本發(fā)明涉及細胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種永生化羅非魚巨噬細胞系的建立及鑒定方法。
背景技術(shù)：
：魚類巨噬細胞的形態(tài)和功能與哺乳動物的類似，在識別、吞噬病原微生物、處理和呈遞抗原、激活淋巴細胞啟動特異性免疫應(yīng)答以及分泌免疫因子等方面發(fā)揮重要作用。魚類巨噬細胞的活性與功能是反映和評價魚類集體免疫水平的重要指標，對其活性與功能進行測定已成為魚類免疫學(xué)、免疫毒理學(xué)、免疫藥物篩選等研究的重要內(nèi)容。自成功從金魚前腎中分離并鑒定巨噬細胞系以來，相繼有多種魚的巨噬細胞系得以建立，并廣泛進行了體外免疫功能指標如吞噬活性、趨化性、產(chǎn)生活性氧及一氧化碳等研究，但大部分研究對象主要為鱸魚、鯛魚、鯰魚和鯉魚等魚類。羅非魚是世界水產(chǎn)業(yè)重點培養(yǎng)淡水養(yǎng)殖魚類，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占重要地位，但目前對羅非魚巨噬細胞免疫活性的相關(guān)研究較少，雖然有學(xué)者已經(jīng)成功從羅非魚頭腎和腹腔中分離巨噬細胞，但未能獲得具有單一克隆特性的能穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的羅非魚巨噬細胞系，使得相關(guān)免疫學(xué)研究停滯不前。然而，中國是羅非魚養(yǎng)殖的主要國家，近幾年羅非魚鏈球菌病卻嚴重危害著我國羅非魚養(yǎng)殖及相關(guān)產(chǎn)業(yè)，每年造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)億美元。病害的暴發(fā)與隨之而來的產(chǎn)品安全問題已成為制約我國羅非魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。目前的藥物只能在發(fā)病早期控制病情，但耐藥和抗藥性卻不斷產(chǎn)生和積累，急需有效的疫苗防制措施。目前的研究表明羅非魚鏈球菌HSP70-肽疫苗在實驗室獲得了較高的免疫保護率(約78.0％)，而這有賴于羅非魚巨噬細胞與HSP70的相互作用，但目前尚未能闡述獲得高保護率的重要機制，這就需要首先獲得單一克隆特性的能穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的羅非魚巨噬細胞系?；诖?，本發(fā)明在分離純化羅非魚腹腔巨噬細胞的基礎(chǔ)上，利用EBV病毒感染巨噬細胞，通過篩選單克隆細胞的方法，經(jīng)傳代穩(wěn)定性、體外增殖、端粒酶活性、核型及特異性基因檢測等實驗鑒定，獲得了能連續(xù)傳代且功能確切的永生化羅非魚巨噬細胞系。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為獲得單一克隆特性的能穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的羅非魚巨噬細胞系及為羅非魚養(yǎng)殖提供一種穩(wěn)定有效的疫苗，提供一種永生化羅非魚巨噬細胞系的建立方法和鑒定方法。為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的技術(shù)方案為：一種永生化羅非魚巨噬細胞系的建立方法，具體步驟如下：1)挑選體重為100g±5g健康尼羅羅非魚，于28-30℃水溫條件下在充氣水族箱中飼養(yǎng)，正常喂食7天后，對每尾羅非魚腹腔注射250μL角鯊烯，每隔2天注射相同劑量角鯊烯，連續(xù)注射3次，并于分離細胞前一天停止喂食；2)在注射角鯊烯第7天后，使用100mg/L的MS-222麻醉試驗魚，75％酒精消毒體表；再用預(yù)冷的PBS沖洗腹腔，收集沖洗液于45ml離心管中，300g、4℃離心10min；吸去上清，細胞沉淀用HBSS重懸，300g、4℃離心10min洗滌1次；細胞重懸于2mlHBSS，加入9ml滅菌三蒸水作用20s破裂紅細胞，立即加入1ml10×HBSS；300g、4℃離心10min，HBSS洗滌2次，最后用L-15培養(yǎng)基重懸細胞，進行稀釋后臺盼藍染色，計算活細胞數(shù)，瑞氏染色觀察細胞狀態(tài)；然后分別用含100IU/ml氨芐青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素、10％FBS的L-15培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度約為1×106個/ml，于12孔板中28℃培養(yǎng)24h后吸去懸浮細胞，加入新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；在不同培養(yǎng)時間，吸去培養(yǎng)上清，加入瑞氏染色液染色5-10min，PBS洗滌2次，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)；3)將細胞消化后鋪至96孔板中，每孔100uL已轉(zhuǎn)染的細胞懸液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育30min后，向每孔加入10μLMTT溶液；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時，用酶標儀測定在450nm處的吸光度，得羅非魚巨噬細胞；4)將B985細胞置于L15培養(yǎng)基+10％胎牛血清+1％雙抗于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；B958細胞大規(guī)模培養(yǎng)至10-15ml后，停止加培養(yǎng)液至培養(yǎng)液完全變黃，得EB病毒，備用；5)收集步驟4)培養(yǎng)液，4℃、4000r/min離心30min：轉(zhuǎn)移上清至另一無菌離心管；4℃、12000r/min離心120min，棄上清，加入5mL新鮮培養(yǎng)液反復(fù)吹打重懸，4℃、3000r/min離心20min，將上清用0.22μm一次性過濾器過濾得到EBV濃縮液，以1mL/管無菌分裝后于-70℃保存；6)羅非魚巨噬細胞生長至60％面積后，用步驟5)EBV濃縮液感染，感染3次，每次間隔2d，每次感染前將細胞置于4℃1.5-3h，向每皿加入1×108個EBV，28℃孵育10h后，換新鮮培養(yǎng)液；7)感染3次后的羅非魚巨噬細胞亞克隆至96孔板，挑取單克隆細胞至24孔板中于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，選取狀態(tài)好的細胞擴大培養(yǎng)至10cm皿并于液氮容器中凍存，得EBV病毒羅非魚巨噬細胞；8)將EBV病毒羅非魚巨噬細胞從液氮容器中取出，立即將細胞凍存管直接浸入37℃水浴中，在1-2分鐘內(nèi)搖動細胞凍存管至凍存的細胞完全融化，再放入水平低速離心機，600rpm/min離心5分鐘后，用75％酒精消毒細胞凍存管后，小心打開蓋子，棄掉凍存液后使用1mL完全培養(yǎng)液重懸細胞，將細胞重懸液接種到細胞培養(yǎng)皿中，28℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24小時后，更換一次10％FBS-L15完全培養(yǎng)液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞匯合度達90％時按每孔2ml接種于24孔細胞培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)；9)將步驟8)細胞用胰酶或EDTA消化，傳代至3-4代后，繼續(xù)傳代培養(yǎng)，每3天進行一次傳代，連續(xù)傳代培養(yǎng)30代，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，得永生化羅非魚巨噬細胞；10)將永生化羅非魚巨噬細胞消化后鋪至96孔板中，每孔100uL細胞懸液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育30min，向每孔加入10μLMTT溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1、3、5、7、9和11天，用酶標儀測定在450nm處的吸光度，得永生化羅非魚巨噬細胞系。優(yōu)選的，所述步驟4)的雙抗由100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素組成。優(yōu)選的，所述的步驟4)停止加培養(yǎng)液時間為5-8天。優(yōu)選的，將以上建立的永生化羅非魚巨噬細胞系經(jīng)過端粒酶活性、核型和特異性基因檢測。優(yōu)選的，所述的端粒酶活性檢測使用的引物為：Forwardprimer序列:5’-ATTCCTTCGGACAGCGTAA-3’Reversedprimer序列:5’-GAGGACTTACTCTTACACTTCGCTCACC-3’。一種如以上所述的永生化羅非魚巨噬細胞系的應(yīng)用。本發(fā)明有益效果為：通過本發(fā)明方法建立的永生化羅非魚巨噬細胞系可連續(xù)傳代，迄今已傳代30代，且細胞能維持良好生長狀態(tài)，可以對其進行冷凍保存，能提供大量的來源細胞。所建立的巨噬細胞系為開展病原特性及其致病機理研究、疫苗研制以及功能基因研究等相關(guān)領(lǐng)域的理論與應(yīng)用研究提供了便利。附圖說明圖1是腹腔羅非魚巨噬細胞分離培養(yǎng)的顯微鏡照片結(jié)果，其中A為培養(yǎng)24小時分離的腹腔羅非魚巨噬細胞，m和g分別代表巨噬細胞和粒細胞。B、C、D分別代表巨噬細胞培養(yǎng)24、48和72小時的細胞形態(tài)。E和F分別是吉姆薩和瑞氏染色后的巨噬細胞形態(tài)。圖2是羅非魚腹腔巨噬細胞體外培養(yǎng)不同時間的增殖曲線圖。圖3是永生化羅非魚巨噬細胞不同傳代穩(wěn)定性顯微鏡照片，其中P3、P5、P10、P20和P30分別代表第3、5、10、20和30代。圖4和圖5是EBV病毒感染羅非魚腹腔巨噬細胞的PCR結(jié)果，EBV及其LAMP1基因均有陽性擴增。圖6是EBV病毒感染永生化羅非魚腹腔巨噬細胞SB雜交結(jié)果，樣品2和6為陽性，其余為陰性。圖7是EBV病毒感染永生化羅非魚腹腔巨噬細胞NB雜交結(jié)果，樣品2和6為陽性，其余為陰性。圖8是永生化羅非魚巨噬細胞染色體數(shù)目分布圖。圖9是永生化羅非魚巨噬細胞的分子鑒定結(jié)果，其中M:標準分子量；1為陰性對照；2為永生化羅非魚巨噬細胞。具體實施方式以下通過具體實施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進行進一步的說明和描述。1.1羅非魚的飼養(yǎng)挑選體重為(100土5)g健康尼羅羅非魚，于28-30℃水溫條件下在充氣水族箱中飼養(yǎng)，正常喂食7天后，對每尾羅非魚腹腔注射250μL角鯊烯，每隔2天注射相同劑量角鯊烯，連續(xù)注射3次，并于分離細胞前一天停止喂食。1.2腹腔巨噬細胞的分離培養(yǎng)及體外增殖實驗在注射角鯊烯后第7天，使用100mg/L的MS-222麻醉試驗魚，75％酒精消毒體表。用預(yù)冷的PBS沖洗腹腔，收集沖洗液于45ml離心管中，300g、4℃離心10min。吸去上清，細胞沉淀用HBSS重懸，300g、4℃離心10min洗滌1次。細胞重懸于2mlHBSS，加入9ml滅菌三蒸水作用20s破裂紅細胞，立即加入1ml10×HBSS。300g、4℃離心10min，HBSS洗滌2次，最后用L-15培養(yǎng)基重懸細胞，進行適當稀釋后臺盼藍染色，計算活細胞數(shù)，瑞氏染色觀察細胞狀態(tài)。然后分別用含100IU/ml氨芐青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素、10％FBS的L-15培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度約為1×106個/ml，于12孔板中28℃培養(yǎng)24h后吸去懸浮細胞，加入新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)24、48和72小時后，吸去培養(yǎng)上清，加入瑞氏染色液染色5-10min，PBS洗滌2次，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，如圖1所示，細胞呈多形性，且經(jīng)瑞氏和吉姆薩染色后呈典型的單核-巨噬細胞形態(tài)特征，表明所分離培養(yǎng)的細胞為單核/巨噬細胞。利用的MTT方法對所分離培養(yǎng)的細胞進行體外增殖測試，具體方法為：(1)將細胞消化后鋪至96孔板中，每孔100uL已轉(zhuǎn)染的細胞懸液，約5000細胞。(2)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育30min。(3)向每孔加入10μLMTT溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響O.D值的讀數(shù))。(5)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。(6)用酶標儀測定在450nm處的吸光度。如圖2所示，羅非魚腹腔巨噬細胞體外培養(yǎng)至96小時過程中均呈指數(shù)增殖狀態(tài)，至48小時后呈對數(shù)增長趨勢，隨著時間的推移，其增長速度逐漸放緩。1.3EBV病毒分離及永生化巨噬細胞系的建立1.3.1B958細胞培養(yǎng)L15培養(yǎng)基+10％胎牛血清+1％雙抗(100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素)培養(yǎng)，置于28℃培養(yǎng)箱。B958細胞大規(guī)模培養(yǎng)至10-15ml后，停止加培養(yǎng)液(即饑餓1周左右)至培養(yǎng)液完全變黃，準備抽提EB病毒。1.3.2病毒抽提收集培養(yǎng)液，4℃、4000r/min離心30min：轉(zhuǎn)移上清至另一無菌離心管。4℃、12000r/min離心120min，棄上清，加入5mL新鮮培養(yǎng)液反復(fù)吹打重懸，4℃、3000r/min離心20min，將上清用0.22μm一次性過濾器過濾得到EBV的濃縮液，以1mL/管無菌分裝后于-70℃保存。1.3.3感染羅非魚巨噬細胞羅非魚巨噬細胞生長至60％面積后開始感染。感染3次，每次間隔2d.每次感染前將細胞置于4℃約1.5-3h，向每皿加入1×108個EBV，28℃孵育10h，然后換新鮮培養(yǎng)液。1.3.4羅非魚巨噬細胞亞克隆及擴大培養(yǎng)感染3次后的羅非魚巨噬細胞亞克隆至96孔板，挑取單克隆細胞至24孔板中于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，選取狀態(tài)好的細胞擴大培養(yǎng)至10cm皿并于液氮容器中凍存。1.3.5永生化羅非魚巨噬細胞的培養(yǎng)、傳代穩(wěn)定性試驗及增殖測試血清：胎牛血清培養(yǎng)基：L15(GIBCO)培養(yǎng)條件：10％FBS-L151％雙抗(100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素)28℃1、從液氮容器中取出細胞凍存管后，立即將細胞凍存管直接浸入37℃水浴中，在1-2分鐘內(nèi)搖動細胞凍存管至凍存的細胞完全融化。2、將融化完全的細胞放入水平低速離心機，600rpm/min離心5分鐘。3、用75％酒精消毒細胞凍存管后，小心打開蓋子，棄掉凍存液后使用1mL完全培養(yǎng)液重懸細胞，將細胞重懸液接種到細胞培養(yǎng)皿中，28℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。4、24小時后，更換一次10％FBS-L15完全培養(yǎng)液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5、待細胞匯合度達90％時按每孔2ml接種于24孔細胞培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)。6、細胞用胰酶或EDTA消化，一般1傳3或4即可。7、將永生化羅非魚巨噬細胞按照以上條件培養(yǎng)，每3天進行一次傳代，連續(xù)傳代培養(yǎng)30代，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。將永生化羅非魚巨噬細胞可在體外穩(wěn)定傳代至少30代(每代培養(yǎng)3天)，從中選取永生化巨噬細胞的2和6號樣品進行試驗，非永生化巨噬細胞作為對照。如圖3所示，從第五代開始，永生化2號和6號出現(xiàn)細胞集落，至第30代可見明顯細胞集落，而非永生化巨噬細胞從第5代開始細胞集落消失。8、利用的MTT方法對所獲得的永生化羅非魚巨噬細胞進行體外增殖測試：(1)將細胞消化后鋪至96孔板中，每孔100uL已轉(zhuǎn)染的細胞懸液，約5000細胞。(2)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育30min。(3)向每孔加入10μLMTT溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響O.D值的讀數(shù))。(5)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1、3、5、7、9和11天。(6)用酶標儀測定在450nm處的吸光度。1.4永生化巨噬細胞EBV感染鑒定1.4.1RNA提取將穩(wěn)定傳代(15代)的巨噬細胞收集至EP管中，加入1mLPBS重懸細胞，1000rpm/min，離心5min，收集細胞，棄上清；EP管中加入1mLTrizolReagent(LifeTechnologies)，裂解細胞；按照Trizol提取RNA說明書進行RNA提取。1.4.2反轉(zhuǎn)錄使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMII1stStrandcDNASynthesisKit,TakaRa)對RNA進行反轉(zhuǎn)錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行.按下表向反應(yīng)管中加入各組分：短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。擴增程序為：16℃30min，42℃30min，85℃5min。反應(yīng)結(jié)束后放置-20℃冰箱保存。1.4.3RT-PCR擴增目的條帶以上述反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，進行目的片段的擴增：按下表向反應(yīng)管中加入各組分：短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。擴增程序為：反應(yīng)結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，如圖4所示，EBV感染羅非魚腹腔巨噬細胞成陽性擴增。所用引物名稱及引物序列如下：1.5EBV病毒Lmp1基因整合和表達鑒定1.5.1Southernbloting(SB)1.5.1.1引物設(shè)計根據(jù)基因信息設(shè)計并合成探針引物，具體引物序列如下表所示：1.5.1.2PCR擴增探針1.5.1.2.1核酸提取羅非魚巨噬細胞基因組DNA提取使用Qiagen公司的QIAampDNAminiKit的說明書進行，RNA提取按照Lifetechnologies公司Trizol試劑說明書進行。1.5.1.2.2核酸提取反應(yīng)體系如下表所示：成分體積(μl)10×TaqEnzymebuffer5dNTP(10mM)1Primer-F(10μM)2Primer-R(10μM)2TemplateDNA1TaqEnzyme0.5Rnase-Freewater38.5共50擴增條件：94℃3min預(yù)變性；94℃10S、55℃30S、72℃30S共30個循環(huán)；最后72℃終延伸10min。反應(yīng)完畢后，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增結(jié)果，紫外燈下切取目的片段，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，步驟按回收試劑盒說明書進行。如圖5所示，EBV病毒Lmp1基因呈陽性擴增。1.5.1.2.3SB實驗步驟1.5.1.2.3.1根據(jù)需要尋找合適的酶切位點對DNA進行酶切選擇內(nèi)切酶EcoRI作為酶切位點酶切體系如下：1.5.1.2.3.2酶切后處理37℃酶切過夜后，將酶切產(chǎn)物用0.6倍體積冷凍異丙醇沉淀一小時，離心去上清，溶于40ulTE，0.9％的瓊脂糖凝膠電泳，40v過夜。電泳結(jié)束后，將凝膠依次用如下試劑處理進行堿變性，室溫下輕輕搖動確保溶液覆蓋凝膠0.25MHCl15min蒸餾水搖洗5min；變性液40min蒸餾水搖洗5min；中和液15min。轉(zhuǎn)膜16小時以上。1.5.1.2.3.3雜交NC膜浸入2×SSC中5min，在雜交瓶中加入雜交液。放入42℃雜交爐中，使雜交體系升到42℃。取經(jīng)超聲粉碎的DNA，100℃加熱變性5min，迅速加到雜交瓶中，使其濃度達到100μg/ml。繼續(xù)雜交4hr。倒出預(yù)雜交的雜交液，換入等量新的已升溫至42℃的雜交液，同樣加入變性的DNA。將探針100℃加熱5min，使其變性，迅速加到雜交瓶中。42℃雜交過夜。取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列條件洗膜：2×SSC/0.1％SDS，42℃，10min；1×SSC/0.1％SDS，42℃，10min；0.5×SSC/0.1％SDS，42℃，10min；0.2×SSC/0.1％SDS，56℃，10min；0.1×SSC/0.1％SDS，56℃，10min。在洗膜的過程中，不斷振搖，不斷用放射性檢測儀探測膜上的放射強度。實踐證明，當放射強度指示數(shù)值較環(huán)境背景高1-2倍時終止洗膜。將洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用濾紙吸干膜表面的水份，并用保鮮膜包裹，將膜正面向上，放入暗盒中(加雙側(cè)增感屏)，在暗室的紅光下，每一片都用透明膠帶固定，合上暗盒，置-70℃低溫冰箱中曝光3天時間，從中選取1-6號樣品進行試驗如圖6所示，樣品2和6為陽性，其余為陰性。1.5.2NB實驗方法和步驟1.5.2.1提取RNA將穩(wěn)定傳代(15代)的巨噬細胞收集至EP管中，加入1mLPBS重懸細胞，1000rpm/min，離心5min，收集細胞，棄上清；EP管中加入1mLTrizolReagent(LifeTechnologies)，裂解細胞；按照Trizol提取RNA說明書進行RNA提取。1.5.2.2試劑準備(a)1.2％瓊脂糖甲醛變性膠的配制：(b)上樣前RNA樣品的處理:Samplebuffermix體積:25.5μl10×MOPS5μl37％甲醇8μl去離子甲酰胺12.5μl將Samplebuffermix與RNA樣品等體積混勻，65℃，變性5min，置于冰上5min，加入上樣緩沖液，混勻后即可上樣。1.5.2.3RNA電泳：所用緩沖液為1×MOPS，120V約3h。1.5.2.4轉(zhuǎn)膜：上行毛細管轉(zhuǎn)移法。1.5.2.5染色1.5.2.6探針標記:(Amersham公司隨機引物標記試劑盒，RediprimeTMIIRandomPrimerLabellingSystem)。見說明。探針序列221bp，針對Lamp基因：GAGGGAGTCATCGTGGTGGTGTTCATCACTGTGTCGTTGTCCATGGTAATACATCCAGATTAAAATCGCCAGAAACAGGAGGAGCCAAAGGAGATCAACCAATAGAGTCCACCAGTTTTGTTGTAGATAGAGAGCAATAATGAGCAGGATGAGGTCTAGGAAGAAGGCTAGGAAGAAGGCCAAAAGCTGCCAGATGGTGGCACCAAGTCGCCAGAGCATCTActin探針序列為：aagagaggtatcctgaccctcaaataccccattgagcacggtattgtgaccaactgggatgacatggagaagatctggcatcacaccttctacaatgagctccgtgttgcccctgaggagcaccctgtcgtgctcactgaggctcccctgaatcccaaagccaacagagagaagatgacacagatcatgttcgagacct1.5.2.7雜交雜交緩沖液的配制(a)預(yù)雜交：將雜交緩沖液倒入雜交管中65℃預(yù)熱15min后放入交聯(lián)固定的膜65℃預(yù)雜1～2h；(b)雜交：將標記好的探針放入雜交管中，65℃雜交過夜；(c)洗膜：用洗膜緩沖液2×SSC/0.2％SDS，在65℃/15min條件下洗膜2～3次；(d)壓片：將洗好的膜從雜交管中拿出，轉(zhuǎn)移至兩層塑膜中，檢測雜交信號強弱，將膜放入磷屏中，根據(jù)信號強弱壓數(shù)小時或過夜；(e)檢測雜交信號：掃描磷屏。從中選取1-6號樣品進行試驗如圖7所示，永生化樣品2號和6號為陽性，其余為陰性。1.6TRAP法(Telomeraserepeatamplificationprotocol)檢測端粒酶活性1)細胞培養(yǎng)將永生化的巨噬細胞鋪至六孔板中(以未染毒的細胞作為對照)，待細胞長至密度約80％時收集細胞，離心后用PBS洗細胞一次；2)RNA提取細胞用細胞裂解液裂解，利用TRIZOL進行RNA提取；3)PCR反應(yīng)體系：無菌水將體積補齊至10微升，混合均勻后，30℃反應(yīng)30min，94℃滅活10min；4)RealTime-PCR體系：端粒酶引物：Forwardprimer序列:5’-ATTCCTTCGGACAGCGTAA-3’Reversedprimer序列:5’-GAGGACTTACTCTTACACTTCGCTCACC-3’5)步反應(yīng)體系：混勻以后，94℃10min；94℃30s、60℃90s40個循環(huán)進行RealTime-PCR，60℃90s收集信號。6)端粒酶活性檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的染毒克隆細胞株端粒酶活性均發(fā)生不同程度增加，表明EBV感染導(dǎo)致端粒酶活性增加，永生化細胞成功構(gòu)建。1.7永生化羅非魚巨噬細胞的核型分析1.7.1材料已獲得的永生化羅非魚巨噬細胞1.7.2方法有絲分裂中期染色體制備：無菌條件下取永生化羅非魚巨噬細胞，加入含20％胎牛血清和PHA(phytohemagglutinin，植物血球凝結(jié)素)的培養(yǎng)液，28℃培養(yǎng)4d，加秋水仙素堿至終濃度0.08ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)2h。用75mmol/LKCI低滲處理細胞30min，然后固定液(甲醇：冰醋酸-3：1)漂洗4次，制成染色體中期分裂相的玻片。染色體玻片用Giemsa染色0.5h。然后在顯微鏡下觀察和照相，選取1分散良好染色體清晰的中期分裂相進行計數(shù)，再分別選擇20個染色體形態(tài)最清晰的中期分裂相拍照、放大并剪下每個染色體，然后進行染色體測量，分類及核型分析。1.7.3結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)永生化羅非魚巨噬細胞染色體數(shù)目為44的占58.6％，表明該細胞染色體數(shù)目應(yīng)為44.核型分析后發(fā)現(xiàn)其核型公式如圖8所示。1.8永生化羅非魚巨噬細胞的致癌性評估1).取四株永生化羅非魚巨噬細胞，培養(yǎng)至對數(shù)期；2).將細胞消化后離心收集細胞，PBS洗細胞一次；3).將細胞用100微升PBS重懸后注射裸鼠背部皮下，每株細胞注射5只裸鼠(1*106個細胞)，并設(shè)立空白對照；4).注射后3-4周觀察成瘤情況。結(jié)果表明，對所選擇的6號克隆細胞進行裸鼠致癌性評估后發(fā)現(xiàn)，這株永生化羅非魚巨噬細胞不具有致癌性。1.9永生化羅非魚巨噬細胞的分子鑒定RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、RT-PCR、電泳等試驗方法見1.4部分。所使用的羅非魚18S特異性引物如下：引物名稱序列(5’--3’)Tila18S-1FCGCCGAGAAGACGATCAAACTila18S-1RTTCATTGATGCACGAGCCGAProduct624bp如圖9所示，用羅非魚特異性18S擴增引物進行PCR擴增后獲得特異性目的條帶，表明所鑒定的細胞來自于羅非魚機體。將此PCR產(chǎn)物進行測序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，結(jié)果表明所獲得的序列為羅非魚18S序列，表明所獲得的永生化細胞是羅非魚據(jù)巨噬細胞細胞。18S測序結(jié)果：CAAGTANGTACAGTCGTACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGGCTACACCGAGCGGCCCGCCTGCGGCGCACCCGGTGTTCTCCCTCTTTGCCGCCGAGGGTCTCCCGCCACCGTCACCGGTGCGGGTCTCCCGAGGTTGTCGGCTCGCGCGTCCCCCACCGGAGCTCGAGCCTTAGTCTGGGCCTGGTCACCGGCCGGACGACCCGACGGCCCCGCCCCGCCTCTACGCCAAAGCGAGCCCGCTGCCCCGACCGGCTCCTCCGAGGGCCGACGGAGGAGAGTCGGGACTGCGGCTCGTTGGAGGCGGGCGCCGGGGTCCCCGTCCGGCAACCACCGGTCCCGGCCCGCCACGAGAACCTCAACCGAAAGCGCGGGCTGGCGGTTTCGCCCTGACCGCTGCCCGCGCGCCTCCGGGTACCCAACTCTCCTCCCTCCTGCGGAGGGAGCACGGGGGGTTCAATGTCTCCTCTCCCCTGCCCCGGCGGAGGAAGGAGCGCCCGGGGGTTTTTTCCCTTCCTTTAAACCCCTTATCCCGTCTACGAATGTGGCAACCCACGGTAAAACAAAAAAACAATACGACTCTTAGCGGTGGATCACTCGGCTGGGG。當前第1頁1 2 3