本發(fā)明涉及生物
技術領域：
中的豆科牧草，尤其涉及一種紫花苜蓿MsNAP基因啟動子及其應用。
背景技術：
：紫花苜蓿（MedicagosativaL.）是多年生豆科牧草，也是全國乃至世界上種植最多的牧草品種。由于其適應性強、產量高和品質好等優(yōu)點，素有“牧草之王”之美稱。許多研究表明，在奶牛日糧中添加紫花苜蓿干草可顯著提高奶牛的產奶量，降低飼養(yǎng)成本，獲得更大的經濟效益。植物衰老是一個與植株年齡相關的，在細胞、組織和器官以及整體水平上的衰退過程，并最終導致植物體的死亡或生命周期的終結。在目前生命科學的研究中，對葉片衰老進程的調控機理還知之甚少，而對葉片衰老進程與作物產量和品質性狀的協(xié)同調控機理則了解得更少。在北京香山舉行的以“植物衰老與作物增產和品質改良”為主題的第351次科學會議上，會議執(zhí)行主席、前北京大學許智宏教授說，植物衰老研究是當前國家重大戰(zhàn)略發(fā)展的需求。衰老過程是植株或器官發(fā)育的最后階段，與收獲器官的形成及營養(yǎng)轉運密切相關，理解其調控對于作物遺傳改良和果蔬保鮮有著至關重要的作用，因此對植物葉片衰老遺傳調控機理等方面的研究，對于更好地服務于農業(yè)生產具有重要的意義。轉錄因子是一組具有識別特異DNA序列的蛋白，能促進或抑制某些特定基因的轉錄及表達，從而導致組織細胞結構和功能的改變。在植物葉片發(fā)育和衰老過程中，轉錄因子起著非常重要的作用。NAC轉錄因子是植物中最大的一類轉錄因子家族轉錄因子，NAC轉錄因子也構成了植物中最大的一類衰老調控因子。NAP是一種NAC家族蛋白，它含有典型的NAC轉錄因子結構，在擬南芥葉片衰老過程中，表達量逐漸升高。將擬南芥NAP基因在轉基因植物中過量表達，能夠明顯加快植物的衰老速度。NAP基因在水稻和豌豆中的同源基因，在衰老的植物組織中，能夠特異性表達，Guo等人發(fā)現(xiàn)，水稻NAP基因能夠促進植物的衰老。Kou等人發(fā)現(xiàn)，NAP基因除了引起植物葉片的衰老，還能明顯加快果實的衰老。這些結果表明，NAP基因在不同植物中存在一定的保守性。目前為止，紫花苜蓿MsNAP基因的功能仍然未知，沒有任何可以參考的文獻資料。作為一種新的轉錄因子，研究該基因的啟動子顯得尤為關鍵。因此，利用現(xiàn)代分子生物學的方法研究紫花苜蓿MsNAP基因啟動子的功能，為研究紫花苜蓿衰老的調控、為進一步探索紫花苜蓿MsNAP基因功能以及調控紫花苜蓿衰老提供可能。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的就在于提供一種紫花苜蓿MsNAP基因啟動子及其應用，為調控紫花苜蓿衰老基因的表達提供有效手段。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：一、紫花苜蓿MsNAP基因啟動子其序列含有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，包括：如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；或在嚴格條件下與SEQIDNO.1限定的DNA序列雜交且具有相同功能的核苷酸序列；所述的嚴格條件是：在65℃下,在含0.1%SDS的0.1×SSC溶液中，進行洗膜操作；或與SEQIDNo.1限定的核苷酸至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且具有相同功能的核苷酸序列；其特異性引物，包括：SEQIDNO.2：正向引物NAPp-1：5'-TTATTTTGGAATCTGAATCTC-3'；SEQIDNO.3：反向引物NAPp-2：5'-TGAGTAAAATATTGAGAAA-3'；在本發(fā)明所提供的特異性引物中，正向引物根據(jù)染色體步移法設計，反向引物位于MsNAP基因5’端UTR區(qū)內；其表達載體所述表達載體為雙酶切切除35S啟動子后連接MsNAP的啟動子序列的3302-GUS載體。二、紫花苜蓿MsNAP基因啟動子的獲得方法*其特異性引物，包括：SEQIDNO.4：1輪PCR引物NAP-1：5'-TCTGGGATGATAGATGCAGGACATG-3'；SEQIDNO.5：2輪PCR引物NAP-2：5'-ACATGGTTGTGATGTTGCTTGATTA-3'；SEQIDNO.6：3輪PCR引物NAP-3：5'-GTTCCTCATCAGTTGGATGAAACCT-3'；*PCR模板，包括：所述進行染色體步移PCR模板，第一輪PCR模板為紫花苜?；蚪MDNA；第二輪PCR模板為第一輪PCR產物；第三輪PCR模板為第二輪PCR產物；*PCR條件，包括：所述進行染色體步移PCR條件，第一輪程序：95℃10min；94℃10s；62℃30s；72℃2min；94℃10s；25℃2min0.2℃/s；72℃2min；94℃10s；62℃30s；72℃2min；10循環(huán)；94℃10s；62℃30s；72℃2min；10循環(huán)；94℃10s；44℃30s；72℃2min；10循環(huán)；72℃5min第二輪程序：95℃10min；95℃30s；60℃30s；72℃2min；-0.1℃/Cycle，30循環(huán)；72℃5min；第三輪程序：95℃10min；95℃30s；60℃30s；72℃2min；-0.1℃/Cycle，20循環(huán)；72℃5min。三、紫花苜蓿MsNAP基因啟動子的應用紫花苜蓿MsNAP的啟動子序列或所述表達載體在調控植物的基因表達中的應用：所述應用包括構建植物表達載體后轉化植物；可選地，所述應用包括調控紫花苜蓿衰老基因的表達；可選地，所述植物為煙草。本發(fā)明具有下列優(yōu)點和積極效果：①本發(fā)明提供了MsNAP基因的啟動子序列，并通過轉基因技術對其功能進行驗證，結果表明MsNAP啟動子在衰老葉片中活性較強；②為進一步探索調控紫花苜蓿衰老基因的表達，調控紫花苜蓿衰老奠定了基礎。附圖說明圖1為紫花苜蓿總DNA電泳圖；圖2為染色體步移擴增啟動子第3輪PCR的電泳圖；圖3為啟動子PCR擴增電泳圖；圖4為3302-GUS載體結構示意圖；圖5為植物表達載體構建圖；圖6為轉MsNAP基因啟動子的煙草葉片圖，A：未衰老的煙草葉片，B：已衰老的煙草葉片；圖7為MsNAP基因啟動子驅動GUS基因在煙草未衰老葉片中的表達圖片；圖8為MsNAP基因啟動子驅動GUS基因在煙草衰老葉片中的表達圖片。具體實施方式下面結合具體實施例和附圖對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。1、材料與方法1.1、植物材料紫花苜?！６ㄜ俎！徲诳藙谖植輼I(yè)公司，播種于直徑10cm的花盆中，培養(yǎng)基質為草炭：沙：蛭石（V：V：V）=3：3：1；在溫室內培養(yǎng)生長2周，每四天澆水一次。1.2、紫花苜?；蚪MDNA提取剪取健康生長的紫花苜蓿葉片100-200mg，研缽中液氮磨碎，采用CTAB法提取基因組DNA。1.3、MsNAP基因啟動子的克隆根據(jù)已獲得的MsNAP基因的cDNA序列，采用PrimerPrimier5.0軟件設計了3條特異性引物（表1）；以紫花苜蓿基因組DNA為模板，通過染色體步移技術，進行MsNAP基因上游DNA區(qū)域擴增。表1染色體步移的特異性引物引物名稱引物序列5’-3’用途NAP-1TCTGGGATGATAGATGCAGGACATG第1輪PCRNAP-2ACATGGTTGTGATGTTGCTTGATTA第2輪PCRNAP-3GTTCCTCATCAGTTGGATGAAACCT第3輪PCR所采用的染色體步移的四條隨機引物為TaKaRa公司生產的GenomeWalkingKit試劑盒自帶，分別為：AP1，AP2，AP3和AP4；PCR所用試劑為康為世紀生物公司生產的2×PCRMix（貨號：CW0960S）。PCR體系及反應程序分別如表2，表3所示。表2染色體步移反應體系表3染色體步移反應程序三輪PCR結束后，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑選有單一條帶的PCR產物送公司測序；對測序結果用DNAMAN7.0和NCBI網站進行比對分析，確定啟動子的核苷酸序列；按照所獲得的啟動子序列設計包含啟動子序列的一對引物，NAPp-1和NAPp-2；以紫花苜蓿DNA為模板，PCR擴增MsNAP基因的啟動子；PCR產物純化回收后連接pMD19-T載體，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆送公司測序；對測序結果正確的菌液提取質粒，將其命名為pMD-NAPp。表4啟動子克隆引物1.4、啟動子基因序列分析對啟動子基因序列進行分析，預測可能存在的TATA-box，CAAT-box以及可能存在的順式作用元件。1.5、載體構建采用SmaI為內切酶切除3302-GUS所含的35S啟動子，通過純化回收酶切產物，在T4DNA連接酶作用下，16℃反應6h，形成環(huán)狀DNA產物，轉化大腸桿菌，通過PCR檢測，挑選陽性克隆，送生物公司測序，對含有目的質粒的菌液，提取質粒，將該質粒命名為：3302-GUS1。通過NcoI為限制性內切酶，對3302-GUS1進行酶切處理；以NAPp-f和NAPp-r為引物（表3），pMD-NAPp為模板，進行PCR擴增，對PCR獲得的片段和酶切處理的3302-GUS1產物純化之后采用中美太和生物技術有限公司的SeamlessAssemblyCloningKit試劑盒進行無縫連接，50℃反應15min，連接產物轉化大腸桿菌，通過PCR檢測，挑選陽性克隆，送生物公司測序，對含有目的質粒的菌液，提取質粒，將該質粒命名為：MsNAPpro::GUS植物表達載體。構建好的質粒采用凍融法轉入LBA4404農桿菌中，加50%（V：V）甘油后放-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?構建植物表達載體引物1.6、煙草轉化以野生型煙草（NC89）作為植物材料，采用葉盤轉化的方法，將構建好的載體通過農桿菌介導轉化煙草，將所獲得的轉基因煙草植株進行PCR檢測，收集轉基因煙草衰老和未衰老的葉片。1.7、啟動子的活性鑒定分析選取衰老和未衰老的轉基因煙草葉片，采用組織化學法進行檢測，以X-Gluc為反應底物，做GUS染色，利用LEICADM2500體式顯微鏡拍照。2、結果與分析2.1、MsNAP啟動子的克隆以紫花苜?；蚪MDNA為模板（圖1為紫花苜蓿基因組DNA電泳圖），進行染色體步移（如圖2所示），獲得一個長度為1390bp的片段（如圖3所示），包含TATAbox和CAATbox。2.2、GUS植物表達載體的構建采用SmaI為內切酶切除3302-GUS所含的35S啟動子，通過自連，構建不含有35S啟動子的GUS報告基因載體3302-GUS1；采用NcoI為內切酶對3302-GUS1進行線性化處理，連接MsNAP啟動子，構建成MsNAP啟動子驅動GUS報告基因的雙元表達載體（如圖4-5所示）。2.3、啟動子活性鑒定分析將構建好的質粒轉化農桿菌LBA4404，采用葉盤轉化法進行轉基因煙草轉化。待轉基因煙草長大、生根，轉移到花盆中，進行PCR檢測。收集衰老、未衰老轉基因煙草葉片，進行GUS染色分析，結果顯示：衰老葉片中染色深度明顯高于未衰老葉片的染色（如圖6-8所示），表明：紫花苜蓿MsNAP基因的啟動子是一種受衰老組織誘導的特異性啟動子。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。序列表<110>北京林業(yè)大學<120>紫花苜蓿MsNAP基因啟動子及其應用<140><141><160>8<210>1<211>1390<212>DNA<213>MsNAP啟動子<400>TTATTTTGGAATCTGAATCTCAAGCGATTTTGAATTTGATTGCCAATGATCATCGGAATGAATTTCATCCTAGGACTATTCTTTCACTCATTAAAAAGCTCTCATCTCTTCCTTGAGTGTTTTTCTTTTCCCACACACCGAAGAAAGGCAATGAATATGCTAATTAGCTGGCTAAATACGAGACTGAAAACATTGACACTCTGAAGATATGAACTACTCCCCCTCTACAACTAGATGTTATCTTGTTAGCCGACTCCTCTGGAGTTTTTAGGCACCGAGTTGCTTAATCTTCTATTTTTATTTTTTTTTGGATTTTCCTTGTACTAAAAAAAATCATGACTAGAAAATCTATGAATTTTATTCTAAAAACAAAAGAATAACTTTTTGTTAAAAAAATACCAACTTTTATTTATTTTGTATTTTTTCCCATATGATTTTCAAAATTCTTGACCAGAATTCCCACCACCTCAAATCAATAACATATTTAAAGATTACTTAGATATTAAAATTGCATATGCAAAATCCATTGACCAAACACAAGACCACTCAAACCAAACCAATTTGATATCTTTGAAGATTATTACTACAAAACAAAACAACCATATTTTTGTAATGATCTAAGAATTCAAAAAACTAGTTTTGCTGACATCAACTTAACAATTATACTCCCTCCGTCTCTAAATAATAGTCGTTTAAGGTTGATGCACGATTATTAAGGAAATGATTAATTGTGTTGATTTTGATGGTAAAATTAGTATTATTTACTAAAACACCCTTATTAATTGTAGTTAGTGGAGTAGTTAAGTTGAATGAAGTTCAATAAATAAGGGTATTATAATGGAAAAAATAATAAATGTTGCATTGGTATTCTAAAGTGACAATTATTTTGAGAAAAAAATGGGTAAAGAGACAATTATTGTGAGACGGAGGGAGTACAAAACTTTATATATATGCAATATGCCAATAATATTCCTCCAAAGCATTGAATACAACCTTAATGTGGATAAAGTCGACCTATCTAGTGTTATTCAAAAAAAAAAAAAGGAAAAAGTCATTTAAAAGATATGTGAGGGAGTTCTAGTCACTGATTGGAGCATGGCATGAGCTTAATTTGTAACGCATATTCTAAGGTAACATAAAAAAGTCTTTCTATGAACCAATCAAATCCATGCAACACTACACAAACGACAAAAAACCTCAAAGATAAAAGGGGCATCAATCTCTTTGCAAACATTTCAAACACCTTGATTTCTCTTGAACCCTCCTTTACAATATCAATTTTCTAACAACTTTTTCTCAAATTAATTTTCTAGTAACATTTTTCTCCTAAAGAAAAAAGCCAACAAAATTATTAGTCTATAGTTTCTTATTTTTCTCAATATTTTACTCA；<210>2<211><212>DNA<213>正向引物NAPp-1<400>21TTATTTTGGAATCTGAATCTC；<210>3<211>19<212>DNA<213>反向引物NAPp-2<400>TGAGTAAAATATTGAGAAA；<210>4<211>25<212>DNA<213>NAP-1<400>TCTGGGATGATAGATGCAGGACATG；<210>5<211>25<212>DNA<213>NAP-2<400>ACATGGTTGTGATGTTGCTTGATTA；<210>6<211>25<212>DNA<213>NAP-3<400>GTTCCTCATCAGTTGGATGAAACCT；<210>7<211>41<212>DNA<213>NAPp-f<400>AAGCCTAGGGAGGAGTCCACTTATTTTGGAATCTGAATCTC；<210>8<211>38<212>DNA<213>NAPp-r<400>TTTACCCTCAGATCTACCATTGAGTAAAATATTGAGAA。序列表<110>北京林業(yè)大學<120>紫花苜蓿MsNAP基因啟動子及其應用<140><141><160>8<210>1<211>1390<212>DNA<213>MsNAP啟動子<400>TTATTTTGGAATCTGAATCTCAAGCGATTTTGAATTTGATTGCCAATGATCATCGGAATGAATTTCATCCTAGGACTATTCTTTCACTCATTAAAAAGCTCTCATCTCTTCCTTGAGTGTTTTTCTTTTCCCACACACCGAAGAAAGGCAATGAATATGCTAATTAGCTGGCTAAATACGAGACTGAAAACATTGACACTCTGAAGATATGAACTACTCCCCCTCTACAACTAGATGTTATCTTGTTAGCCGACTCCTCTGGAGTTTTTAGGCACCGAGTTGCTTAATCTTCTATTTTTATTTTTTTTTGGATTTTCCTTGTACTAAAAAAAATCATGACTAGAAAATCTATGAATTTTATTCTAAAAACAAAAGAATAACTTTTTGTTAAAAAAATACCAACTTTTATTTATTTTGTATTTTTTCCCATATGATTTTCAAAATTCTTGACCAGAATTCCCACCACCTCAAATCAATAACATATTTAAAGATTACTTAGATATTAAAATTGCATATGCAAAATCCATTGACCAAACACAAGACCACTCAAACCAAACCAATTTGATATCTTTGAAGATTATTACTACAAAACAAAACAACCATATTTTTGTAATGATCTAAGAATTCAAAAAACTAGTTTTGCTGACATCAACTTAACAATTATACTCCCTCCGTCTCTAAATAATAGTCGTTTAAGGTTGATGCACGATTATTAAGGAAATGATTAATTGTGTTGATTTTGATGGTAAAATTAGTATTATTTACTAAAACACCCTTATTAATTGTAGTTAGTGGAGTAGTTAAGTTGAATGAAGTTCAATAAATAAGGGTATTATAATGGAAAAAATAATAAATGTTGCATTGGTATTCTAAAGTGACAATTATTTTGAGAAAAAAATGGGTAAAGAGACAATTATTGTGAGACGGAGGGAGTACAAAACTTTATATATATGCAATATGCCAATAATATTCCTCCAAAGCATTGAATACAACCTTAATGTGGATAAAGTCGACCTATCTAGTGTTATTCAAAAAAAAAAAAAGGAAAAAGTCATTTAAAAGATATGTGAGGGAGTTCTAGTCACTGATTGGAGCATGGCATGAGCTTAATTTGTAACGCATATTCTAAGGTAACATAAAAAAGTCTTTCTATGAACCAATCAAATCCATGCAACACTACACAAACGACAAAAAACCTCAAAGATAAAAGGGGCATCAATCTCTTTGCAAACATTTCAAACACCTTGATTTCTCTTGAACCCTCCTTTACAATATCAATTTTCTAACAACTTTTTCTCAAATTAATTTTCTAGTAACATTTTTCTCCTAAAGAAAAAAGCCAACAAAATTATTAGTCTATAGTTTCTTATTTTTCTCAATATTTTACTCA；<210>2<211><212>DNA<213>正向引物NAPp-1<400>21TTATTTTGGAATCTGAATCTC；<210>3<211>19<212>DNA<213>反向引物NAPp-2<400>TGAGTAAAATATTGAGAAA；<210>4<211>25<212>DNA<213>NAP-1<400>TCTGGGATGATAGATGCAGGACATG；<210>5<211>25<212>DNA<213>NAP-2<400>ACATGGTTGTGATGTTGCTTGATTA；<210>6<211>25<212>DNA<213>NAP-3<400>GTTCCTCATCAGTTGGATGAAACCT；<210>7<211>41<212>DNA<213>NAPp-f<400>AAGCCTAGGGAGGAGTCCACTTATTTTGGAATCTGAATCTC；<210>8<211>38<212>DNA<213>NAPp-r<400>TTTACCCTCAGATCTACCATTGAGTAAAATATTGAGAA。當前第1頁1 2 3