清液，離心條件為16000rpm，時(shí)間為15min，溫度為4℃；對上清液進(jìn)行真空冷凍干燥，冷阱溫度-70℃，真空度1Pa，得到冷凍保護(hù)劑；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對乳酸乳球菌凍干過程的保護(hù)作用，驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對乳酸片球菌凍干過程的保護(hù)作用，步驟(f)中乳酸片球菌的的培養(yǎng)條件為31℃、培養(yǎng)24h。其它驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3乳酸乳球菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對乳酸片球菌凍干后的微生物量的影響

如表3所示，以16000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的乳酸乳球菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為乳酸片球菌的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的乳酸片球菌存活率提高了23.7倍，而對照組2均說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對乳酸片球菌凍干保護(hù)作用微弱。

實(shí)施例4：

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備乳酸乳球菌胞內(nèi)物質(zhì)作為植物乳桿菌的冷凍干燥保護(hù)劑。具體地，制備乳酸乳球菌胞內(nèi)成分的保護(hù)劑產(chǎn)品步驟同實(shí)施例2步驟相同；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對植物乳桿菌凍干過程的保護(hù)作用，步驟(f)中植物乳桿菌的培養(yǎng)條件為31℃、培養(yǎng)36h。其它驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4乳酸乳球菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對植物乳桿菌凍干后的微生物量的影響

如表3所示，以16000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的乳酸乳球菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為植物乳桿菌的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的植物乳桿菌存活率提高了6.7倍，而對照組2均說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對植物乳桿菌凍干保護(hù)作用微弱。

實(shí)施例5：

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備乳酸乳球菌胞內(nèi)物質(zhì)作為干酪乳桿菌的冷凍干燥保護(hù)劑。具體地，制備乳酸乳球菌胞內(nèi)成分的保護(hù)劑產(chǎn)品步驟同實(shí)施例2步驟相同；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對干酪乳桿菌凍干過程的保護(hù)作用，步驟(f)中干酪乳桿菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件參照金樁《干酪乳桿菌LC-03的培養(yǎng)條件優(yōu)化研究》。其它驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5乳酸乳球菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對干酪乳桿菌凍干后的微生物量的影響

如表5所示，以16000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的乳酸乳球菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為干酪乳桿菌的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的干酪乳桿菌存活率提高了2.5倍，而對照組2均說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對干酪乳桿菌不具有凍干保護(hù)作用。

實(shí)施例6：

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備乳酸乳球菌胞內(nèi)物質(zhì)作為雙歧桿菌的冷凍干燥保護(hù)劑。具體地，制備乳酸乳球菌胞內(nèi)成分的保護(hù)劑產(chǎn)品步驟同實(shí)施例2步驟相同；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對雙歧桿菌凍干過程的保護(hù)作用，步驟(f)中雙歧桿菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件參照熊三玉《兩歧雙歧桿菌馴化及培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究》。其它驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

表6乳酸乳球菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對雙歧桿菌凍干后的微生物量的影響

如表6所示，以16000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的乳酸乳球菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為雙歧桿菌的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的雙歧乳桿菌存活率提高了18.2倍，而對照組2均說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對雙歧桿菌凍干保護(hù)作用微弱。

實(shí)施例7：

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備乳酸乳球菌胞內(nèi)物質(zhì)作為保加利亞乳桿菌的冷凍干燥保護(hù)劑。具體地，制備乳酸乳球菌胞內(nèi)成分的保護(hù)劑產(chǎn)品步驟同實(shí)施例2步驟相同；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對保加利亞乳桿菌凍干過程的保護(hù)作用，步驟(f)中保加利亞乳桿菌菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件參照隋曉峰《保加利亞乳桿菌的高密度培養(yǎng)及大豆發(fā)酵飲料的研制》。其它驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示。

表7乳酸乳球菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對保加利亞乳桿菌凍干后的微生物量的影響

如表7所示，以16000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的乳酸乳球菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為保加利亞乳桿菌的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的保加利亞乳桿菌存活率提高了9.9倍，而對照組2說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對保加利亞乳桿菌凍干保護(hù)作用微弱。

實(shí)施例8-實(shí)施例13為提取冷凍預(yù)處理后的乳酸片球菌的胞內(nèi)物質(zhì)作為保護(hù)劑保護(hù)其自身及其它5種乳酸菌凍干過程的實(shí)驗(yàn)例。

實(shí)施例8

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備乳酸片球菌胞內(nèi)物質(zhì)作為保護(hù)劑。具體地，乳酸片球菌31℃培養(yǎng)24h后，進(jìn)行冷凍預(yù)處理，梯度降溫條件為4℃、-20℃、-80℃、依次各處理2h；5000rpm、離心10min,0℃,收集菌體，菌體用技術(shù)方案步驟(b)中Tris-HCl緩沖液洗滌三次，菌體、緩沖液質(zhì)量體積配比為1:30；然后進(jìn)行超聲破碎，功率300w，超聲5s，停止5s，共超聲30min；離心收集超聲破碎后的上清液，離心條件為20000rpm，時(shí)間為10min，溫度為4℃；對上清液進(jìn)行真空冷凍干燥，冷阱溫度-70℃，真空度1Pa，得到冷凍保護(hù)劑；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對乳酸片球菌凍干過程的保護(hù)作用，驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8所示。

表8乳酸片球菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對其自身凍干后的微生物量的影響

如表7所示，以20000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的乳酸片球菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為其自身的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的乳酸片球菌存活率提高了1.9倍，而對照組2說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對乳酸片球菌凍干保護(hù)作用微弱。

實(shí)施例9：

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備乳酸片球菌胞內(nèi)物質(zhì)作為乳酸乳球菌的冷凍干燥保護(hù)劑。具體地，制備乳酸片球菌胞內(nèi)成分的保護(hù)劑產(chǎn)品步驟同實(shí)施例8步驟相同；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對乳酸乳球菌凍干過程的保護(hù)作用，步驟(f)中乳酸乳球菌的的培養(yǎng)條件為31℃、培養(yǎng)16h。其它驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表9所示。

表9乳酸片球菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對乳酸乳球菌凍干后的微生物量的影響

如表9所示，以20000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的乳酸片球菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為乳酸乳球菌的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的乳酸乳球菌存活率提高了6.1倍，而對照組2說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對乳酸乳球菌不具有凍干保護(hù)作用。

實(shí)施例10：

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備乳酸片球菌胞內(nèi)物質(zhì)作為植物乳桿菌的冷凍干燥保護(hù)劑。具體地，制備乳酸片球菌胞內(nèi)成分的保護(hù)劑產(chǎn)品步驟同實(shí)施例8步驟相同；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對植物乳桿菌凍干過程的保護(hù)作用，步驟(f)中植物乳桿菌的培養(yǎng)條件為31℃、培養(yǎng)36h、培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基。其它驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表10所示。

表10乳酸片球菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對植物乳桿菌凍干后的微生物量的影響

如表9所示，以20000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的乳酸片球菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為植物乳桿菌的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的植物乳桿菌存活率提高了6.1倍，而對照組2說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對植物乳桿菌不具有凍干保護(hù)作用。

實(shí)施例11：

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備乳酸片球菌胞內(nèi)物質(zhì)作為干酪乳桿菌的冷凍干燥保護(hù)劑。具體地，制備乳酸片球菌胞內(nèi)成分的保護(hù)劑產(chǎn)品步驟同實(shí)施例8步驟相同；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對干酪乳桿菌凍干過程的保護(hù)作用，步驟(f)中干酪乳桿菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件同實(shí)施例5，其它驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表11所示。

表11乳酸片球菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對干酪乳桿菌凍干后的微生物量的影響

如表11所示，以20000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的乳酸片球菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為干酪乳桿菌的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的干酪乳桿菌存活率提高了4.1倍，而對照組2說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對干酪乳桿菌不具有凍干保護(hù)作用。

實(shí)施例12：

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備乳酸片球菌胞內(nèi)物質(zhì)作為雙歧桿菌的冷凍干燥保護(hù)劑。具體地，制備乳酸片球菌胞內(nèi)成分的保護(hù)劑產(chǎn)品步驟同實(shí)施例8步驟相同；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對雙歧桿菌凍干過程的保護(hù)作用，步驟(f)中雙歧桿菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件同實(shí)施例6，其它驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表12所示。

表12乳酸片球菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對雙歧桿菌凍干后的微生物量的影響

如表12所示，以20000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的乳酸片球菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為雙歧桿菌的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的雙歧桿菌存活率提高了11.6倍，而對照組2說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對雙歧桿菌不具有凍干保護(hù)作用。

實(shí)施例13：

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備乳酸片球菌胞內(nèi)物質(zhì)作為保加利亞乳桿菌的冷凍干燥保護(hù)劑。具體地，制備乳酸片球菌胞內(nèi)成分的保護(hù)劑產(chǎn)品步驟同實(shí)施例8步驟相同；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對保加利亞乳桿菌凍干過程的保護(hù)作用，步驟(f)中保加利亞乳桿菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件同實(shí)施例7，其它驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表13所示。

表13乳酸片球菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對保加利亞乳桿菌凍干后的微生物量的影響

如表13所示，以20000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的乳酸片球菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為保加利亞乳桿菌的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的保加利亞乳桿菌存活率提高了5.8倍，而對照組2說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對保加利亞乳桿菌不具有凍干保護(hù)作用。

實(shí)施例14-實(shí)施例16為提取冷凍預(yù)處理后的植物乳桿菌的胞內(nèi)物質(zhì)作為保護(hù)劑保護(hù)其自身及乳酸乳球菌、乳酸片球菌凍干過程的實(shí)驗(yàn)例

實(shí)施例14

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備植物乳桿菌胞內(nèi)物質(zhì)作為保護(hù)劑保護(hù)其自身凍干過程。具體地，植物乳桿菌31℃培養(yǎng)36h后，進(jìn)行冷凍預(yù)處理，梯度降溫條件為4℃、-20℃、-80℃、依次各處理2h；5000rpm、離心10min,0℃,收集菌體，菌體用技術(shù)方案步驟(b)中Tris-HCl緩沖液洗滌三次，菌體、緩沖液質(zhì)量體積配比為1:50；然后進(jìn)行超聲破碎，功率310w，超聲5s，停止5s，共超聲50min；離心收集超聲破碎后的上清液，離心條件為16000rpm，時(shí)間為10min，溫度為4℃；對上清液進(jìn)行真空冷凍干燥，冷阱溫度-70℃，真空度1Pa，得到冷凍保護(hù)劑；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對植物乳桿菌凍干過程的保護(hù)作用，驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表14所示。

表14植物乳桿菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對其自身凍干后的微生物量的影響

如表14所示，以16000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的植物乳桿菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為其自身的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的植物乳桿菌存活率提高了1.9倍，而對照組2說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對植物乳桿菌凍干保護(hù)作用微弱。

實(shí)施例15：

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備植物乳桿菌胞內(nèi)物質(zhì)作為乳酸乳球菌的冷凍干燥保護(hù)劑。具體地，制備植物乳桿菌胞內(nèi)成分的保護(hù)劑產(chǎn)品步驟同實(shí)施例14步驟相同；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對乳酸乳球菌凍干過程的保護(hù)作用，步驟(f)中乳酸乳球菌的的培養(yǎng)條件為31℃、培養(yǎng)16h。其它驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表15所示。

表15植物乳桿菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對乳酸乳球菌凍干后的微生物量的影響

如表15所示，以16000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的植物乳桿菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為乳酸乳球菌的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的乳酸乳球菌存活率提高了14.6倍，而對照組2說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對乳酸乳球菌不具有凍干保護(hù)作用。

實(shí)施例16：

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備植物乳桿菌胞內(nèi)物質(zhì)作為乳酸片球菌的冷凍干燥保護(hù)劑。具體地，制備植物乳桿菌胞內(nèi)成分的保護(hù)劑產(chǎn)品步驟同實(shí)施例14步驟相同；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對乳酸片球菌凍干過程的保護(hù)作用，其它驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表16所示。

表16植物乳桿菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對乳酸片球菌凍干后的微生物量的影響

如表16所示，以16000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的植物乳桿菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為乳酸片球菌的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的乳酸片球菌存活率提高了11.7倍，而對照組2說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對乳酸片球菌凍干保護(hù)作用微弱。

實(shí)施例17-實(shí)施例18為提取冷凍預(yù)處理后的干酪乳桿菌的胞內(nèi)物質(zhì)作為保護(hù)劑保護(hù)其自身及乳酸乳球菌凍干過程的實(shí)驗(yàn)例

實(shí)施例17

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備干酪乳桿菌胞內(nèi)物質(zhì)作為保護(hù)劑保護(hù)其自身凍干過程。具體地，干酪乳桿菌培養(yǎng)方法同實(shí)施例5，然后進(jìn)行冷凍預(yù)處理，梯度降溫條件為6℃、-18℃、-78℃、依次各處理2h；5000rpm、離心20min,0℃,收集菌體，菌體用技術(shù)方案步驟(b)中Tris-HCl緩沖液洗滌三次，菌體、緩沖液質(zhì)量體積配比為1:40；然后進(jìn)行超聲破碎，功率310w，超聲5s，停止5s，共超聲60min；離心收集超聲破碎后的上清液，離心條件為20000rpm，時(shí)間為10min，溫度為4℃；對上清液進(jìn)行真空冷凍干燥，冷阱溫度-70℃，真空度1Pa，得到冷凍保護(hù)劑；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對其自身凍干過程的保護(hù)作用，驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表17所示。

表17干酪乳桿菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對其自身凍干后的微生物量的影響

如表17所示，以20000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的干酪乳桿菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為其自身的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的干酪乳桿菌存活率提高了2.5倍，而對照組2說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對干酪乳桿菌凍干保護(hù)作用微弱。

實(shí)施例18：

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備干酪乳桿菌胞內(nèi)物質(zhì)作為乳酸乳球菌的冷凍干燥保護(hù)劑。具體地，制備干酪乳桿菌胞內(nèi)成分的保護(hù)劑產(chǎn)品步驟同實(shí)施例17步驟相同；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對乳酸乳球菌凍干過程的保護(hù)作用，步驟(f)中乳酸乳球菌的的培養(yǎng)條件為31℃、培養(yǎng)16h。其它驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表18所示。

表18干酪乳桿菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對乳酸乳球菌凍干后的微生物量的影響

如表18所示，以20000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的干酪乳桿菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為乳酸乳球菌的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的乳酸乳球菌存活率提高了3.5倍，而對照組2說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對乳酸乳球菌不具有凍干保護(hù)作用。

實(shí)施例19-實(shí)施例20為提取冷凍預(yù)處理后的雙歧桿菌的胞內(nèi)物質(zhì)作為保護(hù)劑保護(hù)其自身及乳酸乳球菌凍干過程的實(shí)驗(yàn)例

實(shí)施例19

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備雙歧桿菌胞內(nèi)物質(zhì)作為保護(hù)劑保護(hù)其自身凍干過程。具體地，雙歧桿菌培養(yǎng)方法同實(shí)施例6，然后進(jìn)行冷凍預(yù)處理，梯度降溫條件為4℃、-20℃、-80℃、依次各處理2h；5000rpm、4℃、離心20min,0℃,收集菌體，菌體用技術(shù)方案步驟(b)中Tris-HCl緩沖液洗滌三次，菌體、緩沖液質(zhì)量體積配比為1:50；然后進(jìn)行超聲破碎，功率310w，超聲5s，停止5s，共超聲60min；離心收集超聲破碎后的上清液，離心條件為16000rpm，時(shí)間為10min，溫度為4℃；對上清液進(jìn)行真空冷凍干燥，冷阱溫度-70℃，真空度1Pa，得到冷凍保護(hù)劑；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對其自身凍干過程的保護(hù)作用，驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表19所示。

表19雙歧桿菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對其自身凍干后的微生物量的影響

如表19所示，以16000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的雙歧桿菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為其自身的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的雙歧桿菌存活率提高了14.4倍，而對照組2說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對雙歧桿菌凍干保護(hù)作用微弱。

實(shí)施例20：

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備雙歧桿菌胞內(nèi)物質(zhì)作為乳酸乳球菌的冷凍干燥保護(hù)劑。具體地，制備雙歧桿菌胞內(nèi)成分的保護(hù)劑產(chǎn)品步驟同實(shí)施例19步驟相同；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對乳酸乳球菌凍干過程的保護(hù)作用，步驟(f)中乳酸乳球菌的的培養(yǎng)條件為31℃、培養(yǎng)16h。其它驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表20所示。

表20雙歧桿菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對乳酸乳球菌凍干后的微生物量的影響

如表20所示，以16000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的雙歧桿菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為乳酸乳球菌的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的乳酸乳球菌存活率提高了8.7倍，而對照組2說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對乳酸乳球菌不具有凍干保護(hù)作用。

實(shí)施例21-實(shí)施例22為提取冷凍預(yù)處理后的保加利亞乳桿菌的胞內(nèi)物質(zhì)作為保護(hù)劑保護(hù)其自身及乳酸乳球菌凍干過程的實(shí)驗(yàn)例

實(shí)施例21

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備保加利亞乳桿菌胞內(nèi)物質(zhì)作為保護(hù)劑保護(hù)其自身凍干過程。具體地，保加利亞乳桿菌培養(yǎng)方法同實(shí)施例7，然后進(jìn)行冷凍預(yù)處理，梯度降溫條件為4℃、-20℃、-80℃、依次各處理2h；5000rpm、4℃、離心20min,0℃,收集菌體，菌體用技術(shù)方案步驟(b)中Tris-HCl緩沖液洗滌三次，菌體、緩沖液質(zhì)量體積配比為1:50；然后進(jìn)行超聲破碎，功率310w，超聲5s，停止5s，共超聲60min；離心收集超聲破碎后的上清液，離心條件為16000rpm，時(shí)間為10min，溫度為4℃；對上清液進(jìn)行真空冷凍干燥，冷阱溫度-70℃，真空度1Pa，得到冷凍保護(hù)劑；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對其自身凍干過程的保護(hù)作用，驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表19所示。

表21保加利亞乳桿菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對其自身凍干后的微生物量的影響

如表21所示，以16000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的保加利亞乳桿菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為其自身的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的保加利亞乳桿菌存活率提高了7.2倍，而對照組2說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對保加利亞乳桿菌不具有凍干保護(hù)作用。

實(shí)施例22：

如圖1所示，按乳酸菌凍干保護(hù)劑制備流程制備保加利亞乳桿菌胞內(nèi)物質(zhì)作為乳酸乳球菌的冷凍干燥保護(hù)劑。具體地，制備保加利亞乳桿菌胞內(nèi)成分的保護(hù)劑產(chǎn)品步驟同實(shí)施例21步驟相同；然后驗(yàn)證冷凍保護(hù)劑對乳酸乳球菌凍干過程的保護(hù)作用，步驟(f)中乳酸乳球菌的的培養(yǎng)條件為31℃、培養(yǎng)16h。其它驗(yàn)證方法類似步驟(f)(g)。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表22所示。

表22保加利亞乳桿菌胞內(nèi)物質(zhì)(保護(hù)劑)對乳酸乳球菌凍干后的微生物量的影響

如表22所示，以16000rpm的離心速度收集超聲破碎后的上清液最終得到的保加利亞乳桿菌胞內(nèi)成分的凍干產(chǎn)品作為乳酸乳球菌的凍干保護(hù)劑，添加保護(hù)劑組相對不添加保護(hù)劑組對照1的乳酸乳球菌存活率提高了2.8倍，而對照組2說明不經(jīng)梯度降溫處理的正常細(xì)胞胞內(nèi)提取物對乳酸乳球菌不具有凍干保護(hù)作用。

可以理解的是，以上實(shí)施方式僅僅是為了說明本發(fā)明的原理而采用的示例性實(shí)施方式，然而本發(fā)明并不局限于此。對于本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明的精神和實(shí)質(zhì)的情況下，可以做出各種變型和改進(jìn)，這些變型和改進(jìn)也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。