本發(fā)明涉及一種海洋活性物質(zhì)，特別涉及一種綠側(cè)花?？鼓[瘤寡肽及其用途。
背景技術(shù)：
：?？?Seaanemone)屬于原始海洋生物，六放珊瑚亞綱的一目，有六科三十七種，分布廣泛，常見(jiàn)于熱帶和溫帶海底巖石和泥沙中。目前，各國(guó)科學(xué)家對(duì)?？舅剽涬x子通道和鈉離子通道活性做了大量的研究；另外，其降血壓、抗真菌和抗腫瘤的研究也有大量報(bào)道。但是由于?？舅睾繕O少、提取困難，嚴(yán)重制約其生理學(xué)和病理學(xué)方面的研究。參考海洋生物活性肽的研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)用酶解法制備生物活性肽已經(jīng)成為新的研究熱點(diǎn)，提取得到的活性肽既能補(bǔ)充機(jī)體營(yíng)養(yǎng)成分，又具有抗氧化、抗凝血、降血壓、抗腫瘤等活性。前列腺癌(ProstatecancerPCa)是一種早期難被發(fā)現(xiàn)、卻高危性的疾病，對(duì)比歐美國(guó)家，目前我國(guó)前列腺癌發(fā)病率要低得多，但是近年來(lái)由于人們飲食不均衡和環(huán)境污染，其發(fā)病率也有明顯的上升趨勢(shì)，成為威脅我國(guó)男性健康的重要因素。前列腺癌的發(fā)生發(fā)展與宿主免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤失去調(diào)控有關(guān)。如果得不到及時(shí)有效的治療將發(fā)展成為雄性激素非依賴性前列腺癌，前列腺癌晚期加上骨轉(zhuǎn)移將給治療帶來(lái)極大地難度。因此，尋找既能提高人體免疫能力又能有效誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的活性物就顯得尤其重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于一種綠側(cè)花?？鼓[瘤寡肽，既能提高人體免疫能力，又對(duì)前列腺癌細(xì)胞DU-145有明顯的增殖抑制作用，具有較好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明還提供了上述綠側(cè)花?？鼓[瘤寡肽的用途。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：一種綠側(cè)花?？鼓[瘤寡肽，其氨基酸序列為：Tyr-Val-Pro-Gly-Pro。本發(fā)明從綠側(cè)花?？庵刑崛～@得活性肽，并進(jìn)行了分離純化，首次報(bào)道了所提取的寡肽具有抗前列腺癌作用。Tyr：酪氨酸(Y)，Val：纈氨酸(V)，Pro：脯氨酸(P)，Gly：甘氨酸(G)。一種綠側(cè)花海葵抗腫瘤寡肽的用途，綠側(cè)花?？鼓[瘤寡肽作為原料制備抗腫瘤藥物的應(yīng)用。作為優(yōu)選，綠側(cè)花海葵抗腫瘤寡肽作為原料制備抗前列腺癌藥物的應(yīng)用。一種綠側(cè)花海葵抗腫瘤寡肽的用途綠側(cè)花?？鼓[瘤寡肽作為原料制備抗前列腺癌保健食品的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是：既能提高人體免疫能力，又對(duì)前列腺癌細(xì)胞DU-145有明顯的增殖抑制作用，具有較好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。附圖說(shuō)明圖1四種不同酶解產(chǎn)物對(duì)DU145細(xì)胞增殖抑制效果。圖2不同分子量產(chǎn)物對(duì)DU-145細(xì)胞增殖抑制。圖3AAP-I的DEAE-SepharoseFastFlow快速陰離子交換層析曲線圖。圖4陰離子交換柱洗脫后三個(gè)峰產(chǎn)物對(duì)DU-145細(xì)胞增殖抑制。圖5AAP-I-1經(jīng)葡聚糖凝膠G-25柱層析曲圖。圖6G-25各洗脫峰產(chǎn)物DU-145細(xì)胞增殖活性示意圖。圖7AAP-I-1-2的C18-HPLC圖。圖8AAP-H的C18-HPLC圖。具體實(shí)施方式下面通過(guò)具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說(shuō)明。本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。實(shí)施例：1、材料1.1原料綠側(cè)花?？翰杉凵胶Ｓ蛞吧？?，經(jīng)浙江海洋大學(xué)趙盛龍教授鑒定為綠側(cè)花?？?Anthopleuraanjunae)。1.2試劑和儀器堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶：亞太恒信生物科技有限公司；甲醇、乙腈：色譜純，德國(guó)默克公司；聚凝胺：上海博普生物技術(shù)有限公司；F12培養(yǎng)基：美國(guó)Gibco公司；無(wú)支原體胎牛血清(FBS)：杭州四季青生物制品有限公司。人前列腺癌細(xì)胞DU-145購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。CF16RN型高速冷凍離心機(jī)、L8900氨基酸自動(dòng)分析儀：日立儀器有限公司；Agilent-1260型高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；ALPHA1-4/LDplus超濾系統(tǒng)：德國(guó)默克密理博公司；Forma3111型CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo公司；倒置顯微鏡：日本OLYMPUS公司；WRO-70型超純水機(jī)：杭州萬(wàn)潔水處理設(shè)備公司；酶標(biāo)儀：美國(guó)BioRad科技公司。2、方法2.1材料預(yù)處理取新鮮野生綠側(cè)花海葵置于室溫干凈海水中飼養(yǎng)一天，清洗除去雜質(zhì)。用剪刀從中間剖開(kāi)，置于大燒杯中，并加水覆蓋，置于-20℃冰箱中冷凍12h，再置于室溫自然解凍，反復(fù)三次，擠出觸手毒液，然后用自來(lái)沖洗至得到白色?？狻８咚賱驖{機(jī)勻漿(10000r/min，5min)，將勻漿浸泡于異丙醇中去脂，每4h更換一次，連續(xù)換3次，去脂結(jié)束后用純水將異丙醇沖洗干凈，將?？鈩驖{置于通風(fēng)櫥風(fēng)中風(fēng)干至無(wú)水滴，分裝置于-20℃保存?zhèn)溆谩?.2綠側(cè)花?？嚓P(guān)指標(biāo)測(cè)定2.2.1基礎(chǔ)成分測(cè)定參考GB5009.3-2010測(cè)定水分；參考GB/T5009.4-2010測(cè)灰分；參考GB50095-2010測(cè)粗蛋白含量；參考GB/T5009.6-2003測(cè)定?？獾拇种竞?。2.2.2綠側(cè)花?？鞍踪|(zhì)的氨基酸組成及含量分析參考GB/T5009.124-2003，稱取海葵肉勻漿樣品經(jīng)6mol/L鹽酸水解后，用日立L8900氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定氨基酸的組成及含量。2.3酶種的篩選2.3.1酶解分別取10g經(jīng)過(guò)預(yù)處理的?？鈩驖{加50mL純凈水，加酶量為1000u/g根據(jù)各種酶試劑盒上的最佳pH和溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)，如表1條件進(jìn)行酶解。酶解前用0.5mol/L的氫氧化鈉和0.5mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)至所需pH，將樣品置于恒溫水浴鍋中酶解，酶解時(shí)勻速緩慢攪拌。酶解結(jié)束后在水浴鍋中煮沸滅活15min，然后用三層紗布過(guò)濾除去粗雜質(zhì)，濾液在4℃轉(zhuǎn)速為12000rpm條件下離心10min，連續(xù)離心兩次。收集上清液用0.45μm針式濾膜過(guò)濾、調(diào)節(jié)pH＝7、旋蒸濃縮、冷凍干燥、產(chǎn)物分裝置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。?酶解條件2.3.2MTT法檢測(cè)產(chǎn)物對(duì)DU-145細(xì)胞增殖抑制活性細(xì)胞培養(yǎng)：前列腺癌細(xì)胞DU-145用含10％太牛血清的F12培養(yǎng)液于37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70％～80％匯合度時(shí)進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)。將DU-145細(xì)胞接種于96孔板中。設(shè)置對(duì)照組及藥物組，藥物組每孔加入濃度為5mg/mL的含酶解產(chǎn)物的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h后加入200uL含有10％MTT的PBS緩沖液，并孵育4h。吸棄MTT培養(yǎng)液，加入DMSO震蕩反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度A值，計(jì)算抑制率(IR),計(jì)算公式為：IR＝[(對(duì)照組A值-藥物組A值)/對(duì)照組A值]×100％。2.4正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化綠側(cè)花?？骨傲邢侔┕央牡闹苽涔に囃ㄟ^(guò)2.3確定最佳的蛋白酶后，以L16(45)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化綠側(cè)花?？骨傲邢侔┕央牡闹苽涔に?，以確定最佳的溫度、時(shí)間、pH、加酶量和料液比，產(chǎn)物經(jīng)濃縮冷凍干燥并采用MTT法檢測(cè)對(duì)DU-145增殖抑制活性，正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平如表2。表2正交實(shí)驗(yàn)中酶解條件的因素和水平2.5酶解液超濾按照2.4確定的最佳酶解條件進(jìn)行酶解，制備綠側(cè)花海葵抗腫瘤肽(AnthopleuraanjunaeAnti-tumorPeptide---AAP)，用ALPHA1-4/LDplus超濾系統(tǒng)8KD和20KD的濾膜分級(jí)，并按分子量由小到大命名為AAP-I(MW＜8KD)、AAP-II(8KD≤MW＜20KD)、AAP-III(MW≥20KD)。MTT法同2.3篩選活性最好組分。2.6DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換層析提前活化、平衡交換柱(2cm×35cm)，樣品濃度為30mg/mL溶液，超聲5min，然后用0.45μm針式濾膜過(guò)濾，每次上樣3mL，分別以純凈水、0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L的NaCl溶液梯度洗脫，各梯度分別洗脫30min，流速為1mL/min，用DBS-100-LCD電腦全自動(dòng)部分收集器每4min收集一管，于280nm檢測(cè)吸光度，并根據(jù)吸光度曲線合并洗脫峰，發(fā)現(xiàn)有三個(gè)峰。產(chǎn)物濃縮冷凍干燥，并命名為AAP-I-1、AAP-I-2、AAP-I-3。分裝保存于-20℃冰箱中備用。MTT法同2.3篩選活性最好組分。2.7SephadexG25凝膠層析法分離純化將對(duì)DU-145增殖抑制率最高的AAP-I-1采用G-25凝膠層析繼續(xù)分離純化，將樣品配制成30mg/mL溶液，超聲5min，然后用0.45μm針式濾膜過(guò)濾，每次加3mL到處理好的SephadexG-25層析柱(2cm×50cm)，用超純水洗脫，流速為1.0mL/min，用DBS-100-LCD電腦全自動(dòng)部分收集器每4min收集一管，于280nm檢測(cè)吸光度，并根據(jù)吸光度曲線合并洗脫峰發(fā)現(xiàn)有三個(gè)峰。產(chǎn)物濃縮冷凍干燥，并命名為AAP-I-1-1、AAP-I-1-2、AAP-I-1-3。MTT法同2.3篩選活性最好組分。2.8反相高效液相色譜分離純化將對(duì)DU-145增殖抑制率最高的AAP-I-1-2配制成5mg/mL溶液經(jīng)0.22μm針式濾膜過(guò)濾后用反相高效液相色譜分離純化。進(jìn)樣前平衡Agilent1260ZORBAXSB-C18(9.4mm×250mm)柱，柱溫30℃；實(shí)驗(yàn)室時(shí)樣品按300μg/mL每次進(jìn)樣100μL，洗脫液用乙腈超純水混合液按1mL/min洗脫，0min～15min乙腈(20％)～(50％)，15min～30min：乙腈(50％)；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。純品采用PPSQ-31A蛋白質(zhì)測(cè)序儀測(cè)定肽鏈氨基酸序列。2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPASS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，并采用表示。3結(jié)果與分析3.1綠側(cè)花?？A(chǔ)成份檢測(cè)結(jié)果綠側(cè)花?？幕A(chǔ)成份如表3，從表3中可以看出，綠側(cè)花?？庵泻胸S富的粗蛋白，占19.76％，粗脂肪含量較低，僅為0.89％，表明綠側(cè)花?？且环N高蛋白，低脂肪的海產(chǎn)品。表3綠側(cè)花?？A(chǔ)成分(g/100g,濕重)綠側(cè)花海葵的氨基酸組成及含量如表4。從表4可以看出，綠側(cè)花?？陌被岱N類比較齊全，必須氨基酸含量占總氨基酸含量的24.31％；鮮味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸)占總氨基酸含量高達(dá)50.58％，這也是綠側(cè)花?？兜栗r美的原因之一。根據(jù)表5，根據(jù)FAO/WHO對(duì)氨基酸評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)說(shuō)，綠側(cè)花?？仨毎被嶂g比值不太符合人體的氨基酸平衡要求。但有研究表明，親水性多肽(含有Asp、Thr、Ser、Glu、Arg、Lys、His、Gln等親水性氨基酸)可通過(guò)靜電吸引方式，特異性作用于腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致其細(xì)胞膜迅速破裂，細(xì)胞內(nèi)容物滲漏，最終引起腫瘤細(xì)胞死亡。綠側(cè)花?？饷附猱a(chǎn)物的親水性氨基酸占總氨基酸含量的49.3％，親水性氨基酸的高比例可能與其功能有關(guān)。綜上所述，?？附猱a(chǎn)物可以用于與抗腫瘤相關(guān)的藥品、食品或者食品添加劑的開(kāi)發(fā)。表4綠側(cè)花?？陌被峤M成及含量(g/100g，干重)氨基酸Aminoacid含量Content氨基酸Aminoacid含量Content天門冬氨酸Asp＊7.067酪氨酸Tyr1.004蘇氨酸Thr#2.700苯丙氨酸Phe#1.643絲氨酸Ser3.198賴氨酸Lys#3.099谷氨酸Glu＊8.988組氨酸His0.675甘氨酸Gly＊13.084精氨酸Arg6.693丙氨酸Ala＊4.111脯氨酸Pro4.649胱氨酸Cys0.263總氨基酸TAA65.74纈氨酸Val#2.572鮮味氨基酸FTAA33.25蛋氨酸Met#1.176必需氨基酸EAA16.01異亮氨酸Ile#1.868F/T(％)50.58％亮氨酸Leu#2.951E/T(％)24.35％注：“＊”表示鮮味氨基酸；“#”表示必須氨基酸。表5綠側(cè)花海葵蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)3.2四種不同蛋白酶解產(chǎn)物MTT活性測(cè)試結(jié)果結(jié)果如圖1所示，胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)物對(duì)DU-145細(xì)胞增殖抑制率分別是24.98±6.04％、28.55±5.29％、31.66±4.04％和73.7±4.31％，對(duì)DU-145細(xì)胞增殖抑制活性順序由大到小分別是：堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶，所以堿性蛋白酶為所需要的酶種。3.3Alcalase正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以料液比、溫度、pH值、加酶量和時(shí)間5個(gè)因素，以IR值才參考指標(biāo)，考察Alcalase蛋白酶最不同條件下產(chǎn)物對(duì)前列腺癌細(xì)胞DU-145增殖抑制活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6：表6堿性蛋白酶酶解法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用極差分析法對(duì)上表進(jìn)行分析，從Rj值大小可以看出，A(料液比)>E(時(shí)間)>D(溫度)>C(加酶量)>B(pH值)。而IR值最大時(shí)的水解條件為A4B4C3D1E3.即料液比為1:5、pH為11、加酶量為2000U/g、溫度為35℃、時(shí)間為6h。3.4綠側(cè)花?？骨傲邢侔┕央某醪椒蛛x結(jié)果將堿性蛋白酶酶解液超濾后初步分離得到的AAP-I、AAP-II、AAP-III三個(gè)組分經(jīng)MTT法活性篩選后，如圖2所示：三個(gè)組分對(duì)DU-145細(xì)胞的增殖抑制率分別是87.18±1.41％、74.36±2.30％、83.05±2.03％。說(shuō)明組分AAP-I對(duì)DU-145增殖抑制效果最好，所以將AAP-I進(jìn)行陰離子交換層析。3.5DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換層析結(jié)果將超濾得到的AAP-I用DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換層析得到三個(gè)峰產(chǎn)物，分別命名為AAP-I-1、AAP-I-2、AAP-I-3，如圖3。將各峰產(chǎn)物濃縮冷凍干燥，并采用MTT法檢測(cè)其對(duì)DU-145的增殖抑制活性。圖4結(jié)果顯示，當(dāng)濃度為5mg/mL時(shí)，AAP-I-1、AAP-I-2、AAP-I-3三個(gè)峰產(chǎn)物對(duì)DU-145增殖抑制率分別為：37.12±1.70％、34.78±2.20％、24.21±1.6％，證明AAP-I-1對(duì)DU-145細(xì)胞增殖抑制率最高，所以將AAP-I-1進(jìn)一步分離純化。3.6SephadexG-25凝膠層析分離結(jié)果將2.5中分離的AAP-I-1采用SephadexG-25凝膠層析分離，結(jié)果得到如圖5的三個(gè)峰，分別命名為AAP-I-1-1、AAP-I-1-2、AAP-I-1-3，收集后冷凍干燥，分裝于-20℃冰箱保存。SephadexG-25凝膠層析的各個(gè)峰示意圖將三個(gè)峰產(chǎn)物采用MTT法檢測(cè)對(duì)DU-145增殖活性，圖6結(jié)果顯示，三個(gè)峰產(chǎn)物5mg/mL，24h對(duì)DU-145的增值抑制率分別是：30.01±2.16％、46.14±2.29％、40.53±1.76％，說(shuō)明SAAP-I--1-2對(duì)DU-145增殖抑制最好。3.7AAP-I-1-2經(jīng)高效液相分離結(jié)果將AAP-I-1-2經(jīng)HPLC純化后結(jié)果如圖7所示，收集主峰濃縮冷凍干燥并命名為AAP-H，進(jìn)行MTT活性測(cè)試，結(jié)果對(duì)DU-145增殖抑制率為49.14±2.29％，表明主峰AAP-H應(yīng)該是AAP-I-1-2的主要活性物，AAP-H經(jīng)高效液相檢測(cè)基本單一樣品，純度大于95％，符合氨基酸序列測(cè)定要求，AAP-H高效液相檢測(cè)如圖8。3.8氨基酸序列測(cè)定結(jié)果氨基酸測(cè)序結(jié)果為：Tyr-Val-Pro-Gly-Pro(SEQIDNo：1)。4結(jié)論通過(guò)篩選確定堿性蛋白酶為最佳酶種，采用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化酶解法提取?？鼓[瘤肽的最佳工藝條件為:按照料液比為1:5(W/V)、pH＝11、加酶量為2000u/g、35℃條件下酶解6小時(shí)。通過(guò)超濾、陰離子交換層析、G-25凝膠層析以及反向高效液相等方法分離純化，以產(chǎn)物對(duì)DU-145增殖抑制率為指標(biāo)，最終純化得到序列為Tyr-Val-Pro-Gly-Pro的肽鏈。當(dāng)前制備生物活性肽比較常用的方法有三種：一是化學(xué)合成方法制備生物活性肽；二是以生物體或者組織為原料通過(guò)各種分離手段直接分離提??；三是采用酶解法降解生物組織或者大分子產(chǎn)物制備生物活性肽。由于蛋白酶酶解法生產(chǎn)生物活性肽具有安全性高、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率相對(duì)比較高的優(yōu)點(diǎn)，因此該方法已經(jīng)成為近年來(lái)制備活性肽的研究熱點(diǎn)。由于海洋生物生長(zhǎng)環(huán)境獨(dú)特于陸生生物，有的甚至是生長(zhǎng)在極高壓或極低溫等環(huán)境中，造成海洋生物在生長(zhǎng)過(guò)程中形成結(jié)構(gòu)獨(dú)特，功能新穎的活性肽。這種活性肽部分以天然狀態(tài)存在，部分作為蛋白質(zhì)大分子的結(jié)構(gòu)域，蛋白酶通過(guò)對(duì)特定的點(diǎn)位剪切，可以得到活性比蛋白質(zhì)更好的肽鏈，這些生物活性肽在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗菌、抗血栓、抗高血壓、調(diào)節(jié)胃腸道運(yùn)動(dòng)、清除自由基、抗病毒、促進(jìn)礦物元素吸收和抗癌方面發(fā)揮重要的作用?，F(xiàn)有研究表明：肽鏈的生物活性主要受氨基酸組分和肽鏈分子量大小影響，活性肽比蛋白質(zhì)、多聚肽和單純的氨基酸具有更強(qiáng)的生物活性。另外肽鏈中的Trp、Tyr、Met、Gly、Lys、His和Pro等芳香族氨基酸或者疏水性氨基酸能很好地增強(qiáng)肽鏈的生物活性。本發(fā)明制備得到的肽鏈中含有Tyr、Pro和Gly，認(rèn)為這種結(jié)構(gòu)可能是其具有抗腫瘤活性的重要原因之一。綜上所述，綠側(cè)花?？馐且环N蛋白含量很高的自然資源，通過(guò)酶解法制備的肽，可以用于抗前列腺癌相關(guān)的藥品開(kāi)發(fā)或研制成保健食品。以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。SEQUENCELISTING<110>浙江海洋大學(xué)<120>一種綠側(cè)花?？鼓[瘤寡肽及其用途<130>2016.11<160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>5<212>PRT<213>綠側(cè)花海葵<400>1TyrValProGlyPro15當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3