發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于個(gè)體預(yù)防性地和/或治療性地免疫屈曲病毒的疫苗和方法。

發(fā)明背景

本申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/042,661號(hào)的優(yōu)先權(quán)，該美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)以引用的方式并入本文。

免疫療法指調(diào)節(jié)人體免疫應(yīng)答以達(dá)到理想的治療效果。免疫治療劑指當(dāng)施用于個(gè)體時(shí)調(diào)節(jié)個(gè)體免疫系統(tǒng)的那些組合物，所述調(diào)節(jié)足以最終減輕與不期望的免疫應(yīng)答相關(guān)的癥狀或足以最終通過(guò)增加期望的免疫應(yīng)答而緩解癥狀。在一些情況下，免疫療法是接種方案的一部分，其中給個(gè)體施用疫苗使個(gè)體暴露于免疫原(在此類情況下個(gè)體對(duì)該免疫原產(chǎn)生免疫應(yīng)答)，免疫治療劑增加免疫應(yīng)答和/或選擇性增強(qiáng)預(yù)期治療或預(yù)防特定病癥、感染或疾病的免疫應(yīng)答的一部分(例如細(xì)胞免疫部分或體液免疫部分)。

可通過(guò)遞送調(diào)節(jié)人體免疫應(yīng)答而誘發(fā)改進(jìn)的免疫應(yīng)答的制劑來(lái)完善疫苗方案。在一些接種方案中，其中給個(gè)體施用疫苗使個(gè)體暴露于免疫原(個(gè)體對(duì)該免疫原產(chǎn)生免疫應(yīng)答)，提供增加免疫應(yīng)答和/或選擇性增強(qiáng)預(yù)期治療或預(yù)防特定病癥、感染或疾病的免疫應(yīng)答的一部分(例如細(xì)胞免疫部分或體液免疫部分)的制劑。

疫苗可用于使個(gè)體免疫靶抗原，所述靶抗原為例如變應(yīng)原、病原體抗原或與人類疾病有關(guān)的細(xì)胞相關(guān)的抗原。與人類疾病有關(guān)的細(xì)胞相關(guān)的抗原包括癌癥相關(guān)腫瘤抗原和與自身免疫疾病有關(guān)的細(xì)胞相關(guān)的抗原。

在設(shè)計(jì)此類疫苗時(shí)，已發(fā)現(xiàn)在受接種個(gè)體的細(xì)胞中產(chǎn)生靶抗原的疫苗有效誘發(fā)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞免疫部分。特別地，減毒活疫苗、利用無(wú)毒載體的重組疫苗以及dna疫苗各自使得在受接種個(gè)體的細(xì)胞中產(chǎn)生抗原，從而形成免疫系統(tǒng)細(xì)胞免疫部分的誘發(fā)。另一方面，盡管死疫苗或滅活疫苗以及僅包含蛋白的亞單位疫苗確實(shí)誘發(fā)有效的體液應(yīng)答，但它們不誘發(fā)良好的細(xì)胞免疫應(yīng)答。

細(xì)胞免疫應(yīng)答通常是對(duì)病原體感染提供保護(hù)和對(duì)治療病原體感染、癌癥或自身免疫疾病提供有效免疫介導(dǎo)療法所必要的。因此，通常優(yōu)選的是在受接種個(gè)體的細(xì)胞中產(chǎn)生靶抗原的疫苗，例如減毒活疫苗、利用無(wú)毒載體的重組疫苗和dna疫苗。

屈曲病毒(chikv)是一種熱帶非洲和亞洲本土的α病毒，該病毒在那里通過(guò)感染的蚊子(通常是伊蚊屬[1])叮咬而傳播至人類。屈曲熱是由chikv引起的疾病，在1952-1953期間首次在東非以流行病形式被發(fā)現(xiàn)[2]。chikv對(duì)人類的感染可以引起以發(fā)熱、頭痛、皮疹、不適、惡心、嘔吐、肌痛、嚴(yán)重關(guān)節(jié)痛和偶發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)(例如急性四肢無(wú)力)為表征的綜合征。它還伴有致命的出血性病癥。其他癥狀包括肌肉疼痛和眼窩后疼痛。屈曲疾病很少致命，但是伴有顯著的發(fā)病率。屈曲病具有大約1–2周的潛伏期。認(rèn)為詞語(yǔ)“屈曲”源于當(dāng)?shù)胤窖詫?duì)受伴隨該疾病的嚴(yán)重關(guān)節(jié)疼痛折磨的患者扭曲姿勢(shì)的描述[1-3]。

因?yàn)榍哂锌僧a(chǎn)生突然令人衰弱的疾病的流行潛能，因此對(duì)發(fā)展中國(guó)家來(lái)說(shuō)屈曲是潛在的威脅，并且基于其持續(xù)蔓延以及由于在新興的流行區(qū)沖突地帶的士兵部署而造成的相當(dāng)多的軍事威脅，屈曲對(duì)發(fā)達(dá)國(guó)家也是潛在的威脅。chikv感染對(duì)經(jīng)濟(jì)有顯著影響，因?yàn)樵摳腥镜陌Y狀使雇員無(wú)能力工作，導(dǎo)致流行病區(qū)停工，影響當(dāng)?shù)厣虡I(yè)。這種經(jīng)濟(jì)影響對(duì)數(shù)周或數(shù)月不能工作的個(gè)體家庭成員是最大的。由于使人衰弱的感染后遺癥，特定抗病毒治療方法的缺乏和預(yù)防該疾病的任何目前可用疫苗的缺乏是管理或控制新chikv爆發(fā)的主要障礙。

chikv通過(guò)感染的蚊子叮咬而傳播。蚊子在吸食chikv感染個(gè)體時(shí)被感染。猴子和可能的其他野生動(dòng)物也可能被感染，但是它們作為chikv儲(chǔ)庫(kù)的作用還沒(méi)有文獻(xiàn)記載。感染的蚊子則可以在它們叮咬時(shí)將病毒傳播給其他人。埃及伊蚊(黃熱蚊)在家用容器中繁殖并且在白天侵犯性地叮咬人類，是人類chikv的主要載體。白紋伊蚊(亞洲虎蚊)也可以在亞洲人類傳播中起作用，在非洲已經(jīng)發(fā)現(xiàn)各種林居蚊類被病毒感染[11-17]。因?yàn)閏hik熱流行病通過(guò)人類-蚊子-人類傳播來(lái)維持，流行病周期類似于登革熱和城市黃熱病的流行病周期。最近已經(jīng)報(bào)道了印度洋和印度的幾個(gè)島嶼的chik熱的大規(guī)模爆發(fā)。

自2004年末以來(lái)，屈曲病毒在世界各地(主要在印度洋島嶼)以大規(guī)模爆發(fā)形式再現(xiàn)。在2006年初，在冬季較低傳播期之后并隨著南半球夏季的到來(lái)，留尼旺島遭受了爆炸性的爆發(fā)。報(bào)道估計(jì)266,000居民(共有770,000人口)感染chikv，并且248份死亡證明書(shū)將chikv作為可能的死亡病因[10,12]。文獻(xiàn)記載了孕婦宮內(nèi)感染和垂直傳播的證據(jù)[12,13,17]。序列分析揭示了地理上集群的病毒譜系的存在?；诓糠謊1序列的種系發(fā)育分析揭示了三個(gè)不同的chikv種群的存在：一個(gè)是西非分離株，另一個(gè)包括亞洲分離株，以及一個(gè)再分為東非、中非和南非分離株[15,17]。

2006年，在從已知發(fā)病區(qū)返回歐洲、加拿大、加勒比(馬丁尼克島)和南美(法屬圭亞那)的旅行者中也已經(jīng)報(bào)道了chik熱病例[5-9]。2005-2006期間，在疾病控制中心(美國(guó))從chik熱流行病或地方病的已知區(qū)域到達(dá)美國(guó)的旅行者中根據(jù)血清學(xué)和病毒學(xué)診斷出了12例chik熱[10]的病例。

這些感染已經(jīng)引起公共健康危機(jī)并引起了全世界研究者的關(guān)注。重要的是，大部分屈曲病毒感染在數(shù)周或數(shù)月內(nèi)完全消退。然而，已經(jīng)有文獻(xiàn)記載了chikv誘發(fā)的持續(xù)數(shù)年的關(guān)節(jié)痛病例，并進(jìn)而發(fā)展成為慢性關(guān)節(jié)問(wèn)題。感染在較長(zhǎng)時(shí)間之后消退的事實(shí)證明，免疫系統(tǒng)最終可以集合起來(lái)控制該感染。而且，這種清理表型證明在t細(xì)胞應(yīng)答清理中的作用。早期研究屈曲疫苗，諸如福爾馬林滅活疫苗、吐溫醚滅活病毒疫苗和減毒活疫苗的嘗試取得了一定成功，然而，這些嘗試由于各種原因而沒(méi)有繼續(xù)下去[3]。而且，據(jù)報(bào)道所有這些疫苗僅產(chǎn)生血清學(xué)應(yīng)答，而沒(méi)有誘發(fā)有用的細(xì)胞免疫。

最近在印度洋和留尼旺島的流行病頻發(fā)表明一種新的載體可能攜帶病毒，因?yàn)樵谀抢餂](méi)有發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊。事實(shí)上，相關(guān)的亞洲虎蚊(白紋伊蚊)可能是罪魁禍?zhǔn)?，已?jīng)在世界衛(wèi)生界引起對(duì)chik病毒大范圍流行可能的擔(dān)憂。

因此，應(yīng)該采取步驟來(lái)研究控制chikv的方法。不幸的是，目前沒(méi)有針對(duì)屈曲病毒的特定的治療方法，目前也沒(méi)有可用的疫苗。最近的研究表明，被膜e1-a226v突變直接導(dǎo)致白紋伊蚊chikv感染性顯著增加，并且進(jìn)一步證實(shí)單個(gè)氨基酸取代可以影響載體特異性。該發(fā)現(xiàn)提供了該突變病毒如何在缺乏典型昆蟲(chóng)載體的區(qū)域引起流行病的合理解釋[18]。還沒(méi)有研究出針對(duì)屈曲熱的特定疫苗或特定抗病毒治療方法。減毒活疫苗試驗(yàn)曾在2000年進(jìn)行，但是該項(xiàng)目的資金來(lái)源被中斷，并且目前沒(méi)有可用的疫苗。但是，有文獻(xiàn)詳細(xì)記載了與該先前疫苗相關(guān)的幾個(gè)不良事件，因此，必須開(kāi)發(fā)新的疫苗策略[3,5]。

2005-2007屈曲熱爆發(fā)的巨大規(guī)模凸顯出對(duì)安全有效的chikv疫苗的需求[6]。人們?nèi)匀恍枰煞乐箓€(gè)體受chikv感染的疫苗。人們?nèi)匀恍枰行е委熁加衏hikv感染的個(gè)體的治療方法。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及一種包含分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子編碼chikv蛋白e1的共有序列或其免疫原性共有片段。

本發(fā)明涉及一種包含分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子編碼chikv蛋白e2的共有序列或其免疫原性片段。

本發(fā)明涉及一種包含分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子編碼chikv蛋白衣殼的共有序列或其免疫原性共有片段。

本發(fā)明涉及一種包含分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子編碼嵌合基因，所述嵌合基因包含chikv蛋白e1、chikv蛋白e2和chikv蛋白e3的共有序列或它們的同源序列或它們的免疫原性共有片段或它們的免疫原性共有片段的同源序列，這些序列編碼誘發(fā)對(duì)chikv蛋白e1、chikv蛋白e2和chikv蛋白e3各自的免疫應(yīng)答的免疫原性氨基酸序列。

本發(fā)明涉及包含分離的核酸分子的可注射藥物組合物，所述分離的核酸分子編碼chikv蛋白e1的共有序列或其免疫原性共有片段。

本發(fā)明涉及包含分離的核酸分子的可注射藥物組合物，所述分離的核酸分子編碼chikv蛋白e2的共有序列或其免疫原性共有片段。

本發(fā)明涉及包含分離的核酸分子的可注射藥物組合物，所述分離的核酸分子編碼chikv蛋白衣殼的共有序列或其免疫原性共有片段。

本發(fā)明涉及包含分離的核酸分子的可注射藥物組合物，所述分離的核酸分子編碼嵌合基因，所述嵌合基因包含chikv蛋白e1、chikv蛋白e2和chikv蛋白e3的共有序列或它們的同源序列或它們的免疫原性共有片段或它們的免疫原性共有片段的同源序列，這些序列編碼誘發(fā)對(duì)chikv蛋白e1、chikv蛋白e2和chikv蛋白e3各自的免疫應(yīng)答的免疫原性氨基酸序列。

本發(fā)明還涉及誘發(fā)個(gè)體中對(duì)chikv免疫應(yīng)答的方法，該方法包括為所述個(gè)體施用包含分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子編碼chikv蛋白e1的共有序列或其免疫原性共有片段。

本發(fā)明還涉及誘發(fā)個(gè)體中對(duì)chikv免疫應(yīng)答的方法，其包括為所述個(gè)體施用包含分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子編碼chikv蛋白e2的共有序列或其免疫原性共有片段。

本發(fā)明還涉及誘發(fā)個(gè)體中對(duì)chikv免疫應(yīng)答的方法，其包括為所述個(gè)體施用包含分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子編碼chikv蛋白衣殼的共有序列或其免疫原性共有片段。

本發(fā)明還涉及誘發(fā)個(gè)體中對(duì)chikv免疫應(yīng)答的方法，其包括為所述個(gè)體施用包含分離的核酸分子的組合物，所述分離的核酸分子編碼chikv蛋白e1、chikv蛋白e2和chikv蛋白e3的共有序列或它們的同源序列或它們的免疫原性共有片段或它們的免疫原性共有片段的同源序列，這些序列編碼誘發(fā)對(duì)chikv蛋白e1、chikv蛋白e2和chikv蛋白e3各自的免疫應(yīng)答的免疫原性氨基酸序列。

本發(fā)明還涉及重組疫苗，所述重組疫苗包含編碼chikv蛋白衣殼、chikv蛋白e1、chikv蛋白e2的共有序列或它們的免疫原性共有片段的核苷酸序列，或者編碼chikv蛋白e1、chikv蛋白e2和chikv蛋白e3的共有序列或它們的同源序列或它們的免疫原性共有片段或它們的免疫原性共有片段的同源序列的分離的核酸分子，所述序列編碼誘發(fā)對(duì)chikv蛋白e1、chikv蛋白e2和chikv蛋白e3各自的免疫應(yīng)答的免疫原性氨基酸序列，并且本發(fā)明還涉及誘發(fā)個(gè)體中對(duì)chikv的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向個(gè)體施用所述重組疫苗。

附圖簡(jiǎn)述

圖1:(a)將ige–前導(dǎo)chikv融合基因克隆到pvax1載體中的策略示意圖。(b)瓊脂糖凝膠照片，顯示用kpn1和not1雙酶切反應(yīng)所標(biāo)示的chikv質(zhì)粒(被膜e1、e2和衣殼)的線性特異性條帶(泳道4)，所述雙酶切反應(yīng)分別產(chǎn)生1403bp、1355bp和869bp的大小。

圖2:chikv構(gòu)建體的表征。(a)顯示合成構(gòu)建體的s³⁵標(biāo)記的體外轉(zhuǎn)譯。抗原chikv-e1、chikv-e2和chikv-衣殼被轉(zhuǎn)譯并分別使用特異性e1、e2和衣殼抗體免疫沉淀并經(jīng)12％sds凝膠電泳，然后進(jìn)行放射顯影分析?？乖娪驹谄漕A(yù)測(cè)的分子量下進(jìn)行，證實(shí)了表達(dá)。(b)bhk-21細(xì)胞中chikv-e1和chikv-衣殼構(gòu)建體的蛋白質(zhì)印跡分析(westernblotanalysis)。轉(zhuǎn)染后兩天，制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞溶胞產(chǎn)物并且在小鼠中培養(yǎng)的多克隆chikv-e1抗血清進(jìn)行的免疫印跡顯示52kdae1蛋白和36kda衣殼蛋白的表達(dá)。

圖3:抗體elisa。(a)、(b)和(c)c57bl/6小鼠如所示用25μgpvax1載體或chikv質(zhì)粒免疫兩次，每次間隔2周，1周后處死。收集血清并對(duì)chikv-e1、chikv-e2或chikv-衣殼的總igg制備量進(jìn)行分析。血清在用2μg/ml各chikv肽涂布的96孔板上在37℃下培養(yǎng)1h，并使用抗小鼠igg-hrp檢測(cè)抗體。值代表兩個(gè)復(fù)孔的平均值(±s.d.)。

圖4:通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(elispot)測(cè)量的干擾素-γ對(duì)被膜e1的應(yīng)答。c57bl/6小鼠用25μgpvax1載體或pchikv-e1免疫兩次，每次間隔2周，1周后處死。(a)收獲脾細(xì)胞并在r10(陰性對(duì)照)或10μg/ml四個(gè)肽庫(kù)之一存在下培養(yǎng)過(guò)夜，所述肽庫(kù)由跨e1蛋白長(zhǎng)度的9個(gè)氨基酸重疊的15肽構(gòu)成。對(duì)chikv-e1的應(yīng)答顯示為堆疊組平均應(yīng)答。(b)收獲脾細(xì)胞并在r10(陰性對(duì)照)或10μg/ml十八個(gè)肽庫(kù)之一存在下培養(yǎng)過(guò)夜，所述肽庫(kù)由跨基質(zhì)e1蛋白長(zhǎng)度的9個(gè)氨基酸重疊的15肽構(gòu)成。斑點(diǎn)形成單位(sfu)通過(guò)自動(dòng)化elispot讀取分析儀定量，將原始值標(biāo)準(zhǔn)化為sfu/百萬(wàn)脾細(xì)胞。值代表三個(gè)復(fù)孔的平均值。

圖5:通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(elispot)測(cè)量的干擾素-γ對(duì)chikv被膜e2的應(yīng)答。c57bl/6小鼠用25μgpvax1載體或pchikv-e2免疫兩次，每次間隔2周，1周后處死。(a)收獲脾細(xì)胞并在r10(陰性對(duì)照)或10μg/ml四個(gè)肽庫(kù)之一存在下培養(yǎng)過(guò)夜，所述肽庫(kù)由跨e2蛋白長(zhǎng)度的9個(gè)氨基酸重疊的15肽構(gòu)成。對(duì)chikv-e2的應(yīng)答顯示為堆疊組平均應(yīng)答。(b)收獲脾細(xì)胞并在r10(陰性對(duì)照)或10μg/ml十八個(gè)肽庫(kù)之一存在下培養(yǎng)過(guò)夜，所述肽庫(kù)由跨基質(zhì)e2蛋白長(zhǎng)度的9個(gè)氨基酸重疊的15肽構(gòu)成。斑點(diǎn)形成單位(sfu)通過(guò)自動(dòng)化elispot讀取分析儀定量，將原始值標(biāo)準(zhǔn)化為sfu/百萬(wàn)脾細(xì)胞。值代表三個(gè)復(fù)孔的平均值。

圖6:通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(elispot)測(cè)量的干擾素-γ對(duì)chikv-衣殼的應(yīng)答。c57bl/6小鼠用25μgpvax1載體或pchikv-衣殼免疫兩次，每次間隔2周，1周后處死。(a)收獲脾細(xì)胞并在r10(陰性對(duì)照)或10μg/ml四個(gè)肽庫(kù)之一存在下培養(yǎng)過(guò)夜，所述肽庫(kù)由跨衣殼蛋白長(zhǎng)度的9個(gè)氨基酸重疊的15肽構(gòu)成。對(duì)chikv-衣殼的應(yīng)答顯示為堆疊組平均應(yīng)答。(b)收獲脾細(xì)胞并在r10(陰性對(duì)照)或10μg/ml十八個(gè)肽庫(kù)之一存在下培養(yǎng)過(guò)夜，所述肽庫(kù)由跨基質(zhì)衣殼蛋白長(zhǎng)度的9個(gè)氨基酸重疊的15肽構(gòu)成。斑點(diǎn)形成單位(sfu)通過(guò)自動(dòng)化elispot讀取分析儀定量，將原始值標(biāo)準(zhǔn)化為sfu/百萬(wàn)脾細(xì)胞。值代表三個(gè)復(fù)孔的平均值。

圖7是顯示患者和健康個(gè)體(首次實(shí)驗(yàn)的)血清的屈曲病毒的中和抗體滴度的圖，所述滴度使用實(shí)施例2所述分析方法測(cè)量。

優(yōu)選的具體實(shí)施方案

如本文所使用，“免疫原性共有片段”意指chikv共有蛋白的片段，該chikv共有蛋白的片段包括足以對(duì)兩種或多種chikv菌株提供交叉防護(hù)的共有序列，所述交叉防護(hù)在使用相應(yīng)的天然序列時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)。片段長(zhǎng)度一般是10個(gè)或更多個(gè)氨基酸。一些優(yōu)選的chikve1長(zhǎng)度是至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少105、至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至少145、至少150、至少155、至少160、至少165、至少170、至少175、至少180、至少185、至少190、至少195、至少200、至少205、至少210、至少215、至少220、至少225、至少230、至少235、至少240、至少245、至少250、至少255、至少260、至少265、至少270、至少275、至少280、至少285、至少290、至少295、至少300、至少305、至少310、至少315、至少320、至少325、至少330、至少335、至少340、至少345、至少350、至少355、至少360、至少365、至少370、至少375、至少380、至少385、至少390、至少395、至少400、至少405、至少410、至少415、至少420、至少425或至少430。一些優(yōu)選的chikve1長(zhǎng)度是15或更小、20或更小、25或更小、30或更小、35或更小、40或更小、45或更小、50或更小、55或更小、60或更小、65或更小、70或更小、75或更小、80或更小、85或更小、90或更小、95或更小、100或更小、105或更小、110或更小、115或更小、120或更小、125或更小、130或更小、135或更小、140或更小、145或更小、150或更小、155或更小、160或更小、165或更小、170或更小、175或更小、180或更小、185或更小、190或更小、195或更小、200或更小、205或更小、210或更小、215或更小、220或更小、225或更小、230或更小、235或更小、240或更小、245或更小、250或更小、255或更小、260或更小、265或更小、270或更小、275或更小、280或更小、285或更小、290或更小、295或更小、300或更小、305或更小、310或更小、315或更小、320或更小、325或更小、330或更小、335或更小、340或更小、345或更小、350或更小、355或更小、360或更小、365或更小、370或更小、375或更小、380或更小、385或更小、390或更小、395或更小、400或更小、415或更小、420或更小、425或更小、430或更小、或者435或更小。一些優(yōu)選的chikve2長(zhǎng)度是至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少105、至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至少145、至少150、至少155、至少160、至少165、至少170、至少175、至少180、至少185、至少190、至少195、至少200、至少205、至少210、至少215、至少220、至少225、至少230、至少235、至少240、至少245、至少250、至少255、至少260、至少265、至少270、至少275、至少280、至少285、至少290、至少295、至少300、至少305、至少310、至少315、至少320、至少325、至少330、至少335、至少340、至少345、至少350、至少355、至少360、至少365、至少370、至少375、至少380、至少385、至少390、至少395、至少400、至少405、至少410、至少415或至少420。一些優(yōu)選的chikve2長(zhǎng)度是15或更小、20或更小、25或更小、30或更小、35或更小、40或更小、45或更小、50或更小、55或更小、60或更小、65或更小、70或更小、75或更小、80或更小、85或更小、90或更小、95或更小、100或更小、105或更小、110或更小、115或更小、120或更小、125或更小、130或更小、135或更小、140或更小、145或更小、150或更小、155或更小、160或更小、165或更小、170或更小、175或更小、180或更小、185或更小、190或更小、195或更小、200或更小、205或更小、210或更小、215或更小、220或更小、225或更小、230或更小、235或更小、240或更小、245或更小、250或更小、255或更小、260或更小、265或更小、270或更小、275或更小、280或更小、285或更小、290或更小、295或更小、300或更小、305或更小、310或更小、315或更小、320或更小、325或更小、330或更小、335或更小、340或更小、345或更小、350或更小、355或更小、360或更小、365或更小、370或更小、375或更小、380或更小、385或更小、390或更小、395或更小、400或更小、415或更小、422或更小。一些優(yōu)選的chikv衣殼長(zhǎng)度是至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少105、至少110、至少115、至少120、至少125、至少130、至少135、至少140、至少145、至少150、至少155、至少160、至少165、至少170、至少175、至少180、至少185、至少190、至少195、至少200、至少205、至少210、至少215、至少220、至少225、至少230、至少235、至少240、至少245、至少250或至少255。一些優(yōu)選的chikv衣殼長(zhǎng)度是15或更小、20或更小、25或更小、30或更小、35或更小、40或更小、45或更小、50或更小、55或更小、60或更小、65或更小、70或更小、75或更小、80或更小、85或更小、90或更小、95或更小、100或更小、105或更小、110或更小、115或更小、120或更小、125或更小、130或更小、135或更小、140或更小、145或更小、150或更小、155或更小、160或更小、165或更小、170或更小、175或更小、180或更小、185或更小、190或更小、195或更小、200或更小、205或更小、210或更小、215或更小、220或更小、225或更小、230或更小、235或更小、240或更小、245或更小、250或更小、255或更小、或者260或更小。如本段所使用，對(duì)優(yōu)選片段大小的提及旨在指至少和小于之間范圍的所有排列組合，例如范圍可以是以“至少”大小所列的任何數(shù)值到以“小于t”大小所列的任何數(shù)值，以提供一系列大小，例如20-400、20-30、40-100，等等。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“基因構(gòu)建體”指包含編碼靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列的dna或rna分子。編碼序列包括可操作連接于調(diào)控元件的起始信號(hào)和終止信號(hào)，所述調(diào)控元件包括能夠指導(dǎo)被施用核酸分子的個(gè)體細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化信號(hào)。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“可表達(dá)形式”指含有可操作連接于編碼靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白的編碼序列的必要調(diào)控元件的基因構(gòu)建體，使得當(dāng)存在于個(gè)體細(xì)胞中時(shí)，所述編碼序列被表達(dá)。

本文使用的短語(yǔ)“嚴(yán)格雜交條件”或“嚴(yán)格條件”指核酸分子與另一核酸分子雜交但不與其他序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，并且在不同環(huán)境下有所不同。較長(zhǎng)序列在較高溫度下特異性雜交。一般而言，嚴(yán)格條件被選擇為在確定的離子強(qiáng)度和ph下比特定序列的熱力學(xué)熔點(diǎn)(tm)低約5℃。tm是平衡時(shí)與靶序列互補(bǔ)的探針的50％與靶序列雜交的溫度(在確定的離子強(qiáng)度、ph和核酸濃度下)。由于靶序列一般是過(guò)量存在的，所以在tm下，平衡時(shí)探針的50％被占據(jù)。通常，嚴(yán)格條件是下述條件：即，其中在ph7.0至8.3下，鹽濃度小于約1.0m鈉離子、通常約0.01至1.0m鈉離子(或其他鹽)，并且溫度對(duì)于短的探針、引物或寡核苷酸(例如10至50個(gè)核苷酸)而言是至少約30℃且對(duì)于較長(zhǎng)探針、引物或寡核苷酸而言是至少約60℃。嚴(yán)格條件還可以通過(guò)添加去穩(wěn)定劑(例如甲酰胺)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

本文使用的“同源”指兩個(gè)核酸序列之間或兩個(gè)氨基酸序列之間的序列同源性。足夠同源以使得免疫原性功能的兩個(gè)核酸序列或兩個(gè)氨基酸序列是“同源的”。核苷酸和氨基酸的序列同源性可以使用fasta、blast和空位blast(altschul等,nuc.acidsres.,1997,25,3389,該文獻(xiàn)的全文以引用的方式并入本文)和paup*4.0b10軟件(d.l.swofford,sinauerassociates,massachusetts)來(lái)確定?！跋嗨瓢俜直取庇胮aup*4.0b10軟件(d.l.swofford,sinauerassociates,massachusetts)來(lái)計(jì)算。共有序列的平均相似性與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中所有序列進(jìn)行對(duì)比計(jì)算。簡(jiǎn)而言之，代表基本局部比對(duì)檢索工具(basiclocalalignmentsearchtool)的blast算法適合確定序列相似性(altschul等,j.mol.biol.,1990,215,403-410,該文獻(xiàn)的全文以引用的方式并入本文)。進(jìn)行blast分析的軟件可通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開(kāi)獲得。該算法包括首先通過(guò)確定查詢序列中的長(zhǎng)度w的短字來(lái)確定高得分序列對(duì)(hsp)，該查詢序列與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字比對(duì)時(shí)匹配或滿足某一正值閾值分?jǐn)?shù)t。t被稱為相鄰字分?jǐn)?shù)閾值(altschul等,同上)。這些初始相鄰字的匹配用作啟動(dòng)尋找含有它們的hsp的檢索的種子。字匹配沿每個(gè)序列兩個(gè)方向延伸至盡可能使累積比對(duì)分?jǐn)?shù)可以增加。下述情況下每個(gè)方向的字匹配延伸停止：1)累積比對(duì)分?jǐn)?shù)從其最大實(shí)現(xiàn)值減少數(shù)量x；2)由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)得分殘基比對(duì)的累積，累積分?jǐn)?shù)到達(dá)零或以下；或3)到達(dá)任一序列的末端。blast算法參數(shù)w、t和x決定比對(duì)的靈敏度和速度。blast程序使用下述作為默認(rèn)值：字長(zhǎng)(w)為11，blosum62得分矩陣(參見(jiàn)henikoff等,proc.natl.acad.sci.usa,1992,89,10915-10919,該文獻(xiàn)的全文以引用的方式并入本文)比對(duì)(b)為50，期望值(e)為10，m＝5，n＝4，和雙鏈對(duì)比。blast算法(karlin等,proc.natl.acad.sci.usa,1993,90,5873-5787,該文獻(xiàn)的全文以引用的方式并入本文)和空位blast進(jìn)行兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)分析。blast算法提供的相似性的一個(gè)量度是最小總和概率(p(n))，其指示兩個(gè)核苷酸序列之間偶然發(fā)生匹配的概率。例如，如果測(cè)試核酸與其他核酸對(duì)比中的最小總和概率小于約1、優(yōu)選小于約0.1、更優(yōu)選小于約0.01且最優(yōu)選小于約0.001，則認(rèn)為核酸與另一核酸相似。

在一些實(shí)施方案中，提供了可以用于免疫個(gè)體的chikv的dna疫苗。該疫苗包括體內(nèi)體液免疫性和細(xì)胞免疫性兩者。

根據(jù)一些實(shí)施方案，為了開(kāi)發(fā)有能力誘發(fā)對(duì)屈曲病毒(chikv)的交叉反應(yīng)性免疫應(yīng)答的免疫原，我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)chikv病毒被膜e1、e2和核心蛋白衣殼的共有構(gòu)建體。對(duì)于這些構(gòu)建體，從1952年至2006年分離的導(dǎo)致人類感染和死亡的屈曲病毒中選擇21個(gè)序列。所選擇的每個(gè)基因的dna序列來(lái)自s27菌株(首次分離株)和各個(gè)國(guó)家的菌株(包括留尼旺島爆發(fā)分離株)，以避免抽樣偏差。對(duì)dna序列進(jìn)行比對(duì)，為合成序列選擇各個(gè)位置最常見(jiàn)的核苷酸。推導(dǎo)的氨基酸序列用于指導(dǎo)引入比對(duì)空位，以便它們被引入到保持閱讀框的密碼子之間。共有序列產(chǎn)生之后，ige前導(dǎo)序列被加至n末端以增強(qiáng)表達(dá)和分泌，構(gòu)建體通過(guò)密碼子優(yōu)化并用更強(qiáng)序列(gccgccacc)(圖1a)替換現(xiàn)有kozak序列來(lái)優(yōu)化。為了分析，將多聚組氨酸標(biāo)簽加至e1和衣殼的c末端以證實(shí)表達(dá)。然后在根據(jù)之前對(duì)于分析、表達(dá)和免疫原性研究[21]所述的細(xì)菌和純化環(huán)境下制備這些構(gòu)建體。圖1b示出了編碼被膜e1、e2和衣殼dna的構(gòu)建體的瓊脂糖凝膠電泳。

根據(jù)另一實(shí)施方案，我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)chikv病毒被膜e1、e2和e3各自的嵌合共有構(gòu)建體。對(duì)于這些構(gòu)建體，制備e1、e2和e3各自的共有序列，并將各共有序列彼此連接，優(yōu)選使用編碼蛋白酶切割位點(diǎn)的序列。此外，將ige前導(dǎo)序列加至n末端以增強(qiáng)表達(dá)和分泌。

在優(yōu)選實(shí)施方案中，構(gòu)建體包括與ige前導(dǎo)序列連接的chikv編碼序列。然而，在一些實(shí)施方案中，chikv編碼序列不與ige前導(dǎo)序列連接，但是可任選地連接不同的前導(dǎo)序列。

seqidno:1指編碼與ige前導(dǎo)序列連接的chikv-e1共有蛋白的核苷酸序列。

seqidno:2指編碼與ige前導(dǎo)序列連接的chikv-e2共有蛋白的核苷酸序列。

seqidno:3指編碼與ige前導(dǎo)序列連接的chikv-衣殼共有蛋白的核苷酸序列。

seqidno:4指對(duì)應(yīng)于seqidno:1的編碼chikv-e1共有蛋白但是沒(méi)有ige前導(dǎo)序列的編碼序列的核苷酸序列。

seqidno:5指對(duì)應(yīng)于seqidno:2的編碼chikv-e2共有蛋白但是沒(méi)有ige前導(dǎo)序列的編碼序列的核苷酸序列。

seqidno:6指對(duì)應(yīng)于seqidno:13的編碼chikv-衣殼共有蛋白但是沒(méi)有ige前導(dǎo)序列的編碼序列的核苷酸序列。

seqidno:7指seqidno:1編碼的氨基酸序列，是帶有ige前導(dǎo)序列的chikv-e1共有蛋白。

seqidno:8指seqidno:2編碼的氨基酸序列，是帶有ige前導(dǎo)序列的chikv-e2共有蛋白。

seqidno:9指seqidno:3編碼的氨基酸序列，是帶有ige前導(dǎo)序列的chikv-衣殼共有蛋白。

seqidno:10指seqidno:4編碼的氨基酸序列，是沒(méi)有ige前導(dǎo)序列的chikv-e1共有蛋白。

seqidno:11指seqidno:5編碼的氨基酸序列，是沒(méi)有ige前導(dǎo)序列的chikv-e2共有蛋白。

seqidno:12指seqidno:6編碼的氨基酸序列，是沒(méi)有ige前導(dǎo)序列的chikv-衣殼共有蛋白。

seqidno:13指編碼共有env的核苷酸序列，所述共有env是kozak序列-ige前導(dǎo)序列-chikv-e3編碼序列-切割位點(diǎn)-chikv-e2編碼序列-切割位點(diǎn)-chikv-e1編碼序列-終止信號(hào)-終止信號(hào)。

seqidno:14指seqidno:13編碼的氨基酸序列，是共有env蛋白序列，即ige前導(dǎo)序列-chikv-e3-切割位點(diǎn)-chikv-e2-切割位點(diǎn)-chikv-e1編碼序列。

seqidno:15指對(duì)應(yīng)于seqidno:13的編碼共有env但是沒(méi)有ige前導(dǎo)序列的核苷酸序列，即chikv-e3編碼序列-切割位點(diǎn)-chikv-e2編碼序列-切割位點(diǎn)-chikv-e1編碼序列-終止信號(hào)-終止信號(hào)。

seqidno:16指seqidno:15編碼的氨基酸序列，是沒(méi)有ige前導(dǎo)序列的共有env蛋白序列，即chikv-e3-切割位點(diǎn)-chikv-e2-切割位點(diǎn)-chikv-e1編碼序列。

seqidno:17指ige前導(dǎo)序列的氨基酸序列。

gccgccacc指優(yōu)選的kozak序列。

當(dāng)編碼共有蛋白的核酸分子被個(gè)體細(xì)胞攝取時(shí)，編碼共有蛋白的核苷酸序列在細(xì)胞中表達(dá)，由此將蛋白遞送給個(gè)體。本發(fā)明的多個(gè)方面提供了遞送質(zhì)粒上共有蛋白編碼序列或者作為重組疫苗的一部分和作為減毒疫苗的一部分的共有蛋白編碼序列的方法。

根據(jù)本發(fā)明一些方面，提供了針對(duì)病原體或異常的疾病相關(guān)細(xì)胞而預(yù)防性和/或治療性免疫個(gè)體的組合物和方法。疫苗可以是任何類型的疫苗，例如減毒活疫苗、重組疫苗或核酸疫苗或dna疫苗。

在一些實(shí)施方案中，疫苗包含一種、兩種或所有三種共有蛋白。在一些實(shí)施方案中，疫苗包含同一核酸分子上兩種共有蛋白的編碼序列。在一些實(shí)施方案中，疫苗包含兩種不同核酸分子上兩種共有蛋白的編碼序列。在一些實(shí)施方案中，疫苗包含同一核酸分子上三種共有蛋白的編碼序列。在一些實(shí)施方案中，疫苗包含三種共有蛋白的編碼序列，其中兩種共有蛋白的編碼序列在同一核酸分子上而第三種共有蛋白的編碼序列在第二種核酸分子上。例如，一種核酸分子包含e1和e2的編碼序列并且包含衣殼的編碼序列；或者一種核酸分子包含e1和衣殼的編碼序列并且包含e2的編碼序列，或者一種核酸分子包含e2和衣殼的編碼序列并且包含e1的編碼序列。在一些實(shí)施方案中，疫苗包含三種共有蛋白的編碼序列，其中有三種不同的核酸分子，并且每種核酸分子包含不同的編碼序列。

在一些實(shí)施方案中，包括ige前導(dǎo)序列的共有e1的編碼序列是seqidno:1。在一些實(shí)施方案中，無(wú)ige前導(dǎo)序列的共有e1的編碼序列是seqidno:4。在一些實(shí)施方案中，含有ige前導(dǎo)序列的共有e1蛋白是seqidno:7或其片段。在一些實(shí)施方案中，共有e1蛋白是seqidno:10或其片段。在一些實(shí)施方案中，含有ige前導(dǎo)序列的共有e1蛋白80％、90％、95％、98％或99％同源于seqidno:7。在一些實(shí)施方案中，無(wú)ige前導(dǎo)序列的共有e1蛋白80％、90％、95％、98％或99％同源于seqidno:10。在一些實(shí)施方案中，包括ige前導(dǎo)序列的共有e2的編碼序列是seqidno:2。在一些實(shí)施方案中，無(wú)ige前導(dǎo)序列的共有e2的編碼序列是seqidno:5。在一些實(shí)施方案中，含有ige前導(dǎo)序列的共有e2蛋白是seqidno:8或其片段。在一些實(shí)施方案中，共有e2蛋白是seqidno:11或其片段。在一些實(shí)施方案中，含有ige前導(dǎo)序列的共有e2蛋白80％、90％、95％、98％或99％同源于seqidno:7。在一些實(shí)施方案中，無(wú)ige前導(dǎo)序列的共有e1蛋白80％、90％、95％、98％或99％同源于seqidno:11。在一些實(shí)施方案中，包括ige前導(dǎo)序列的共有衣殼的編碼序列是seqidno:3。在一些實(shí)施方案中，無(wú)ige前導(dǎo)序列的共有e1的編碼序列是seqidno:6。在一些實(shí)施方案中，含有ige前導(dǎo)序列的共有e1蛋白是seqidno:9或其片段。在一些實(shí)施方案中，共有e1蛋白是seqidno:12或其片段。在一些實(shí)施方案中，含有ige前導(dǎo)序列的共有e1蛋白80％、90％、95％、98％或99％同源于seqidno:9。在一些實(shí)施方案中，無(wú)ige前導(dǎo)序列的共有e1蛋白80％、90％、95％、98％或99％同源于seqidno:12。

多種基因可以在單一核酸分子上或在多種核酸分子上。例如，一種核酸分子包含e1和e2的編碼序列并且包含衣殼的編碼序列；或者一種核酸分子包含e1和衣殼的編碼序列并且包含e2的編碼序列，或者一種核酸分子包含e2和衣殼的編碼序列并且包含e1的編碼序列。在一些實(shí)施方案中，疫苗包含三種共有蛋白的編碼序列，其中存在三種不同的核酸分子并且每種核酸分子包含不同的編碼序列。疫苗可以包含e1、e2和衣殼的兩種或多種共有序列的組合。

在一些實(shí)施方案中，疫苗包含共有chikvenv，共有chikvenv包含連接在一起作為單一嵌合基因的e1、e2和e3。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體共有序列通過(guò)編碼蛋白酶切割位點(diǎn)的序列彼此連接。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含e1、e2和e3各自的片段，使得嵌合基因在個(gè)體中的表達(dá)形成對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含seqidno:13或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少85％同源于seqidno:13的核酸序列或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少90％同源于seqidno:13的核酸序列或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少95％同源于seqidno:13的核酸序列或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少98％同源于seqidno:13或的核酸序列其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少99％同源于seqidno:13的核酸序列或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含seqidno:15或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少85％同源于seqidno:15的核酸序列或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少90％同源于seqidno:15的核酸序列或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少95％同源于seqidno:15的核酸序列或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少98％同源于seqidno:15的核酸序列或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因包含至少99％同源于seqidno:15的核酸序列或其片段，該片段包含的序列足以使蛋白在個(gè)體中的表達(dá)形成對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。

在一些實(shí)施方案中，疫苗包含共有chikvenv，其編碼連接在一起的e1、e2和e3的共有氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，個(gè)體共有序列通過(guò)編碼蛋白酶切割位點(diǎn)的序列彼此連接。在一些實(shí)施方案中，嵌合基因編碼e1、e2和e3各自的片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，共有蛋白chikvenv包含seqidno:14或其片段，該片段包含足夠序列，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，chikvenv共有蛋白包含至少85％同源于seqidno:14的氨基酸序列或其片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，chikvenv共有蛋白包含至少90％同源于seqidno:14的氨基酸序列或其片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，chikvenv共有蛋白包含至少95％同源于seqidno:14的氨基酸序列或其片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，chikvenv共有蛋白包含至少98％同源于seqidno:14的氨基酸序列或其片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，chikvenv共有蛋白包含至少99％同源于seqidno:14的氨基酸序列或其片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，chikvenv共有蛋白包含至少85％同源于seqidno:16的氨基酸序列或其片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，chikvenv共有蛋白包含至少90％同源于seqidno:16的氨基酸序列或其片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，chikvenv共有蛋白包含至少95％同源于seqidno:16的氨基酸序列或其片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，chikvenv共有蛋白包含至少98％同源于seqidno:16的氨基酸序列或其片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，chikvenv共有蛋白包含至少99％同源于seqidno:14的氨基酸序列或其片段，其中由此編碼的氨基酸序列具有免疫原性并且誘發(fā)針對(duì)e1、e2和e3各自的免疫應(yīng)答。

核酸分子可以使用幾種已知技術(shù)中的任何一種來(lái)遞送，所述已知技術(shù)包括dna注射(還稱為dna接種)、重組載體(例如重組腺病毒、重組腺病毒相關(guān)病毒和重組牛痘病毒)。

dna疫苗描述于美國(guó)專利號(hào)5,593,972，5,739,118，5,817,637，5,830,876，5,962,428，5,981,505，5,580,859，5,703,055，5,676,594和其中引用的優(yōu)先申請(qǐng)，這些文獻(xiàn)均以引用的方式并入本文。除了那些申請(qǐng)中描述的遞送方案以外，遞送dna的可選方法還描述于美國(guó)專利號(hào)4,945,050和5,036,006，這兩個(gè)文獻(xiàn)均以引用的方式并入本文。

施用途徑包括但不限于肌內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、眼內(nèi)和口服以及局部、經(jīng)皮、通過(guò)吸入或栓劑或至粘膜組織(例如通過(guò)灌洗至陰道、直腸、尿道、口腔和舌下組織)。優(yōu)選的施用途徑包括至粘膜組織、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)和皮下注射?；驑?gòu)建體可以通過(guò)包括但不限于下述的工具施用：傳統(tǒng)注射器、無(wú)針頭注射裝置或“微彈轟擊基因槍”。

另一施用途徑涉及使用電穿孔來(lái)遞送基因構(gòu)建體，描述于美國(guó)專利號(hào)5,273,525，5,439,440，5,702,359，5,810,762，5,993,434，6,014,584，6,055,453，6,068,650，6,110,161，6,120,493，6,135,990，6,181,964，6,216,034，6,233,482，6,241,701，6,347,247，6,418,341，6,451,002，6,516,223，6,567,694，6,569,149，6,610,044，6,654,636，6,678,556，6,697,669，6,763,264，6,778,853，6,865,416，6,939,862和6,958,060，這些文獻(xiàn)據(jù)此以引用的方式并入。

優(yōu)選用于促進(jìn)dna疫苗遞送的電穿孔裝置和電穿孔方法的實(shí)例包括描述于下述文獻(xiàn)中的那些：draghia-akli等的美國(guó)專利號(hào)7,245,963，smith等提交的美國(guó)專利公布2005/0052630，這兩個(gè)文獻(xiàn)的內(nèi)容全文據(jù)此以引用的方式并入。還優(yōu)選的是在2007年10月17日提交的共同待審和共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)11/874072中提供的促進(jìn)dna疫苗遞送的電穿孔裝置和電穿孔方法，該美國(guó)專利申請(qǐng)根據(jù)35usc119(e)要求2006年10月17日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序號(hào)60/852,149和2007年10月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序號(hào)60/978,982的權(quán)益，所有申請(qǐng)的全文據(jù)此以引用的方式并入。

下面是使用電穿孔技術(shù)的實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)例，并且在上述專利參考文獻(xiàn)中更詳細(xì)地討論：電穿孔裝置可被配置為向所需的哺乳動(dòng)物組織遞送能量脈沖，該能量脈沖產(chǎn)生類似于使用者預(yù)設(shè)電流輸入的恒定電流。電穿孔裝置包括電穿孔組件和電極部件或手柄部件。電穿孔組件可包括并并入電穿孔裝置的各種元件的一種或多種，包括：控制器、電流波形發(fā)生器、阻抗測(cè)試儀、波形記錄儀、輸入元件、狀態(tài)報(bào)告元件、通訊端口、記憶組件、電源和電源開(kāi)關(guān)。電穿孔組件能夠作為電穿孔裝置的一個(gè)元件起作用，其他元件是與所述電穿孔組件聯(lián)通的分開(kāi)元件(或組件)。在一些實(shí)施方案中，電穿孔組件能夠起到電穿孔裝置中不止一個(gè)元件的作用，其還可以與電穿孔裝置中與所述電穿孔組件分開(kāi)的其他元件聯(lián)通。使用電穿孔技術(shù)遞送疫苗不受作為一個(gè)機(jī)電裝置或機(jī)械裝置的部分而存在的電穿孔裝置的元件所限制，因?yàn)樗鲈軌蚱鸬揭粋€(gè)裝置或起到與分開(kāi)元件彼此聯(lián)通的作用。電穿孔組件能夠遞送在所需組織中產(chǎn)生恒定電流的能量脈沖，并且包括反饋機(jī)制。電極部件包括具有空間排列的多個(gè)電極的電極陣列，其中電極部件接收來(lái)自電穿孔組件的能量脈沖并通過(guò)電極將其遞送至所需的組織。多個(gè)電極的至少一個(gè)在能量脈沖遞送中是中性的并且測(cè)量所需組織中的阻抗并且將阻抗聯(lián)通至電穿孔組件。反饋機(jī)制可以接收測(cè)量的阻抗并且可以調(diào)節(jié)電穿孔組件遞送的能量脈沖以保持恒定電流。

在一些實(shí)施方案中，多個(gè)電極可以以分散模式遞送能量脈沖。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)電極可以通過(guò)以編程順序控制電極來(lái)以分散模式遞送能量脈沖，所述編程順序由使用者輸入至電穿孔組件。在一些實(shí)施方案中，編程順序包括順序遞送的多個(gè)脈沖，其中所述多個(gè)脈沖的每一個(gè)脈沖由至少兩個(gè)活性電極(帶有一個(gè)測(cè)量阻抗的中性電極)遞送，并且其中所述多個(gè)脈沖的下一個(gè)脈沖由至少兩個(gè)活性電極(帶有一個(gè)測(cè)量阻抗的中性電極)的不同的一個(gè)遞送。

在一些實(shí)施方案中，反饋機(jī)制通過(guò)硬件或軟件進(jìn)行。優(yōu)選地，反饋機(jī)制通過(guò)模擬閉環(huán)電路進(jìn)行。優(yōu)選地，該反饋每隔50μs、20μs、10μs或1μs發(fā)生，但是優(yōu)選為實(shí)時(shí)反饋或即時(shí)反饋(即，通過(guò)采用現(xiàn)有技術(shù)測(cè)定響應(yīng)時(shí)間確定為基本上是即時(shí)的)。在一些實(shí)施方案中，中性電極測(cè)量所需組織中的阻抗并將阻抗聯(lián)通至反饋機(jī)制，并且反饋機(jī)制響應(yīng)阻抗并調(diào)節(jié)能量脈沖以保持恒定電流為類似于預(yù)設(shè)電流的值。在一些實(shí)施方案中，反饋機(jī)制在能量脈沖遞送過(guò)程中連續(xù)并即時(shí)保持恒定電流。

當(dāng)被細(xì)胞攝取時(shí)，基因構(gòu)建體可以作為功能性染色體外分子保持存在于細(xì)胞中。dna可以以質(zhì)粒形式被引入細(xì)胞，dna在細(xì)胞中短暫存在?？蛇x地，rna可以被施用至細(xì)胞。還考慮提供作為線性微型染色體的基因構(gòu)建體，包括著絲粒、端粒和復(fù)制起點(diǎn)。基因構(gòu)建體可以構(gòu)成被施用于受試者的減毒活微生物或重組微生物載體中遺傳物質(zhì)的部分?；驑?gòu)建體可以是重組病毒疫苗的基因組的部分，其中遺傳物質(zhì)保持在染色體外。基因構(gòu)建體包括核酸分子基因表達(dá)所必要的調(diào)控元件。所述元件包括：?jiǎn)?dòng)子、起始密碼子、終止密碼子和多聚腺苷酸化信號(hào)。此外，增強(qiáng)子通常是編碼靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白的序列的基因表達(dá)所需要的。必要的是，這些元件與編碼所需蛋白的序列可操作連接，并且所述調(diào)控元件在它們被施用的個(gè)體中是可操作的。

一般認(rèn)為起始密碼子和終止密碼子是編碼所需蛋白的核苷酸序列的部分。然而，必要的是，這些元件在基因構(gòu)建體被施用的個(gè)體中是功能性的。起始密碼子和終止密碼子必須與編碼序列在框內(nèi)。

所使用的啟動(dòng)子和多聚腺苷酸化信號(hào)必須在個(gè)體細(xì)胞內(nèi)是功能性的。

可用于實(shí)施本發(fā)明、特別是產(chǎn)生人類基因疫苗的啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于來(lái)自猿猴病毒40(sv40)、小鼠乳腺腫瘤病毒(mmtv)啟動(dòng)子、人類免疫缺陷病毒(mv)(例如biv長(zhǎng)末端重復(fù)序列(ltr)啟動(dòng)子)、莫洛尼病毒、alv(禽白血病病毒)、巨細(xì)胞病毒(cmv)(例如cmv立即早期啟動(dòng)子)、eb病毒(ebv)、勞氏肉瘤病毒(rsv)的啟動(dòng)子以及來(lái)自人類基因的啟動(dòng)子，所述人類基因例如人類肌動(dòng)蛋白、人類肌球蛋白、人類血紅素、人類肌肉肌酸和人類金屬硫蛋白。

可用于實(shí)施本發(fā)明、特別是產(chǎn)生人類基因疫苗的多聚腺苷酸化信號(hào)的實(shí)例包括但不限于sv40多聚腺苷酸化信號(hào)、小牛生長(zhǎng)激素多聚腺苷酸化(bgh-polya)信號(hào)和ltr多聚腺苷酸化信號(hào)。特別地，使用在pcep4質(zhì)粒(invitrogen,sandiegocalif.)中稱為sv40多聚腺苷酸化信號(hào)的sv40多聚腺苷酸化信號(hào)。

除了dna表達(dá)所需的調(diào)控元件，dna分子中還可以包括其他元件。此類其他元件包括增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可以選自下述組，包括但不限于：人類肌動(dòng)蛋白、人類肌球蛋白、人類血紅素、人類肌肉肌酸和病毒增強(qiáng)子(例如來(lái)自cmv、rsv和ebv的那些)。

基因構(gòu)建體可以具有哺乳動(dòng)物復(fù)制起點(diǎn)以在染色體外保持構(gòu)建體并在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生多個(gè)構(gòu)建體拷貝。來(lái)自invitrogen(sandiego,calif.)的質(zhì)粒pvax1、pcep4和prep4含有eb病毒復(fù)制起點(diǎn)和核抗原ebna-1編碼區(qū)，其產(chǎn)生高拷貝的無(wú)整合游離型復(fù)制。

在有關(guān)免疫應(yīng)用的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，遞送的核酸分子包括編碼共有蛋白的核苷酸序列并且另外包括進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)此類靶蛋白的免疫應(yīng)答的蛋白基因。此類基因的實(shí)例是編碼其他細(xì)胞因子和淋巴因子的那些基因，所述細(xì)胞因子和淋巴因子例如α-干擾素、γ-干擾素、血小板衍生生長(zhǎng)因子(pdgf)、tnf、gm-csf、表皮生長(zhǎng)因子(egf)、il-1、il-2、ii-4、il-6、il-10、il-12、il-15、il-28，其包括信號(hào)序列缺失并任選包括來(lái)自ige信號(hào)肽的il-15。

用于本方法的組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種下述蛋白和/或編碼此類蛋白的核酸分子，如在對(duì)應(yīng)于美國(guó)公開(kāi)號(hào)20030176378的美國(guó)序號(hào)10/139,423(該文獻(xiàn)以引用的方式并入本文)中提出的：主要組織相容性復(fù)合物抗原，包括主要組織相容性復(fù)合物i類抗原或主要組織相容性復(fù)合物ii類抗原；死亡結(jié)構(gòu)域受體，包括但不限于apo-1、fas、tnfr-1、p55、wsl-1、dr3、tramp、apo-3、air、lard、ngrf、dr4、dr5、killer、trail-r2、trick2和dr6；死亡信號(hào)，即，與死亡結(jié)構(gòu)域受體相互作用的蛋白，包括但不限于fadd、fap-1、tradd、rip、flice和raidd；或包括結(jié)合死亡結(jié)構(gòu)域受體并引發(fā)細(xì)胞凋亡的配體的死亡信號(hào)，包括但不限于fas-l和tnf；和與死亡結(jié)構(gòu)域受體相互作用的介體，包括但不限于fadd、mort1和myd88；毒素，包括殺傷細(xì)胞的蛋白，包括但不限于昆蟲(chóng)毒液和蛇毒液、細(xì)菌外毒素(例如假單胞桿菌外毒素)、雙鏈核糖體失活蛋白(例如蓖麻毒素)，包括單鏈毒素和白樹(shù)毒素。

本方法中使用的組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種下述蛋白和/或編碼此類蛋白的核酸分子，如在對(duì)應(yīng)于美國(guó)公開(kāi)號(hào)20070041941的美國(guó)序號(hào)10/560,650(該文獻(xiàn)以引用的方式并入本文)中提出的：il-15，包括包含與il-15蛋白序列連接的非il-15信號(hào)肽的融合蛋白，例如包含與il-15蛋白序列連接的ige信號(hào)肽的融合蛋白，cd40l，trail；railrecdrc5、trail-r2、trail-r3、trail-r4、rank、rankligand、ox40、ox40ligand、nkg2d、f461811或mica、micb、nkg2a、nkg2b、nkg2c、nkg2e、nkg2f、cd30、cd153(cd30l)、fos、c-jun、sp-1、ap1、ap-2、p38、p65rel、myd88、irak、traf6、ikb、nik、sapk、sap1、jnk2、jnk1b2、jnk1b1、jnk2b2、jnk2b1、jnk1a2、jnk2a1、jnk3a1、jnk3a2、nf-κ-b2、p49剪接形式、nf-κ-b2、p100剪接形式、nf-κ-b2、p105剪接形式、nf-κ-b50k鏈前體、nfkbp50、人il-1α、人il-2、人il-4、鼠il-4、人il-5、人il-10、人il-15、人il-18、人tnf-α、人tnf-β、人白介素12、madcam-1、ngfil-7、vegf、tnf-r、fas、cd40l、il-4、csf、g-csf、gm-csf、m-csf、lfa-3、icam-3、icam-2、icam-1、pecam、p150.95、mac-1、lfa-1、cd34、rantes、il-8、mip-1α、e-選擇子、cd2、mcp-1、l-選擇子、p-選擇子、flt、apo-1、fas、tnfr-1、p55、wsl-1、dr3、tramp、apo-3、air、lard、ngrf、dr4(trail)、dr5、killer、trail-r2、trick2、dr6、ice、vla-1和cd86(b7.2)。

用于本方法的組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種下述蛋白和/或編碼此類蛋白的核酸分子，如在對(duì)應(yīng)于美國(guó)公開(kāi)號(hào)20070104686的美國(guó)序號(hào)10/560,653(該文獻(xiàn)以引用的方式并入本文)中提出的：fos、c-jun、sp-1、ap-1、ap-2、p38、p65rel、myd88、irak、traf6、ikb、失活nik、sapk、sap-1、jnk、干擾素應(yīng)答基因、nfkb、bax、trail、trailrec、trailrecdrc5、trail-r3、trail-r4、rank、rankligand、ox40、ox40ligand、nkg2d、mica、micb、nkg2a、nkg2b、nkg2c、nkg2e、nkg2f、tap1和tap2。

如果為任何原因而希望消除接收基因構(gòu)建體的細(xì)胞，可以添加用作細(xì)胞破壞的靶的其他元件?；驑?gòu)建體中可以包括可表達(dá)形式的皰疹病毒胸苷激酶(tk)基因。藥物更昔洛韋(gangcyclovir)可以施用至個(gè)體，并且該藥物會(huì)引起形成tk的任何細(xì)胞的選擇性殺傷，從而提供選擇性破壞具有基因構(gòu)建體的細(xì)胞的方式。

為了最大化蛋白制備，可以選擇非常適合在被施用構(gòu)建體的細(xì)胞中基因表達(dá)的調(diào)控序列。而且，可以選擇在細(xì)胞中最有效轉(zhuǎn)錄的密碼子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以制備在細(xì)胞中有功能性的dna構(gòu)建體。

在一些實(shí)施方案中，可以提供基因構(gòu)建體以產(chǎn)生與ige信號(hào)肽連接的本文所述的免疫調(diào)節(jié)蛋白的編碼序列。

本發(fā)明的一個(gè)方法包括肌內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或局部或通過(guò)灌洗至粘膜組織而施用核酸分子的步驟，所述灌洗至粘膜組織選自由吸入、陰道、直腸、尿道、口腔和舌下組成的組。

在一些實(shí)施方案中，聯(lián)合多核苷酸功能增強(qiáng)劑或基因疫苗促進(jìn)劑的施用將核酸分子遞送至細(xì)胞。多核苷酸功能增強(qiáng)劑描述于美國(guó)專利號(hào)5,593,972和5,962,428，這兩個(gè)文獻(xiàn)均以引用的方式并入本文?；蛞呙绱龠M(jìn)劑描述于美國(guó)專利號(hào)5,739,118，該文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。聯(lián)合核酸分子施用的助劑可以作為與核酸分子的混合物施用或者在核酸分子施用的同時(shí)、之前或之后分開(kāi)施用。此外，可以作為轉(zhuǎn)染劑和/或復(fù)制劑和/或炎性劑的其他制劑和可以與多核苷酸功能增強(qiáng)劑共同施用的其他制劑包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和淋巴因子，例如α-干擾素、γ-干擾素、gm-csf、血小板衍生生長(zhǎng)因子(pdgf)、tnf、表皮生長(zhǎng)因子(egf)、il-1、il-2、il-4、il-6、il-10、il-12和il-15以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、表面活性劑(例如免疫刺激復(fù)合物(iscoms))、lps類似物(包括單磷脂酰脂a(wl))、胞壁酰肽、醌類似物和諸如角鯊烯的小囊泡，透明質(zhì)酸也可以聯(lián)合基因構(gòu)建體施用來(lái)使用。在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)蛋白可以用作多聚核苷酸功能增強(qiáng)劑。在一些實(shí)施方案中，核酸分子與(丙交酯-乙交酯)共聚物(plg)聯(lián)合提供以增強(qiáng)遞送/攝取。

根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含約1納克至約2000微克dna。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含約5納克至約1000微克dna。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合物含有約10納克至約800微克dna。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合物含有約0.1至約500微克dna。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合物含有約1至約350微克dna。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合物含有約25至約250微克dna。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物組合物含有約100至約200微克dna。

根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物根據(jù)要使用的施用方式來(lái)配制。在藥物組合物是可注射藥物組合物的情況下，它們是無(wú)菌、無(wú)熱原和無(wú)微粒的。優(yōu)選使用等滲制劑。一般而言，等滲性添加劑可以包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情況下，諸如磷酸鹽緩沖鹽水之類的等滲溶液是優(yōu)選的。穩(wěn)定劑包括明膠和白蛋白。在一些實(shí)施方案中，將血管收縮劑添加至制劑中。

根據(jù)本發(fā)明一些實(shí)施方案，提供了誘發(fā)對(duì)屈曲病毒的免疫應(yīng)答的方法。疫苗可以是減毒活疫苗、重組疫苗或核酸或dna疫苗。

核酸分子可以提供為質(zhì)粒dna、重組載體的核酸分子或者減毒疫苗中提供的遺傳物質(zhì)的部分?？蛇x地，在一些實(shí)施方案中，共有蛋白可以作為附隨編碼它們的核酸分子或者取代編碼它們的核酸分子的蛋白而被遞送。

基因構(gòu)建體可以包含編碼可操作地連接至基因表達(dá)所需的調(diào)控元件的靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明，提供了基因構(gòu)建體的組合，包括包含編碼靶蛋白的核苷酸序列的可表達(dá)形式的一個(gè)構(gòu)建體和包含編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列的可表達(dá)形式的一個(gè)構(gòu)建體。將包含基因構(gòu)建體組合的dna或rna分子遞送入活細(xì)胞，導(dǎo)致dna或rna的表達(dá)以及靶蛋白和一種或多種免疫調(diào)節(jié)蛋白的產(chǎn)生。形成增強(qiáng)的對(duì)靶蛋白的免疫應(yīng)答。

除了使用免疫調(diào)節(jié)蛋白編碼序列的可表達(dá)形式來(lái)改進(jìn)基因疫苗以外，本發(fā)明還涉及改進(jìn)的減毒活疫苗和使用重組載體遞送編碼抗原的外源基因的改進(jìn)的疫苗。減毒活疫苗和使用重組載體遞送外來(lái)抗原的疫苗描述于美國(guó)專利號(hào)：4,722,848；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,364；5,462,734；5,470,734；和5,482,713，這些文獻(xiàn)均以引用的方式并入本文。提供了包含編碼共有蛋白或其免疫原性共有片段的核苷酸序列的基因構(gòu)建體，其中所述核苷酸序列可操作地連接至可在疫苗中起作用以實(shí)現(xiàn)表達(dá)的調(diào)控序列。將基因構(gòu)建體摻入減毒活疫苗和重組疫苗中以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的改進(jìn)的疫苗。

本發(fā)明提供了免疫個(gè)體的改進(jìn)的方法，該方法包括將基因構(gòu)建體作為疫苗組合物的部分遞送至個(gè)體細(xì)胞的步驟，所述疫苗組合物包括dna疫苗、減毒活疫苗和重組疫苗。所述基因構(gòu)建體包含編碼共有蛋白或其免疫原性共有片段的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地連接至可在疫苗中起作用以實(shí)現(xiàn)表達(dá)的調(diào)控序列。所述疫苗形成對(duì)不同菌株的交叉防護(hù)。

實(shí)施例

實(shí)施例1

這里，我們提供了采用dna疫苗策略進(jìn)行chikv疫苗設(shè)計(jì)的基于共有序列的新方法的數(shù)據(jù)?；趲в袔追N改性的chikv衣殼和被膜特異性共有序列設(shè)計(jì)了疫苗盒。衣殼、被膜e1和e1的表達(dá)使用t7-偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯和免疫印跡分析來(lái)評(píng)估。使用自適應(yīng)恒定電流電穿孔技術(shù)通過(guò)肌內(nèi)注射編碼chik-衣殼、e1和e1的質(zhì)粒來(lái)免疫c57bl/6小鼠。細(xì)胞免疫應(yīng)答的分析(包括表位作圖)表明，這些構(gòu)建體的電穿孔誘發(fā)了強(qiáng)力且廣泛的細(xì)胞免疫性。此外，抗體elisa表明，這些合成免疫原能夠誘發(fā)可識(shí)別天然抗原的高滴度抗體。綜合起來(lái)，這些數(shù)據(jù)支持在潛在疫苗混合物中使用chik共有抗原的進(jìn)一步研究。

該研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了基于帶有幾種改性的衣殼(cap)和被膜(e1)和被膜(e2)特異性共有序列和取代的免疫球蛋白e前導(dǎo)序列的疫苗盒，所述改性包括密碼子優(yōu)化、rna優(yōu)化、添加kozak序列。疫苗盒被引入dna疫苗載體pvax1的特定位點(diǎn)。使用特異限制性酶切并使用t7啟動(dòng)子的引物測(cè)序來(lái)檢查疫苗構(gòu)建體的插入物?；隗w外表達(dá)以及使用體內(nèi)蛋白質(zhì)印跡分析，最終的構(gòu)建體被高效表達(dá)。這證實(shí)了病毒構(gòu)建體被正確表達(dá)并處理以用于進(jìn)一步的免疫原性研究。

最近，使用ep遞送dna疫苗引起廣泛關(guān)注。在小動(dòng)物模型和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中im免疫+ep的最近研究一致性地報(bào)道了細(xì)胞應(yīng)答、特別是抗體應(yīng)答的增加[20-22]。

材料和方法

細(xì)胞和動(dòng)物：

在補(bǔ)充有10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)并保持從atcc獲得的bhk-21細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物質(zhì)粒表達(dá)載體pvax1購(gòu)自invitrogen((carlsbad,ca)。3-4周齡雌性c57bl/6小鼠(jacksonlaboratories,indianapolis,in)用于這些實(shí)驗(yàn)并分成三個(gè)實(shí)驗(yàn)組(n4)。所有動(dòng)物根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(bethesda,md,usa)和賓夕法尼亞大學(xué)(philadelphia,pa,usa)機(jī)構(gòu)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)(iacuc)的指導(dǎo)原則圈養(yǎng)于控溫的光循環(huán)設(shè)施內(nèi)。

chikvdna構(gòu)建體和合成：

通過(guò)合成引物的合成，隨后使用從所有chikv病毒的ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)搜集的共有菌株預(yù)測(cè)序列進(jìn)行dna-pcr擴(kuò)增，來(lái)設(shè)計(jì)chikv核心和被膜基因。共有序列被優(yōu)化以用于表達(dá)，其包括密碼子和rna優(yōu)化(geneart,regensburg,germany)，然后插入pvax1表達(dá)載體(invitrogen)。

體外和體內(nèi)表達(dá)：

利用pvax1骨架中t7啟動(dòng)子和含有s35-甲硫氨酸chikv基因的基于t7的偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)(promega,madison,wi)證實(shí)構(gòu)建體表達(dá)。合成的蛋白使用抗e1抗體、抗e2抗體或抗衣殼抗體進(jìn)行免疫沉淀。免疫沉淀蛋白在12％nupagesds-page凝膠(invitrogen,ca)上電泳并隨后固定并干燥。進(jìn)行自顯影以檢測(cè)摻入的s35標(biāo)記的基因產(chǎn)物。在體內(nèi)表達(dá)中，bhk-21細(xì)胞(1×10⁶)使用fugene轉(zhuǎn)染方法(roche,nj)用chikv構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，蛋白(50μg)在sds–page(12％)上分級(jí)分離并轉(zhuǎn)移至pvdf膜(bio-rad,hercules,ca)。使用在小鼠中培養(yǎng)的特異性抗血清進(jìn)行免疫印跡分析，并使用ecl檢測(cè)系統(tǒng)(amershampharmaciabiotech,piscataway,nj)用辣根過(guò)氧化物酶軛合的山羊抗小鼠igg使表達(dá)的蛋白顯現(xiàn)[19]。

免疫和電穿孔

使用標(biāo)準(zhǔn)方案用質(zhì)粒dna初次免疫動(dòng)物[20]。四只小鼠的組用pchikv基因(25μg)免疫兩次，2–3次，間隔2周，在最后一次免疫后1周處死。所有免疫通過(guò)體內(nèi)電穿孔(ep)(vgxpharmaceuticalsinc,bluebell,pa)以100μl的總體積遞送至四頭肌。動(dòng)物在最后一次免疫后7天被處死，之后收集血清和脾用于免疫學(xué)分析。分別在第二次免疫和第三次免疫之后1周獲得對(duì)照小鼠和免疫小鼠的血液。在所有實(shí)驗(yàn)中使用方波脈沖，并使用在我們實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和測(cè)試的恒定電流ekd遞送[20-22]。小鼠實(shí)驗(yàn)中使用三電極陣列(3-ea)。3-ea由三個(gè)26規(guī)實(shí)心不銹鋼電極組成，形成等腰三角形，兩個(gè)長(zhǎng)邊長(zhǎng)0.5mm，短邊長(zhǎng)0.3mm，用不導(dǎo)電塑料固定在一起。小鼠實(shí)驗(yàn)的具體ep條件是使用恒定電流0.1安培，三脈沖，52毫秒/脈沖，脈沖間隔4秒。質(zhì)粒注射和ep之間的延遲時(shí)間為約20秒。質(zhì)粒施用/ep的事件順序如下：將一次性電極組件放入手柄容器，按壓手柄上的啟動(dòng)按鈕并輸入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)組號(hào)，使用胰島素注射器注射50μldna構(gòu)建體(共25μgdna)質(zhì)粒，立即將針頭放入注射位點(diǎn)周圍區(qū)域，按壓手柄上的啟動(dòng)按鈕，4秒鐘倒計(jì)時(shí)后，脈沖被遞送。電穿孔5秒鐘后，將陣列輕輕從肌肉移開(kāi)。所有電極在所有處理過(guò)程中完全插入肌肉[21,22]。所有dna使用無(wú)內(nèi)毒素的qiagen柱制備。所有動(dòng)物在賓夕法尼亞大學(xué)圈養(yǎng)于控溫的光循環(huán)設(shè)施內(nèi)，它們的管理依據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院和賓夕法尼亞大學(xué)的指導(dǎo)原則。

細(xì)胞應(yīng)答：elispot分析

elispot分析如先前所述進(jìn)行[23]。簡(jiǎn)而言之，elispot96孔板(微孔)用抗小鼠ifn-γ捕獲抗體涂布并在4℃下培養(yǎng)24h(r&dsystems)。第二天，將板洗滌并用1％bsa封閉2h。將來(lái)自免疫小鼠的20萬(wàn)脾細(xì)胞添加至每個(gè)孔，并在37℃下5％co2中于存在rpmi1640(陰性對(duì)照)、cona(陽(yáng)性對(duì)照)或特定肽抗原(10μg/ml；invitrogen)的情況下中刺激過(guò)夜。肽庫(kù)由11個(gè)氨基酸重疊的15肽組成。刺激24h后，細(xì)胞經(jīng)洗滌后在4℃下與生物素化抗小鼠ifn-γ抗體(r&dsystems)一起培養(yǎng)24h。洗滌板，并將鏈霉親和素-堿性磷酸酶(r&dsystems)加入每個(gè)孔并在室溫下培養(yǎng)2h。洗滌板，向每個(gè)孔加入5-溴-4-氯-3′-吲哚基磷酸對(duì)甲苯胺鹽和氯化四唑氮藍(lán)(色原體顯色劑；r&dsystems)。然后將板用蒸餾水沖洗并在室溫下干燥。通過(guò)自動(dòng)化elispot讀取儀(ctllimited)計(jì)數(shù)斑點(diǎn)[21-23]。

體液免疫應(yīng)答：抗體elisa

確定每個(gè)chikvdna構(gòu)建體在每個(gè)dna首次注射后的抗體水平和對(duì)接種的體液免疫應(yīng)答。簡(jiǎn)而言之，96孔高結(jié)合聚苯乙烯板(corning,ny)板用在pbs中稀釋的合成特定肽(2μg/ml)在4℃下涂布過(guò)夜。第二天，板用pbst(pbs,0.05％吐溫20)洗滌，用pbst中3％bsa封閉1h，并在37℃下與來(lái)自免疫小鼠和首次實(shí)驗(yàn)小鼠的血清的1:100稀釋液一起培養(yǎng)1h。結(jié)合的igg使用1:5,000稀釋的山羊抗小鼠igg-hrp(researchdiagnostics,nj)檢測(cè)。結(jié)合的酶通過(guò)添加色原體基底溶液tmb(r&dsystems)來(lái)檢測(cè)，并在biotekel312ebio-kinetics讀取儀上在450nm讀數(shù)。所有血清樣品均以一式兩份測(cè)試[22]。

結(jié)果

共有構(gòu)建體表達(dá)：

三種chikv共有構(gòu)建體的表達(dá)使用多種技術(shù)來(lái)驗(yàn)證。為了顯現(xiàn)體外產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，進(jìn)行s³⁵標(biāo)記的體外t7偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯分析。使用組氨酸標(biāo)簽抗體免疫沉淀轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物并進(jìn)行凝膠分析。sds-page和放射顯影分析顯示，每種構(gòu)建體(被膜e1、e2和衣殼)電泳在其理論預(yù)測(cè)的分子量(圖2a)下進(jìn)行。我們接著試圖檢驗(yàn)這些構(gòu)建體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的體內(nèi)表達(dá)。轉(zhuǎn)染入bhk-21細(xì)胞后，在3天后提取蛋白質(zhì)并使用特異性多克隆抗體通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析來(lái)檢測(cè)表達(dá)(圖2b)。用特異性抗體進(jìn)行免疫印跡時(shí)，在被膜e1構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到52kda蛋白，在衣殼構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到36kda蛋白。

體液免疫原性

我們假設(shè)，我們的共有免疫原防衛(wèi)致命性chik病毒的強(qiáng)度取決于免疫系統(tǒng)的細(xì)胞免疫部分。而且，交叉反應(yīng)性但非中和性抗體可以提供某種程度的對(duì)疾病嚴(yán)重度的防護(hù)。為了確定我們的構(gòu)建體是否誘發(fā)抗體應(yīng)答，我們對(duì)chik免疫的小鼠血清進(jìn)行了抗體elisa以確定dna免疫后獲得的血清的抗體滴度，通過(guò)elisa測(cè)試抗體應(yīng)答。用被膜e1免疫的小鼠血清中抗e1特異性igg抗體顯著高于用載體對(duì)照免疫的小鼠血清(圖3a)。類似地，分別用被膜e2和衣殼構(gòu)建體免疫的小鼠血清中抗e2特異性igg抗體和衣殼特異性igg抗體顯著高于用載體對(duì)照免疫的小鼠血清(圖3b&c)。這些結(jié)果進(jìn)一步支持：質(zhì)粒遞送的可選方式、特別是電穿孔增加了響應(yīng)dna疫苗免疫原的抗體產(chǎn)生。

細(xì)胞免疫原性

e1、e2和衣殼構(gòu)建體誘發(fā)cd8+ctl應(yīng)答的能力通過(guò)ifn-γelispot分析確定。共有被膜構(gòu)建體e1、e2和衣殼疫苗能夠在三次免疫之后在c57bl/6小鼠中誘發(fā)強(qiáng)的ifn-γ應(yīng)答(圖4a、5a和6a)。對(duì)于被膜e1誘發(fā)的細(xì)胞免疫應(yīng)答的分子表征，針對(duì)跨整個(gè)被膜e1的肽文庫(kù)進(jìn)行elispot分析。使用了跨e1蛋白殘基1-435的74種15肽(它們之間有9個(gè)氨基酸重疊)和跨e2蛋白1-423的肽。被膜誘發(fā)了e1蛋白中的優(yōu)勢(shì)表位hsmtnavti(seqidno:18)(圖4b)和e2蛋白中的iilyyyely(seqidno:19)(圖5b)。類似地，對(duì)于衣殼蛋白，對(duì)跨整個(gè)衣殼蛋白的肽文庫(kù)進(jìn)行elispot分析。使用了跨衣殼蛋白殘基1-261的45種15肽，它們之間有9個(gè)氨基酸重疊。構(gòu)建體衣殼誘發(fā)了優(yōu)勢(shì)表位aclvgdkvm(seqidno:20)(圖5b)。有趣的是，構(gòu)建體chikv-e1誘發(fā)的優(yōu)勢(shì)表位帶有226a-v突變，表明所述構(gòu)建體還可以有效地誘發(fā)對(duì)新出現(xiàn)的突變病毒的免疫應(yīng)答。該發(fā)現(xiàn)可以表明，免疫應(yīng)答能夠在細(xì)胞選擇過(guò)程中推動(dòng)病毒進(jìn)化。

討論

c57bl/6小鼠中誘發(fā)的免疫應(yīng)答評(píng)估顯示，構(gòu)建體具有高度免疫原性并且就ifn-γ應(yīng)答和增殖而言引發(fā)了t細(xì)胞免疫應(yīng)答。本研究的elispot數(shù)據(jù)表明，ifn-γ應(yīng)答強(qiáng)度就獲得的斑點(diǎn)數(shù)量而言是基礎(chǔ)廣泛的。盡管已知其他相關(guān)α病毒中的被膜蛋白和衣殼具有免疫原性，但是有關(guān)屈曲被膜和衣殼蛋白的免疫原性知之甚少。來(lái)自被膜e1和衣殼不同區(qū)域的基質(zhì)肽庫(kù)引發(fā)脾細(xì)胞的ifn-γ產(chǎn)生，分別確定了在e1和衣殼蛋白中的t細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位hsmtnavti和aclvgdkvm。發(fā)現(xiàn)接種小鼠的總igg水平與未接種對(duì)照的總igg水平相比有所增加，表明強(qiáng)體液免疫應(yīng)答的誘發(fā)。除了這些疫苗加強(qiáng)對(duì)多種屈曲病毒攻擊的防護(hù)能力外，進(jìn)一步分析所誘發(fā)的抗體應(yīng)答類型的后續(xù)研究目前正在進(jìn)行中。

該研究表明，這些構(gòu)建體可以作為疫苗候選物進(jìn)一步研究。然而，由于該研究局限于證明疫苗構(gòu)建體在小鼠中肌內(nèi)注射接著電穿孔之后的高效表達(dá)和免疫原性，因此所述疫苗構(gòu)建體在包括非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型在內(nèi)的更多模型中的免疫原性詳細(xì)評(píng)估是重要的。描述的合成盒構(gòu)建體似乎是進(jìn)一步考察屈曲病毒免疫生物學(xué)的方便工具。

實(shí)施例2

設(shè)計(jì)了測(cè)量中和性抗體滴度的分析，其提供了對(duì)臨床人類chikv感染可行的快速診斷并應(yīng)用于易感的脊椎動(dòng)物宿主的臨床前血清監(jiān)視。

chikv通過(guò)rt-pcr識(shí)別。使用qiaamp病毒rna迷你試劑盒從患者血清提取rna。使用quiagen一步式rtpcr試劑盒進(jìn)行一步式rt-pcr測(cè)試。在編碼病毒被膜蛋白e2的基因中，擴(kuò)增產(chǎn)物為305bp。當(dāng)觀察細(xì)胞時(shí)，chikv形成泡沫細(xì)胞病變效應(yīng)(cpe)，其中在感染后(pi)24-48小時(shí)后看到細(xì)胞圓化(rounding)。

微量中和分析設(shè)計(jì)如下。中和試驗(yàn)是基于抗原與抗體反應(yīng)。觀察到患者血清中抑制已知病毒滴度對(duì)chikv病毒的同源抗體的存在。對(duì)血清進(jìn)行連續(xù)稀釋(通常例如1:10至1:640)并在足以使血清中抗體抑制病毒的條件和時(shí)間量下與已知滴度的chikv一起培養(yǎng)。培養(yǎng)后，如果病毒還未被血清中的抗體中和，在會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞感染病毒的條件下向受納細(xì)胞添加混合物。將抑制病毒繁殖的血清最高稀釋度記錄為抗體滴度。cpe(細(xì)胞病變效應(yīng))可以用作細(xì)胞中病毒繁殖的量度。

使用患者樣品進(jìn)行chikv中和測(cè)試。圖7是顯示預(yù)免疫和dna免疫小鼠血清的中和抗體滴度的圖。小鼠用編碼e1、e2、衣殼、e1+e2或載體pvax的構(gòu)建體免疫。血清被連續(xù)稀釋(1:10至1:640)并在37℃下與chikv(100tcid50)一起培養(yǎng)90分鐘。培養(yǎng)后，將混合物添加至96孔平底板中的vero細(xì)胞(15,000細(xì)胞/孔)并在5％co2氣氛中37℃下培養(yǎng)5天。將沒(méi)有觀察到cpe(細(xì)胞病變效應(yīng))的最高滴度記錄為中和抗體滴度。參考文獻(xiàn)

下述參考文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。

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序列表

<110>d·b·韋納(weiner,davidb.)

k·穆圖瑪尼(muthumani,karuppiah)

<120>屈曲病毒蛋白共有序列、編碼該屈曲病毒蛋白共有序列的核酸分子和組合物及其使用方法

<130>130694.06302

<150>us61/042661

<151>2008-04-04

<160>18

<170>patentinversion3.4

<210>1

<211>1374

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>chikve1共有序列

<400>1

atggactggacctggatcctgtttctggtcgctgctgccacccgggtgcacagctacgag60

cacgtgaccgtgatccccaacaccgtgggcgtgccctacaagaccctggtgaacaggccc120

ggctacagccccatggtgctggaaatggaactgctgtccgtgaccctggaacccaccctg180

agcctggactacatcacctgcgagtacaagacagtgatccccagcccctacgtgaagtgc240

tgcggcaccgccgagtgcaaggacaagaacctgcccgactacagctgcaaggtgttcacc300

ggcgtgtaccccttcatgtggggcggagcctactgcttctgcgacgccgagaacacccag360

ctgtccgaggcccacgtggagaagagcgagagctgcaagaccgagttcgccagcgcctac420

cgggcccacacagccagcgccagcgccaagctgcgggtgctgtaccagggcaacaacatc480

accgtgaccgcctacgccaacggcgaccacgccgtgacagtgaaggacgccaagttcatc540

gtgggccccatgagcagcgcctggacccccttcgacaacaagatcgtggtgtacaagggc600

gacgtgtacaacatggactacccccccttcggagccggcagacccggccagttcggcgac660

atccagagccggacccccgagagcaaggacgtgtacgccaatacccagctggtgctgcag720

agacccgccgtgggcaccgtgcacgtgccttacagccaggcccccagcggcttcaagtac780

tggctgaaagagaggggcgccagcctgcagcacaccgcccccttcggctgccagatcgcc840

accaaccccgtgcgggccgtgaattgtgccgtgggcaacatgcccatcagcatcgacatc900

cccgaggccgccttcaccagggtggtggacgcccccagcctgaccgacatgagctgcgag960

gtgcccgcctgcacccacagcagcgacttcggcggcgtggccatcatcaagtacgccgcc1020

agcaagaaaggcaagtgcgccgtgcacagcatgaccaatgccgtgaccatccgggaggcc1080

gagatcgaggtggagggcaacagccagctgcagatcagcttcagcaccgccctggccagc1140

gccgagttccgggtgcaggtctgcagcacccaggtgcactgtgccgccgagtgtcacccc1200

cccaaggaccacatcgtgaactaccccgccagccacaccaccctgggcgtgcaggacatc1260

agcgccaccgccatgagctgggtgcagaagatcacaggcggcgtcggcctggtggtggcc1320

gtggccgccctgatcctgatcgtggtgctgtgcgtgagcttcagccggcactga1374

<210>2

<211>1326

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>chikve2共有序列

<400>2

atggactggacctggatcctgttcctggtcgctgctgccacaagagtgcacagcagcacc60

aaggacaacttcaacgtgtacaaggccacccggccctacctggcccactgccccgattgc120

ggcgagggccacagctgccacagccccgtggccctggaacggatccggaacgaggccacc180

gacggcaccctgaagatccaggtgtccctgcagatcggcatcaagaccgacgacagccac240

gactggaccaagctgcggtacatggacaaccacatgcccgccgacgccgagagagccggc300

ctgttcgtccggaccagcgccccctgcaccatcaccggcaccatgggccacttcatcctg360

gcccggtgccccaagggcgagacactgaccgtgggcttcaccgacagccggaagatcagc420

cactcctgcacccaccccttccaccacgacccccccgtgatcggccgggagaagttccac480

agcaggccccagcacggcaaagagctgccctgcagcacctacgtgcagagcaccgccgcc540

acaaccgaggaaatcgaggtgcacatgccccccgatacccccgaccggaccctgatgagc600

cagcagagcggcaacgtgaagatcaccgtgaacggccagaccgtgcggtacaagtgcaac660

tgcggcggcagcaacgagggcctgaccaccaccgacaaggtgatcaacaactgcaaggtg720

gaccagtgccacgccgccgtgaccaaccacaagaagtggcagtacaacagccccctggtg780

ccccggaatgccgagctgggcgaccggaagggcaagatccacatccccttccccctggcc840

aacgtgacctgccgggtgcccaaggcccggaaccccaccgtgacctacggcaagaaccag900

gtgatcatgctgctgtaccccgaccaccccaccctgctgtcctaccggaacatgggcgag960

gaacccaactaccaagaggagtgggtcatgcacaagaaagaagtggtgctgaccgtcccc1020

accgagggcctggaagtgacctggggcaacaacgagccctacaagtactggccccagctg1080

tccaccaacggcaccgcccacggccacccccacgagatcatcctgtactactacgagctg1140

taccctaccatgaccgtggtggtggtgtccgtggccacctttatcctgctgtccatggtc1200

ggcatggccgctggcatgtgcatgtgcgccaggaggcgctgtatcaccccctacgagctg1260

acacctggcgccaccgtgccctttctgctgtccctgatctgctgcatccggaccgccaag1320

gcctga1326

<210>3

<211>840

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>chikv衣殼共有序列

<400>3

atggactggacctggatcctgttcctggtggccgctgccacccgggtgcacagcatggaa60

ttcatccccacccagaccttctacaaccggcgctaccagcccagaccctggacccccagg120

cccaccatccaggtgatccggcccaggcccagaccccagaggcaggccgggcagctggca180

cagctgatcagcgccgtgaacaagctgaccatgagagccgtgccccagcagaagcccagg240

cggaaccggaagaacaagaagcagaagcagaaacagcaggccccccagaacaacaccaac300

cagaagaagcagccccccaagaagaagcctgcccagaagaagaagaaacccggcaggcgg360

gagcggatgtgcatgaagatcgagaacgactgcatcttcgaggtgaagcacgagggcaag420

gtgaccggctacgcctgcctggtcggcgacaaagtgatgaagcccgcccacgtgaagggc480

accatcgacaacgccgacctggccaagctggccttcaagcggagcagcaagtacgacctg540

gaatgcgcccagatccccgtgcacatgaagagcgacgccagcaagttcacccacgagaag600

cccgagggctactacaactggcaccacggagccgtgcagtacagcggcggcaggttcacc660

atccccacaggcgccggaaagcccggcgacagcggcaggcccatcttcgacaacaagggc720

cgggtggtggccatcgtgctgggcggagccaacgagggcgccaggaccgccctgagcgtg780

gtgacctggaacaaggacatcgtgaccaagatcacccccgagggcgccgaagagtggtga840

<210>4

<211>1320

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>chikve1共有序列

<400>4

tacgagcacgtgaccgtgatccccaacaccgtgggcgtgccctacaagaccctggtgaac60

aggcccggctacagccccatggtgctggaaatggaactgctgtccgtgaccctggaaccc120

accctgagcctggactacatcacctgcgagtacaagacagtgatccccagcccctacgtg180

aagtgctgcggcaccgccgagtgcaaggacaagaacctgcccgactacagctgcaaggtg240

ttcaccggcgtgtaccccttcatgtggggcggagcctactgcttctgcgacgccgagaac300

acccagctgtccgaggcccacgtggagaagagcgagagctgcaagaccgagttcgccagc360

gcctaccgggcccacacagccagcgccagcgccaagctgcgggtgctgtaccagggcaac420

aacatcaccgtgaccgcctacgccaacggcgaccacgccgtgacagtgaaggacgccaag480

ttcatcgtgggccccatgagcagcgcctggacccccttcgacaacaagatcgtggtgtac540

aagggcgacgtgtacaacatggactacccccccttcggagccggcagacccggccagttc600

ggcgacatccagagccggacccccgagagcaaggacgtgtacgccaatacccagctggtg660

ctgcagagacccgccgtgggcaccgtgcacgtgccttacagccaggcccccagcggcttc720

aagtactggctgaaagagaggggcgccagcctgcagcacaccgcccccttcggctgccag780

atcgccaccaaccccgtgcgggccgtgaattgtgccgtgggcaacatgcccatcagcatc840

gacatccccgaggccgccttcaccagggtggtggacgcccccagcctgaccgacatgagc900

tgcgaggtgcccgcctgcacccacagcagcgacttcggcggcgtggccatcatcaagtac960

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gtggccgtggccgccctgatcctgatcgtggtgctgtgcgtgagcttcagccggcactga1320

<210>5

<211>1273

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>chikve2共有序列

<400>5

cagcaccaaggacaacttcaacgtgtacaaggccacccggccctacctggcccactgccc60

cgattgcggcgagggccacagctgccacagccccgtggccctggaacggatccggaacga120

ggccaccgacggcaccctgaagatccaggtgtccctgcagatcggcatcaagaccgacga180

cagccacgactggaccaagctgcggtacatggacaaccacatgcccgccgacgccgagag240

agccggcctgttcgtccggaccagcgccccctgcaccatcaccggcaccatgggccactt300

catcctggcccggtgccccaagggcgagacactgaccgtgggcttcaccgacagccggaa360

gatcagccactcctgcacccaccccttccaccacgacccccccgtgatcggccgggagaa420

gttccacagcaggccccagcacggcaaagagctgccctgcagcacctacgtgcagagcac480

cgccgccacaaccgaggaaatcgaggtgcacatgccccccgatacccccgaccggaccct540

gatgagccagcagagcggcaacgtgaagatcaccgtgaacggccagaccgtgcggtacaa600

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cgagctgtaccctaccatgaccgtggtggtggtgtccgtggccacctttatcctgctgtc1140

catggtcggcatggccgctggcatgtgcatgtgcgccaggaggcgctgtatcacccccta1200

cgagctgacacctggcgccaccgtgccctttctgctgtccctgatctgctgcatccggac1260

cgccaaggcctga1273

<210>6

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<212>dna

<213>人工序列

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aagggcaccatcgacaacgccgacctggccaagctggccttcaagcggagcagcaagtac480

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aagggccgggtggtggccatcgtgctgggcggagccaacgagggcgccaggaccgccctg720

agcgtggtgacctggaacaaggacatcgtgaccaagatcacccccgagggcgccgaagag780

tggtga786

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<211>457

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>chikve1共有序列

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metasptrpthrtrpileleupheleuvalalaalaalathrargval

151015

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202530

tyrlysthrleuvalasnargproglytyrserprometvalleuglu

354045

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505560

ilethrcysglutyrlysthrvalileproserprotyrvallyscys

65707580

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859095

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100105110

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115120125

serglusercyslysthrgluphealaseralatyrargalahisthr

130135140

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145150155160

thrvalthralatyralaasnglyasphisalavalthrvallysasp

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195200205

propheglyalaglyargproglyglnpheglyaspileglnserarg

210215220

thrprogluserlysaspvaltyralaasnthrglnleuvalleugln

225230235240

argproalavalglythrvalhisvalprotyrserglnalaproser

245250255

glyphelystyrtrpleulysgluargglyalaserleuglnhisthr

260265270

alapropheglycysglnilealathrasnprovalargalavalasn

275280285

cysalavalglyasnmetproileserileaspileproglualaala

290295300

phethrargvalvalaspalaproserleuthraspmetsercysglu

305310315320

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325330335

lystyralaalaserlyslysglylyscysalavalhissermetthr

340345350

asnalavalthrileargglualagluilegluvalgluglyasnser

355360365

glnleuglnileserpheserthralaleualaseralagluphearg

370375380

valglnvalcysserthrglnvalhiscysalaalaglucyshispro

385390395400

prolysasphisilevalasntyrproalaserhisthrthrleugly

405410415

valglnaspileseralathralametsertrpvalglnlysilethr

420425430

glyglyvalglyleuvalvalalavalalaalaleuileleuileval

435440445

valleucysvalserpheserarghis

450455

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<211>441

<212>prt

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<220>

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metasptrpthrtrpileleupheleuvalalaalaalathrargval

151015

hisserserthrlysaspasnpheasnvaltyrlysalathrargpro

202530

tyrleualahiscysproaspcysglygluglyhissercyshisser

354045

provalalaleugluargileargasnglualathraspglythrleu

505560

lysileglnvalserleuglnileglyilelysthraspaspserhis

65707580

asptrpthrlysleuargtyrmetaspasnhismetproalaaspala

859095

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100105110

glythrmetglyhispheileleualaargcysprolysglygluthr

115120125

leuthrvalglyphethraspserarglysileserhissercysthr

130135140

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serargproglnhisglylysgluleuprocysserthrtyrvalgln

165170175

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180185190

thrproaspargthrleumetserglnglnserglyasnvallysile

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thrvalasnglyglnthrvalargtyrlyscysasncysglyglyser

210215220

asngluglyleuthrthrthrasplysvalileasnasncyslysval

225230235240

aspglncyshisalaalavalthrasnhislyslystrpglntyrasn

245250255

serproleuvalproargasnalagluleuglyasparglysglylys

260265270

ilehisilepropheproleualaasnvalthrcysargvalprolys

275280285

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290295300

leutyrproasphisprothrleuleusertyrargasnmetglyglu

305310315320

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325330335

leuthrvalprothrgluglyleugluvalthrtrpglyasnasnglu

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protyrlystyrtrpproglnleuserthrasnglythralahisgly

355360365

hisprohisgluileileleutyrtyrtyrgluleutyrprothrmet

370375380

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glymetalaalaglymetcysmetcysalaargargargcysilethr

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protyrgluleuthrproglyalathrvalpropheleuleuserleu

420425430

ilecyscysileargthralalysala

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505560

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65707580

argasnarglysasnlyslysglnlysglnlysglnglnalaprogln

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100105110

lyslyslyslysproglyargarggluargmetcysmetlysileglu

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asnaspcysilephegluvallyshisgluglylysvalthrglytyr

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alaglylysproglyaspserglyargproilepheaspasnlysgly

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progluglyalagluglutrp

275

<210>10

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<212>prt

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<223>chikve1共有序列

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tyrgluhisvalthrvalileproasnthrvalglyvalprotyrlys

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202530

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505560

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65707580

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100105110

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115120125

alaseralalysleuargvalleutyrglnglyasnasnilethrval

130135140

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145150155160

pheilevalglyprometserseralatrpthrpropheaspasnlys

165170175

ilevalvaltyrlysglyaspvaltyrasnmetasptyrproprophe

180185190

glyalaglyargproglyglnpheglyaspileglnserargthrpro

195200205

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alavalglythrvalhisvalprotyrserglnalaproserglyphe

225230235240

lystyrtrpleulysgluargglyalaserleuglnhisthralapro

245250255

pheglycysglnilealathrasnprovalargalavalasncysala

260265270

valglyasnmetproileserileaspileproglualaalaphethr

275280285

argvalvalaspalaproserleuthraspmetsercysgluvalpro

290295300

alacysthrhisserserasppheglyglyvalalaileilelystyr

305310315320

alaalaserlyslysglylyscysalavalhissermetthrasnala

325330335

valthrileargglualagluilegluvalgluglyasnserglnleu

340345350

glnileserpheserthralaleualaseralaglupheargvalgln

355360365

valcysserthrglnvalhiscysalaalaglucyshisproprolys

370375380

asphisilevalasntyrproalaserhisthrthrleuglyvalgln

385390395400

aspileseralathralametsertrpvalglnlysilethrglygly

405410415

valglyleuvalvalalavalalaalaleuileleuilevalvalleu

420425430

cysvalserpheserarghis

435

<210>11

<211>423

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>chikve2共有序列

<400>11

serthrlysaspasnpheasnvaltyrlysalathrargprotyrleu

151015

alahiscysproaspcysglygluglyhissercyshisserproval

202530

alaleugluargileargasnglualathraspglythrleulysile

354045

glnvalserleuglnileglyilelysthraspaspserhisasptrp

505560

thrlysleuargtyrmetaspasnhismetproalaaspalagluarg

65707580

alaglyleuphevalargthrseralaprocysthrilethrglythr

859095

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100105110

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130135140

proglnhisglylysgluleuprocysserthrtyrvalglnserthr

145150155160

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165170175

aspargthrleumetserglnglnserglyasnvallysilethrval

180185190

asnglyglnthrvalargtyrlyscysasncysglyglyserasnglu

195200205

glyleuthrthrthrasplysvalileasnasncyslysvalaspgln

210215220

cyshisalaalavalthrasnhislyslystrpglntyrasnserpro

225230235240

leuvalproargasnalagluleuglyasparglysglylysilehis

245250255

ilepropheproleualaasnvalthrcysargvalprolysalaarg

260265270

asnprothrvalthrtyrglylysasnglnvalilemetleuleutyr

275280285

proasphisprothrleuleusertyrargasnmetglygluglupro

290295300

asntyrglngluglutrpvalmethislyslysgluvalvalleuthr

305310315320

valprothrgluglyleugluvalthrtrpglyasnasngluprotyr

325330335

lystyrtrpproglnleuserthrasnglythralahisglyhispro

340345350

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355360365

valvalvalservalalathrpheileleuleusermetvalglymet

370375380

alaalaglymetcysmetcysalaargargargcysilethrprotyr

385390395400

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405410415

cysileargthralalysala

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<210>12

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<212>prt

<213>人工序列

<220>

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argproglnargglnalaglyglnleualaglnleuileseralaval

354045

asnlysleuthrmetargalavalproglnglnlysproargargasn

505560

arglysasnlyslysglnlysglnlysglnglnalaproglnasnasn

65707580

thrasnglnlyslysglnproprolyslyslysproalaglnlyslys

859095

lyslysproglyargarggluargmetcysmetlysilegluasnasp

100105110

cysilephegluvallyshisgluglylysvalthrglytyralacys

115120125

leuvalglyasplysvalmetlysproalahisvallysglythrile

130135140

aspasnalaaspleualalysleualaphelysargserserlystyr

145150155160

aspleuglucysalaglnileprovalhismetlysseraspalaser

165170175

lysphethrhisglulysprogluglytyrtyrasntrphishisgly

180185190

alavalglntyrserglyglyargphethrileprothrglyalagly

195200205

lysproglyaspserglyargproilepheaspasnlysglyargval

210215220

valalailevalleuglyglyalaasngluglyalaargthralaleu

225230235240

servalvalthrtrpasnlysaspilevalthrlysilethrproglu

245250255

glyalagluglutrp

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<220>

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pheprocysserglnproprocysthrprocyscystyrglulysglu

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505560

tyrtyrglnleuleuglnalaserleuthrcysserprohisarggln

65707580

argargargglyarglysargargseralathrmetasptrpthrtrp

859095

ileleupheleuvalalaalaalathrargvalhisserserthrlys

100105110

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proaspcysglygluglyhissercyshisserprovalalaleuglu

130135140

argileargasnglualathraspglythrleulysileglnvalser

145150155160

leuglnileglyilelysthraspaspserhisasptrpthrlysleu

165170175

argtyrmetaspasnhismetproalaaspalagluargalaglyleu

180185190

phevalargthrseralaprocysthrilethrglythrmetglyhis

195200205

pheileleualaargcysprolysglygluthrleuthrvalglyphe

210215220

thraspserarglysileserhissercysthrhisprophehishis

225230235240

aspproprovalileglyargglulysphehisserargproglnhis

245250255

glylysgluleuprocysserthrtyrvalglnserthralaalathr

260265270

thrglugluilegluvalhismetproproaspthrproaspargthr

275280285

leumetserglnglnserglyasnvallysilethrvalasnglygln

290295300

thrvalargtyrlyscysasncysglyglyserasngluglyleuthr

305310315320

thrthrasplysvalileasnasncyslysvalaspglncyshisala

325330335

alavalthrasnhislyslystrpglntyrasnserproleuvalpro

340345350

argasnalagluleuglyasparglysglylysilehisileprophe

355360365

proleualaasnvalthrcysargvalprolysalaargasnprothr

370375380

valthrtyrglylysasnglnvalilemetleuleutyrproasphis

385390395400

prothrleuleusertyrargasnmetglyglugluproasntyrgln

405410415

gluglutrpvalmethislyslysgluvalvalleuthrvalprothr

420425430

gluglyleugluvalthrtrpglyasnasngluprotyrlystyrtrp

435440445

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450455460

ileleutyrtyrtyrgluleutyrprothrmetthrvalvalvalval

465470475480

servalalathrpheileleuleusermetvalglymetalaalagly

485490495

metcysmetcysalaargargargcysilethrprotyrgluleuthr

500505510

proglyalathrvalpropheleuleuserleuilecyscysilearg

515520525

thralalysalaargglyarglysargargseralathrmetasptrp

530535540

thrtrpileleupheleuvalalaalaalathrargvalhissertyr

545550555560

gluhisvalthrvalileproasnthrvalglyvalprotyrlysthr

565570575

leuvalasnargproglytyrserprometvalleuglumetgluleu

580585590

leuservalthrleugluprothrleuserleuasptyrilethrcys

595600605

glutyrlysthrvalileproserprotyrvallyscyscysglythr

610615620

alaglucyslysasplysasnleuproasptyrsercyslysvalphe

625630635640

thrglyvaltyrprophemettrpglyglyalatyrcysphecysasp

645650655

alagluasnthrglnleuserglualahisvalglulyssergluser

660665670

cyslysthrgluphealaseralatyrargalahisthralaserala

675680685

seralalysleuargvalleutyrglnglyasnasnilethrvalthr

690695700

alatyralaasnglyasphisalavalthrvallysaspalalysphe

705710715720

ilevalglyprometserseralatrpthrpropheaspasnlysile

725730735

valvaltyrlysglyaspvaltyrasnmetasptyrproprophegly

740745750

alaglyargproglyglnpheglyaspileglnserargthrproglu

755760765

serlysaspvaltyralaasnthrglnleuvalleuglnargproala

770775780

valglythrvalhisvalprotyrserglnalaproserglyphelys

785790795800

tyrtrpleulysgluargglyalaserleuglnhisthralaprophe

805810815

glycysglnilealathrasnprovalargalavalasncysalaval

820825830

glyasnmetproileserileaspileproglualaalaphethrarg

835840845

valvalaspalaproserleuthraspmetsercysgluvalproala

850855860

cysthrhisserserasppheglyglyvalalaileilelystyrala

865870875880

alaserlyslysglylyscysalavalhissermetthrasnalaval

885890895

thrileargglualagluilegluvalgluglyasnserglnleugln

900905910

ileserpheserthralaleualaseralaglupheargvalglnval

915920925

cysserthrglnvalhiscysalaalaglucyshisproprolysasp

930935940

hisilevalasntyrproalaserhisthrthrleuglyvalglnasp

945950955960

ileseralathralametsertrpvalglnlysilethrglyglyval

965970975

glyleuvalvalalavalalaalaleuileleuilevalvalleucys

980985990

valserpheserarghis

995

<210>15

<211>2954

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>chikvenv共有序列

<400>15

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gtggtgtccgtggccacctttatcctgctgtccatggtcggcatggccgctggcatgtgc1440

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aacaggcccggctacagccccatggtgctggaaatggaactgctgtccgtgaccctggaa1740

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tacaagggcgacgtgtacaacatggactacccccccttcggagccggcagacccggccag2220

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caggacatcagcgccaccgccatgagctgggtgcagaagatcacaggcggcgtcggcctg2880

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<210>16

<211>980

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>chikvenv共有序列

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serleualaileprovalmetcysleuleualaasnthrthrphepro

151015

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gluthrleuargmetleugluaspasnvalmetargproglytyrtyr

354045

glnleuleuglnalaserleuthrcysserprohisargglnargarg

505560

argglyarglysargargseralathrmetasptrpthrtrpileleu

65707580

pheleuvalalaalaalathrargvalhisserserthrlysaspasn

859095

pheasnvaltyrlysalathrargprotyrleualahiscysproasp

100105110

cysglygluglyhissercyshisserprovalalaleugluargile

115120125

argasnglualathraspglythrleulysileglnvalserleugln

130135140

ileglyilelysthraspaspserhisasptrpthrlysleuargtyr

145150155160

metaspasnhismetproalaaspalagluargalaglyleupheval

165170175

argthrseralaprocysthrilethrglythrmetglyhispheile

180185190

leualaargcysprolysglygluthrleuthrvalglyphethrasp

195200205

serarglysileserhissercysthrhisprophehishisasppro

210215220

provalileglyargglulysphehisserargproglnhisglylys

225230235240

gluleuprocysserthrtyrvalglnserthralaalathrthrglu

245250255

gluilegluvalhismetproproaspthrproaspargthrleumet

260265270

serglnglnserglyasnvallysilethrvalasnglyglnthrval

275280285

argtyrlyscysasncysglyglyserasngluglyleuthrthrthr

290295300

asplysvalileasnasncyslysvalaspglncyshisalaalaval

305310315320

thrasnhislyslystrpglntyrasnserproleuvalproargasn

325330335

alagluleuglyasparglysglylysilehisilepropheproleu

340345350

alaasnvalthrcysargvalprolysalaargasnprothrvalthr

355360365

tyrglylysasnglnvalilemetleuleutyrproasphisprothr

370375380

leuleusertyrargasnmetglyglugluproasntyrglngluglu

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trpvalmethislyslysgluvalvalleuthrvalprothrglugly

405410415

leugluvalthrtrpglyasnasngluprotyrlystyrtrpprogln

420425430

leuserthrasnglythralahisglyhisprohisgluileileleu

435440445

tyrtyrtyrgluleutyrprothrmetthrvalvalvalvalserval

450455460

alathrpheileleuleusermetvalglymetalaalaglymetcys

465470475480

metcysalaargargargcysilethrprotyrgluleuthrprogly

485490495

alathrvalpropheleuleuserleuilecyscysileargthrala

500505510

lysalaargglyarglysargargseralathrmetasptrpthrtrp

515520525

ileleupheleuvalalaalaalathrargvalhissertyrgluhis

530535540

valthrvalileproasnthrvalglyvalprotyrlysthrleuval

545550555560

asnargproglytyrserprometvalleuglumetgluleuleuser

565570575

valthrleugluprothrleuserleuasptyrilethrcysglutyr

580585590

lysthrvalileproserprotyrvallyscyscysglythralaglu

595600605

cyslysasplysasnleuproasptyrsercyslysvalphethrgly

610615620

valtyrprophemettrpglyglyalatyrcysphecysaspalaglu

625630635640

asnthrglnleuserglualahisvalglulysserglusercyslys

645650655

thrgluphealaseralatyrargalahisthralaseralaserala

660665670

lysleuargvalleutyrglnglyasnasnilethrvalthralatyr

675680685

alaasnglyasphisalavalthrvallysaspalalyspheileval

690695700

glyprometserseralatrpthrpropheaspasnlysilevalval

705710715720

tyrlysglyaspvaltyrasnmetasptyrpropropheglyalagly

725730735

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740745750

aspvaltyralaasnthrglnleuvalleuglnargproalavalgly

755760765

thrvalhisvalprotyrserglnalaproserglyphelystyrtrp

770775780

leulysgluargglyalaserleuglnhisthralapropheglycys

785790795800

glnilealathrasnprovalargalavalasncysalavalglyasn

805810815

metproileserileaspileproglualaalaphethrargvalval

820825830

aspalaproserleuthraspmetsercysgluvalproalacysthr

835840845

hisserserasppheglyglyvalalaileilelystyralaalaser

850855860

lyslysglylyscysalavalhissermetthrasnalavalthrile

865870875880

argglualagluilegluvalgluglyasnserglnleuglnileser

885890895

pheserthralaleualaseralaglupheargvalglnvalcysser

900905910

thrglnvalhiscysalaalaglucyshisproprolysasphisile

915920925

valasntyrproalaserhisthrthrleuglyvalglnaspileser

930935940

alathralametsertrpvalglnlysilethrglyglyvalglyleu

945950955960

valvalalavalalaalaleuileleuilevalvalleucysvalser

965970975

pheserarghis

980

<210>17

<211>18

<212>prt

<213>智人(homosapiens)

<400>17

metasptrpthrtrpileleupheleuvalalaalaalathrargval

151015

hisser

<210>18

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>e1優(yōu)勢(shì)表位

<400>18

hissermetthrasnalavalthrile

15

<210>19

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>e2優(yōu)勢(shì)表位

<400>19

ileileleutyrtyrtyrgluleutyr

15

<210>20

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>aclvgdkvm

<400>20

alacysleuvalglyasplysvalmet

15