本發(fā)明屬于基因診斷制品技術領域，具體涉及切除修復交叉互補組8(ERCC8)在制備檢測先天性白內障合并圓錐角膜基因診斷制品中的應用。

發(fā)明背景

先天性白內障(congenital cataract)是一種嚴重的致盲性晶狀體疾病，是由于胚胎期晶狀體代謝異常而導致其自身透明度下降的疾病。此病是導致兒童失明的主要原因之一，發(fā)病率約為0.01％-0.06％，占兒童致盲性眼病的第二位。先天性白內障可獨立發(fā)生，也可作為眼部或全身綜合征的伴發(fā)癥狀，常累及雙眼，常伴發(fā)眼前節(jié)發(fā)育不良，如虹膜缺損、Peters異常、瞳孔異位、眼球震顫及圓錐角膜等，這些多發(fā)畸形常使大多數(shù)患者喪失視力，是先天性致盲的重要原因之一。由于嬰幼兒視力正在發(fā)育中，而先天性白內障可嚴重影響視力發(fā)育，一旦錯過了治療最佳時機，即使進行了手術，其視力也很難恢復，因此會嚴重影響著患者的生活質量，給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟和精神負擔。

在先天性白內障中，約有一半的病例與遺傳相關，且絕大多數(shù)表型為常染色體顯性遺傳。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)三十多種致病基因和百個基因突變位點與先天性白內障相關，包括晶狀體蛋白基因、轉錄因子基因、連接蛋白基因及跨膜轉運蛋白基因等。先天性白內障基因/位點的鑒定對揭示先天性白內障疾病的致病機理及研究其防治措施具有重要意義。先天性白內障具有顯著的遺傳異質性，存在多個候選致病基因，這已經(jīng)成為先天性白內障的發(fā)病機制的研究以及針對病因的診斷和治療研究的瓶頸。這種現(xiàn)狀促使進一步去發(fā)現(xiàn)和了解該病新的致病基因，為后續(xù)的基因診斷、產(chǎn)前診斷及基因治療提供基礎。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種ERCC8基因在制備檢測先天性白內障合并圓錐角膜診斷制品中的應用，從而彌補現(xiàn)有技術的不足。

申請人從一個2代呈常染色體顯性遺傳的先天性白內障合并圓錐角膜家系中，對該家系中一名患者進行了視覺系統(tǒng)異常相關單基因遺傳病的505個基因的二代高通量測序，經(jīng)一代測序法驗證找到了該家系的致病基因ERCC8存在遺傳上的致病突變，從而促成了本發(fā)明。

本發(fā)明首先提供ERCC8基因新的用途，是在制備用于檢測先天性白內障合并圓錐角膜診斷制品中的應用；

本發(fā)明還提供一種用于檢測先天性白內障合并圓錐角膜的引物對，所述的引物對的上下游引物序列為SEQ ID NO:1-24中，其引物信息如下：

ERCC8-1F:CGGTGTGAGGACACGATA SEQ ID NO:1

ERCC8-1R:AGGGCAGTTATTCTTTGGAG SEQ ID NO:2

ERCC8-2F:AAATACGTTAGGATGTGTGGTA SEQ ID NO:3

ERCC8-2R:CAACATTTGGTAGGTTCGATG SEQ ID NO:4

ERCC8-3F:AGAAATCTCTTTTGCCGTCT SEQ ID NO:5

ERCC8-3R:TATGTGAACCATTCGCTTGA SEQ ID NO:6

ERCC8-4F:GCTGACGTCATAGAGTCTTCA SEQ ID NO:7

ERCC8-4R:ACCACTGTACTGCTTTCACATC SEQ ID NO:8

ERCC8-5F:AAGAAGGGGCAATTCTAGGT SEQ ID NO:9

ERCC8-5R:TGAAGATGTTTGTTGCAGGT SEQ ID NO:10

ERCC6-6F:GCATGGATACAGTGAAAATGTC SEQ ID NO:11

ERCC8-6R:ACACTGATGTGAGTTGCATT SEQ ID NO:12

ERCC8-7F:TTTGGCCTCACTTTCTTCAG SEQ ID NO:13

ERCC8-7R:GACACAACACAGTTCCTCTG SEQ ID NO:14

ERCC8-8F:GGTACAGTCATTGTCCTAGC SEQ ID NO:15

ERCC8-8R:CTTTGTCACATGGATTGCAG SEQ ID NO:16

ERCC8-9F:CATGGCACAATTTCCTTGCT SEQ ID NO:17

ERCC8-9R:GTAGGTAGTGGGTAAGGGTG SEQ ID NO:18

ERCC8-10F:TAGCCAAATTACACTGCCAC SEQ ID NO:19

ERCC8-10R:ATATAACTGGTCTGGCAAGC SEQ ID NO:20

ERCC8-11F:GACATTGACATAGGCTGTGC SEQ ID NO:21

ERCC8-11R:TAGAAGTCACTGTACCATTTGTG SEQ ID NO:22

ERCC8-12F:AGTCTTAGCCTATGGATATCAG SEQ ID NO:23

ERCC8-12R:GTCACAACTGAGGTACAACG SEQ ID NO:24

本發(fā)明還提供一種用于檢測先天性白內障合并圓錐角膜的試劑盒，包含有上述的引物對中的任一種或幾種。

本發(fā)明還提供一種與先天性白內障合并圓錐角膜疾病相關的SNP位點，為ERCC8基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第394至398位的缺失突變，其堿基為TTACA或-；

其中用于檢測上述SNP位點的引物信息如下：

ERCC8-4F:GCTGACGTCATAGAGTCTTCASEQ ID NO:7

ERCC8-4R:ACCACTGTACTGCTTTCACATC SEQ ID NO:8

本發(fā)明提供了ERCC8基因的新的用途，從而提供了一種有效的進行先天性白內障合并圓錐角膜疾病基因診斷、產(chǎn)前基因篩查及遺傳咨詢的途徑，應用效果表明本發(fā)明所提供的基因的SNP位點及檢測引物可以有效的用于臨床患者及胎兒絨毛或羊水進行ERCC8基因突變位點的快速檢測。

附圖說明

圖1：實施例1的先天性白內障合并圓錐角膜家系內患者ERCC8測序圖，其中A：患者丈夫，正常表型；B：患者；C：患者兒子，疾病表型。該家系中兩名患者ERCC8基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第394至398位堿基發(fā)生了雜合缺失突變，其堿基由TTACA變?yōu)?。

具體實施方式

申請人在一個先天性白內障合并圓錐角膜家系中發(fā)現(xiàn)ERCC8基因的突變位點，并證實該基因的突變是該病的致病基因，從而促成了本發(fā)明。

ERCC8基因位于染色體5q12.1,可轉錄成大約2044bp的mRNA(NCBI登錄號為NM_000082.3)，直接翻譯形成396個氨基酸組成的蛋白質。

下面結合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。

實施例1：從先天性白內障合并圓錐家系中篩選ERCC8基因的突變位點

1、提取外周血基因組DNA：

在符合國家相關政策規(guī)定，并在取樣對象同意的基礎上，抽取家系成員外周靜脈血2-5ml，放入EDTA抗凝管內，-80℃凍存?zhèn)溆?；凍存的EDTA抗凝血在室溫融化后，取500μl放于離心管，加入等體積TE(pH8.0)，混勻，4℃，10000rpm離心10分鐘，棄上清。

加入180μlTE、20μlSDS(10％)、8μl蛋白酶K(10mg/ml)混勻，置于56℃水浴過夜。從水浴中取出樣品，瞬時離心沉淀樣本。在反應管中加入等體積的Tris-飽和酚(約300μl)，充分混勻，室溫下10000rpm離心10分鐘，吸取上清液(約300μl)至一新離心管中。重復酚抽提一次，吸取上清液至一新離心管中。

加入等體積的Tris飽和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μl)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉移上清液至一新離心管。

加入等體積的Tris飽和酚:氯仿:異戊醇混合液(酚、氯仿、異戊醇各100μl)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉移上清液至一新離心管。

加入1/10體積3mol/L、pH5.2醋酸鈉(約30μl)，2倍體積預冷100％乙醇，輕輕混合，可見白色絮狀沉淀。室溫10000rpm離心10分鐘，使DNA沉淀于管底，棄上清。

向DNA沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室溫7000rpm離心5分鐘，棄上清，置于室溫中揮發(fā)剩余乙醇，最后加入50μl TE(pH8.0)，4℃過夜溶解DNA。

對提取的DNA行瓊脂糖膠電泳，并應用紫外分光光度計在260nm和280nm比色，檢測DNA純度及濃度。

2、目標序列捕獲高通量測序：目標序列捕獲高通量測序技術是一種新型的基因組分析技術，使用一套核苷酸探針捕獲基因組上的目標序列，然后使用通用引物對這些捕獲到的序列進行擴增，再對這些擴增產(chǎn)物進行高通量生物信息學分析。取該家系中1名患者的基因組DNA，由北京德易東方轉化醫(yī)學研究中心有限公司應用探針捕獲人類視覺系統(tǒng)異常相關單基因遺傳病的505個基因的外顯子區(qū)域，然后對富集的外顯子文庫進行高通量測序。將突變?yōu)V過4個正常人數(shù)據(jù)庫：單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因組計劃(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，Hapmap8數(shù)據(jù)庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黃數(shù)據(jù)庫(http://yh.genomics.org.cn/)，應用直接測序法在該家系內篩選到與致病單倍體型共分離的致病基因ERCC8，并在正常人群外周血基因組DNA樣本中進行該位點的突變篩查，未發(fā)現(xiàn)該突變。

3、直接測序法尋找該家系內患者ERCC8基因的突變

PCR擴增目的片段：反應條件與反應體系：

(1)PCR反應條件：95℃5min；94℃30sec，60-50℃30sec(-1℃/cycles)，72℃60sec，10cycles；94℃30sec，50℃30sec，72℃60sec，25cycles；72℃10min。引物對為ERCC8-4F：GCTGACGTCATAGAGTCTTCA ERCC8-4R：ACCACTGTACTGCTTTCACATC。

(2)反應體系：(TaKaRaTaq)

應用該反應體系分別進行每名家系成員的基因組DNA模板與該ERCC8引物的擴增反應。

PCR產(chǎn)物測序：應用常規(guī)Sanger測序法對上述PCR產(chǎn)物進行測序，發(fā)現(xiàn)該家系中兩名患者的ERCC8基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第394至398位堿基發(fā)生了雜合缺失突變，其堿基由TTACA變?yōu)?(圖1)。多次測序結果表明該突變位點并不是因為擴增或測序錯誤引進的。該突變未有報道，且不存在于下面的四個數(shù)據(jù)庫中：單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫，千人基因組計劃，Hapmap8數(shù)據(jù)庫及炎黃數(shù)據(jù)庫，表明該突變非常罕見，該突變導致了ERCC8蛋白第131位氨基酸后缺失移碼。應用突變預測程序MutationTaster(http://www.mutationtaster.org/index.html)預測發(fā)現(xiàn)，該突變是“disease causing”級的損壞，從而引起了該家系中患者先天性白內障合并圓錐角膜的發(fā)生。而在200例正常當?shù)厝巳旱耐庵苎蚪MDNA樣本中進行該位點的突變篩查，未發(fā)現(xiàn)該突變。

根據(jù)ERCC8的基因組序列設計擴增其各外顯子的引物對，其正反引物的序列信息如下：

ERCC8-1F:CGGTGTGAGGACACGATA

ERCC8-1R:AGGGCAGTTATTCTTTGGAG

ERCC8-2F:AAATACGTTAGGATGTGTGGTA

ERCC8-2R:CAACATTTGGTAGGTTCGATG

ERCC8-3F:AGAAATCTCTTTTGCCGTCT

ERCC8-3R:TATGTGAACCATTCGCTTGA

ERCC8-4F:GCTGACGTCATAGAGTCTTCA

ERCC8-4R:ACCACTGTACTGCTTTCACATC

ERCC8-5F:AAGAAGGGGCAATTCTAGGT

ERCC8-5R:TGAAGATGTTTGTTGCAGGT

ERCC6-6F:GCATGGATACAGTGAAAATGTC

ERCC8-6R:ACACTGATGTGAGTTGCATT

ERCC8-7F:TTTGGCCTCACTTTCTTCAG

ERCC8-7R:GACACAACACAGTTCCTCTG

ERCC8-8F:GGTACAGTCATTGTCCTAGC

ERCC8-8R:CTTTGTCACATGGATTGCAG

ERCC8-9F:CATGGCACAATTTCCTTGCT

ERCC8-9R:GTAGGTAGTGGGTAAGGGTG

ERCC8-10F:TAGCCAAATTACACTGCCAC

ERCC8-10R:ATATAACTGGTCTGGCAAGC

ERCC8-11F:GACATTGACATAGGCTGTGC

ERCC8-11R:TAGAAGTCACTGTACCATTTGTG

ERCC8-12F:AGTCTTAGCCTATGGATATCAG

ERCC8-12R:GTCACAACTGAGGTACAACG

分別應用上述的每一對引物進行ERCC8基因的檢測。

另在山東地區(qū)收集診斷明確的先天性性白內障合并圓錐角膜散發(fā)患者一名，提取其外周血基因組DNA，應用該患者的DNA模板與ERCC8-4F和ERCC8-4R引物進行PCR擴增，應用常規(guī)Sanger測序法對上述PCR產(chǎn)物進行測序，該患者的ERCC8基因存在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的SNP突變，即編碼區(qū)域由起始密碼子起第394至398位堿基發(fā)生了雜合缺失突變，其堿基由TTACA變?yōu)?。

通過上述的分析，證明ERCC8基因可以用來檢測患者是否具有潛在患先天性白內障合并圓錐角膜的危險。通過將檢測者的ERCC8基因的各外顯子片段于正常的對應片段比較，確定待檢測者的患病風險。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東省眼科研究所

<120> ERCC8基因在先天性白內障合并圓錐角膜檢測中的應用

<130>

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

cggtgtgagg acacgata 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

agggcagtta ttctttggag 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 3

<400> 3

aaatacgtta ggatgtgtgg ta 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 4

<400> 4

caacatttgg taggttcgat g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 5

<400> 5

agaaatctct tttgccgtct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 6

<400> 6

tatgtgaacc attcgcttga 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 7

<400> 7

gctgacgtca tagagtcttc a 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 8

<400> 8

accactgtac tgctttcaca tc 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 9

<400> 9

aagaaggggc aattctaggt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 10

<400> 10

tgaagatgtt tgttgcaggt 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 11

<400> 11

gcatggatac agtgaaaatg tc 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 12

<400> 12

acactgatgt gagttgcatt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 13

<400> 13

tttggcctca ctttcttcag 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 14

<400> 14

gacacaacac agttcctctg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 15

<400> 15

ggtacagtca ttgtcctagc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 16

<400> 16

ctttgtcaca tggattgcag 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 17

<400> 17

catggcacaa tttccttgct 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 18

<400> 18

gtaggtagtg ggtaagggtg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 19

<400> 19

tagccaaatt acactgccac 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 20

<400> 20

atataactgg tctggcaagc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 21

<400> 21

gacattgaca taggctgtgc 20

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 22

<400> 22

tagaagtcac tgtaccattt gtg 23

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 23

<400> 23

agtcttagcc tatggatatc ag 22

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 24

<400> 24

gtcacaactg aggtacaacg 20