本發(fā)明涉及生物技術領域中與馬鈴薯淀粉合成相關的蛋白StTrxF及其編碼基因與應用。

背景技術：

隨著中國社會經(jīng)濟的快速發(fā)展和隨之而來的汽車保有量的增加，石油消費快速遞增，進口依賴度日益增加，已經(jīng)對我國能源安全和經(jīng)濟發(fā)展形成了巨大影響和制約。發(fā)展石油的替代燃料已成當務之急，其中燃料乙醇是目前世界上使用量最大、最現(xiàn)實可行的替代石油的生物燃料。加工燃料乙醇的原料包括淀粉類的玉米、薯類等，糖類的甘蔗、甜菜等以及纖維素類的秸稈等。

馬鈴薯是世界上主要作物之一，繼小麥、玉米和水稻之后排在第四位。馬鈴薯產(chǎn)量高、適應性強，用途十分廣泛，是很好的加工原料，也是世界上最有發(fā)展前景的高產(chǎn)經(jīng)濟作物之一。馬鈴薯主要收獲物為地下膨大的塊莖，富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、粗纖維和多種維生素、礦物質(zhì)，營養(yǎng)豐富，用途廣泛，主要供食用，是重要的糧食、蔬菜兼用作物。近年來，中國馬鈴薯生產(chǎn)發(fā)展較快，栽培面積和總產(chǎn)量均有較大幅度提高，已躍居世界第1位，在保障我國糧食安全、促進農(nóng)民增收和發(fā)展民族工業(yè)等方面已發(fā)揮了一定作用。

淀粉是植物通過光合作用產(chǎn)生的一種多糖高分子化合物，淀粉生物合成過程中有四種關鍵酶，即：腺嘌呤-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，AGpase)、淀粉合成酶(starch synthase)，分支酶(branching enzyme)及去分支酶(de-branching enzyme)。在AGPase的作用下，葡萄糖-1-磷酸(Glu-1-P)與ATP作用生成ADP-葡萄糖(ADP-Glu)，隨后ADP-Glu合成具有一定結(jié)構特性的淀粉結(jié)晶體。AGPase是淀粉合成過程中的限速酶，催化淀粉合成的第一步，其活性的改變將直接影響著淀粉的合成速率，直接決定貯藏組織中淀粉積累的水平。

硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的多功能活性蛋白，分子量約為12kDa，含有一個氧化還原活性的二硫鍵，可通過還原靶蛋白中的二硫鍵參與細胞包括酶活性的調(diào)節(jié)(Holmgren 1989；Arnér和Holmgren 2000)、轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控(Schenk等1994；Hirota等1999；Chae等1994)等在內(nèi)的一系列生化反應。

技術實現(xiàn)要素：

技術問題：為了解決現(xiàn)有技術的缺陷，本發(fā)明提供了蛋白StTrxF、編碼基因，還提供了上述蛋白和編碼基因在提高植物淀粉含量中的應用。

技術方案：本發(fā)明所提供了與淀粉合成相關的蛋白，名稱為StTrxF，來源于馬鈴薯(Solanum tuberosum)，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物組織中淀粉含量相關的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還提供了編碼蛋白StTrxF的基因。

所述基因，與碳氮代謝相關蛋白，為如下(1)-(3)中任一所述的基因：

(1)其核苷酸序列為SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼植物組織中淀粉含量相關蛋

白的DNA分子；

(3)與(1)或(2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或者至少具有99％同源性且編碼植物組織中淀粉含量相關蛋白的DNA分子。

上述嚴格條件可為用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列SEQ ID NO：1由549個堿基組成，編碼序列表中序列SEQ ID NO：2所示的蛋白。

本發(fā)明還提供了含有所述與淀粉合成相關蛋白的編碼基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。

所述重組載體為將上述基因插入表達載體中即得。

具體地，所述重組載體是在載體pCBGUS的多克隆位點間插入上述編碼基因得到的。

其中，所述載體pCBGUS是通過包括如下步驟的方法得到的：

(1)將pCAMBIA1301載體經(jīng)過Hind III和EcoR I雙酶切，回收載體大片段；

(2)將pBI 121載體經(jīng)過Hind III和EcoR I雙酶切，回收包含gusA基因的片段；

(3)將步驟(1)中回收的載體大片段與步驟(2)中回收的包含gusA基因的片段連接，即得載體pCBGUS。

所述pCAMBIA1301載體購自CAMBIA公司；所述pBI 121載體購自Clontech公司。

本發(fā)明還提供了上述擴增與淀粉合成相關蛋白的編碼基因全長或其任一片段的引物對。

具體地，所述引物對序列如下：

StTrxF-GC-F：5’-AATAGCAAAAATGGCGTTACAAGT-3’

StTrxF-GC-R：5’-TTTAACTTGATCGCACACCCTC-3’

本發(fā)明還提供了蛋白StTrxF、其編碼基因或其重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌在調(diào)節(jié)植物組織中淀粉含量中的應用；所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。

本發(fā)明還提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括以下步驟：將權利要求1所述蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参?，即得?/p>

具體地，權利要求1所述蛋白的編碼基因是通過權利要求4或5所述的重組載體導入目的植物；所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物。

所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物優(yōu)選擬南芥。

有益效果：本發(fā)明所提供的StTrxF基因所編碼的蛋白可大大提高AGPase和可溶性淀粉合酶的活性，該基因的表達也可以提高淀粉的生物合成。

本發(fā)明所提供的StTrxF蛋白及其編碼基因在提高淀粉含量上具有重要的應用價值，為提高馬鈴薯淀粉含量的研究提供重要的依據(jù)，將在農(nóng)業(yè)領域具有廣闊的應用空間和市場前景。

本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供的StTrxF蛋白及其編碼基因，將該基因?qū)胍吧蛿M南芥中，得到轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。研究發(fā)現(xiàn)，與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中的淀粉含量顯著提高，說明該蛋白及其編碼基因在提高擬南芥葉片中的淀粉含量中具有重要的應用價值，將在農(nóng)業(yè)領域具有廣闊的應用空間和市場前景。

附圖說明

圖1為馬鈴薯StTrxF基因植物表達載體圖。

圖2為StTrxF轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的PCR檢測結(jié)果圖。

圖3為葡萄糖標準曲線。

圖4為StTrxF轉(zhuǎn)基因擬南芥植株葉片中淀粉含量圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但不限制本發(fā)明。

下述實施例中，所用的試驗材料及其來源包括：

馬鈴薯(Solanum tuberosum)品種中薯5號由淮陰工學院生命科學與食品工程學院江蘇省植物生產(chǎn)與加工實踐教育中心實驗室保存。

擬南芥(Arabidopsis thaliana)的種子經(jīng)過2.5％(v/v)CaClO₂消毒后種植在黑土：蛭石：珍珠巖(1:1:1)的混合基質(zhì)中，22℃，16h光照培養(yǎng)(16h光照，8h黑暗，冷光源)生長2周。

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α由淮陰工學院生命科學與食品工程學院江蘇省植物生產(chǎn)與加工實踐教育中心實驗室保存?？寺≥d體PMD-18-Simple T、各類限制性內(nèi)切酶、Taq聚合酶、連接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker購自寶生物工程大連有限公司。所有的化學試劑都從美國西格瑪化學公司和上海國藥化學試劑公司購買。

本發(fā)明中常規(guī)的分子生物學操作具體參見《分子克隆》(Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。

下述實施例中常規(guī)的基因操作參照分子克隆文獻進行(Sambook J,Frets EF,Mannsdes T et al.In:Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。

實施例1 馬鈴薯淀粉合成相關的蛋白及其編碼基因的獲得

1.實驗材料

將馬鈴薯品種中薯5號無菌苗展開葉葉片取下，液氮速凍，-80℃保存。

2.葉片總RNA提取和純化

取中薯5號無菌苗展開葉葉片約2.0g，在液氮中研磨成粉狀，加入10mL離心管，用Applygen植物RNA提取試劑盒(Applygen Technologies Inc，Beijing)提取甘薯塊根總RNA，試劑盒中包括：Plant RNA Reagent，植物組織裂解、分離RNA、去除植物多糖和多酚；Extraction Reagent，有機抽提去除蛋白質(zhì)、DNA、多糖和多酚；Plant RNA Aid，去除植物多糖多酚和次生代謝產(chǎn)物。利用QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit(QIAGEN，GmbH，Germany)從總RNA中純化mRNA。最后，取1μL于1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，另取2μL稀釋至500μL，用紫外分光光度計檢測其質(zhì)量(OD260)和純度(OD260/OD280)，提取的中薯5號無菌苗葉片總RNA，經(jīng)非變性膠瓊脂糖凝膠電泳檢測，28S和18S條帶清晰，且二者亮度比值為1.5～2︰1，表明總RNA沒有降解，純化所得mRNA符合實驗要求，可用于馬鈴薯StTrxF蛋白cDNA全長的克隆。

3.StTrxF蛋白cDNA的全長克隆

以NCBI(National Center for Biotechnology Information)上的StTrxF的cDNA序列設計引物進行StTrxF蛋白cDNA的全長克隆。

引物序列如下：

StTrxF-GC-F：5’-AATAGCAAAAATGGCGTTACAAGT-3’

StTrxF-GC-R：5’-TTTAACTTGATCGCACACCCTC-3’

以中薯5號葉片總RNA經(jīng)Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄為模板，用高保真的FastPfu酶，進行PCR擴增，PCR條件為95℃1min，隨后95℃20s，53℃20s和72℃1min，進行40個循環(huán)，最后72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，獲得549bp長度的擴增片段。

綜合上述步驟的結(jié)果，獲得了目的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO：1所示。序列表中序列SEQ ID NO：1由549個堿基組成，自5’端第1位-第549位堿基為其開放閱讀框，編碼具有序列表中序列SEQ ID NO：2所示的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。序列表中序列SEQ ID NO：2由182個氨基酸殘基組成。將該基因命名為StTrxF，將其編碼的蛋白命名為StTrxF。

實施例2 StTrxF基因過表達載體的構建

將實施例1中測序鑒定正確的含有序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸的DNA片段用BamH I和Sac I進行雙酶切，用1％瓊脂糖凝膠回收DNA片段，通過T₄DNA連接酶將回收的StTrxF基因片段與含有雙35S啟動子pYPx245質(zhì)粒連接，酶切鑒定和序列分析測定獲得了含有馬鈴薯StTrxF基因的重組質(zhì)粒AH128。該表達載體還包含gusA報告基因和帶內(nèi)含子卡那霉素抗性標記基因，載體如圖1所示。

實施例3 StTrxF基因轉(zhuǎn)化擬南芥

將實施例2構建的馬鈴薯StTrxF基因的植物表達載體pCAMBIA1301-StTrxF用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，具體方法如下：

1.農(nóng)桿菌的準備

(1)將pCAMBIA1301-StTrxF用電擊法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株(Biovector Co.,LTD)，得到含有pCAMBIA1301-StTrxF的重組農(nóng)桿菌，并涂布于含有卡那霉素抗性的平板篩選轉(zhuǎn)化子。

(2)挑取農(nóng)桿菌單菌接種于5mL LB液體培養(yǎng)基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培養(yǎng)20h。

(3)取1mL菌液轉(zhuǎn)接入20-30mL LB液體培養(yǎng)基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培養(yǎng)約12h，測OD 600≈1.5。

(4)8000rpm，4℃，10min離心收集菌體，重懸于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化滲透液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)并稀釋至OD 600≈0.8。

2.擬南芥蘸花法轉(zhuǎn)化

(1)將擬南芥的花薹浸入滲透液中，輕輕攪動約10s后取出，全部轉(zhuǎn)化完畢后，用保鮮袋罩住擬南芥，以保持濕潤環(huán)境，水平放置，22℃避光培養(yǎng)，24h后去掉保鮮袋直立培養(yǎng)。

(2)初次轉(zhuǎn)化四天后，可再進行一次轉(zhuǎn)化，重復兩次，總共轉(zhuǎn)化三次，這樣可以對花序上發(fā)育的不同時期的花蕾進行轉(zhuǎn)化，提高轉(zhuǎn)化效率。

(3)生長約兩個月后，收集種子，4℃冰箱儲存待用。

經(jīng)過蘸花法轉(zhuǎn)化的擬南芥生長約兩個月后，正常開花結(jié)子。

實施例4 StTrxF基因轉(zhuǎn)基因擬南芥植株PCR檢測

1.轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的篩選

(1)稱25-30mg種子放入1.5mL離心管；

(2)1mL 75％乙醇消毒1min(不停搖晃振蕩)，8000rpm離心5s，去上清；

(3)加入1mL過濾后的漂白粉(2.5％)消毒15min(不停搖晃振蕩，充分消毒)，8000rpm離心5s，去上清；

(4)無菌水洗滌3-4次；

(5)將種子均勻的播撒到1/2MS平板(潮霉素50μg/mL)上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置兩天，22℃，16h光照培養(yǎng)10天。

(6)將抗性植株移栽到盆中培養(yǎng)，苗稍大后，進行GUS活性檢測，選出陽性植株(T₁)培養(yǎng)至開花結(jié)實，收集T₁植株上所結(jié)T₂種子，進一步篩選得到T₃種子。

2.轉(zhuǎn)基因擬南芥植株PCR檢測

(1)試驗方法

用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株和對照植株的基因組DNA。用常規(guī)方法進行PCR檢測，所使用的StTrxF基因引物為：primer 1：5’-ACAGCGTCTCCGACCTGATGCA-3’和primer2：5’-AGTCAATGACCGCTGTTATGCG-3’。在0.2mL Eppendorf離心管中加入10×PCR buffer 2μL、dNTP(10mol/L)1μL、引物(10μmol/L)均為1μL、模板DNA(50ng/uL)2μL、Taq DNA聚合酶0.25μL，加ddH₂O至總體積20μL。反應程序為94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃復性30s，72℃延伸2min，共35個循環(huán)。

(2)試驗結(jié)果

電泳檢測擴增結(jié)果見圖2(圖2中，泳道M為Maker；泳道W：水；泳道P：陽性對照(重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-StTrxF)；泳道WT：野生型擬南芥植株；泳道VC：轉(zhuǎn)空載體擬南芥植株；泳道L1、L2：為轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301-StTrxF的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株)。從圖中可見，轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301-StTrxF的擬南芥擬轉(zhuǎn)基因植株和陽性對照擴增出591bp的目標條帶，表明StTrxF基因已經(jīng)整合到擬南芥的基因組中，并證明這些再生植株為轉(zhuǎn)基因植株；野生型擬南芥植株沒有擴增出591bp的目標條帶。轉(zhuǎn)基因植株為后續(xù)功能分析。

實施例5 StTrxF基因轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的淀粉含量測定

淀粉是由葡萄糖殘基組成的多糖，在酸性條件下加熱使其水解成葡萄糖，然后在濃硫酸的作用下，使單糖脫水生成糠醛類化合物，利用蒽酮試劑與糠醛類化合物的顯色反應，即可進行可溶性淀粉含量測定。葉片可溶性淀粉含量測定方法參照陳秀蘭【蒽酮比色法測定木薯塊根的淀粉.分析化學,1984,(4):319】，略有改動。

具體方法如下：

(1)工作曲線繪制

首先取6個潔凈的試管，編號CK、1、2、3、4和5，按照表1所示溶液配方，加入相對應編號的試管中，再用蒸餾水分別定容至體積為2.0mL。從滴定管中分別向5個試管中加入蒽酮試劑6.0mL。搖勻并立即置于沸水浴中加熱5min，取出立即在冷水中迅速冷卻(不斷搖動)。用分光光度計測定640nm波長的OD值。以OD值為橫坐標，葡萄糖濃度為縱坐標，繪制標準工作曲線(圖3)。

表1葡萄糖標準曲線繪制溶液配制

(2)樣品的提取

分別將編號為L1、L2的T₃代轉(zhuǎn)StTrxF擬南芥、野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥葉片烘干磨碎后，稱取0.10g放入研缽中，加入5mL蒸餾水磨至均勻全部移入離心管中，3000r/min離心5min。離心液倒入干凈試管中，再向盛有沉淀的離心管加5mL蒸餾水并攪拌沉淀物，進行第二次離心。然后加入10mL 3mol/L鹽酸將離心管中沉淀物全部轉(zhuǎn)移到容量瓶中，蓋上瓶塞，放在沸水浴中煮沸40～45min，取出冷卻至室溫，加3mol/L氫氧化鈉溶液10mL中和其酸性，最后用蒸餾水定容至50mL，從中取2mL溶液，加蒸餾水至50mL，混勻，得到樣品測定液，用于淀粉含量的測定。

(3)淀粉測定

取上述制備好的樣品測定液2mL，加入6mL蒽酮試劑，搖勻，放在沸水浴中煮沸5min，取出，立即放入在冷水中冷卻至室溫，在640nm下測定OD值，查葡萄糖標準曲線并計算淀粉百分含量。

淀粉百分含量計算公式如下：

式中：

Y──查標準曲線得淀粉水解稀釋測定液糖量(μg)

V₀──水解液總體積(mL)

V₁──水解稀釋液體積(mL)

V₂──用于稀釋的樣品液體積(mL)

V₃──用于比色時樣品稀釋液體積(mL)

m──樣品稱重(g)

0.9──換算糖為淀粉量

編號為L1、L2的T₃代轉(zhuǎn)StTrxF擬南芥、野生型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體擬南芥葉片淀粉含量測定結(jié)果如圖4所示，圖4中編號L1、L2分別表示2個轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的待測樣品；VC表示野生型擬南芥植株的待測樣品；WT表示轉(zhuǎn)空載體擬南芥植株的待測樣品。mg/g·DW表示每克干重樣品所含的可溶性淀粉含量的毫克數(shù)。

圖4中可知，轉(zhuǎn)空載體擬南芥和野生型擬南芥的淀粉含量無顯著差異。

圖4中可知，L1、L2的T₃代轉(zhuǎn)StTrxF擬南芥葉片的淀粉含量與野生型擬南芥相比有一定程度的提高，分別提高了66.39％和86.55％，說明導入StTrxF基因可以顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的淀粉含量。

SEQUENCE LISTING

<110> 淮陰工學院

<120> 蛋白StTrxF、編碼基因及其在提高植物淀粉含量中的應用

<130> 20161118

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 549

<212> DNA

<213> Solanum tuberosum

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(549)

<400> 1

atggcgttac aagttcaagt aaatcaggta ctattgaagt catcagtggc gccgacgccg 60

gcgcagtcgg catcttctcc gtggaggttc aacaatcagt cagtggtatg cgttgcagga 120

gattatggct tctcgtctag ggttttgagg agcagaggat tgagcttgaa ggtgaagtgt 180

agtagctcag atgctactgt tactactacg actgtgacgg taggacaggt gacggaagtt 240

tgtaaggata ccttttggcc gattgttgaa gccgccggtg aaaaaactgt cgtagttgac 300

atgtatacac agtggtgtgg tccttgtaaa gtgatcgctc caaagtttca agagctatcg 360

aagaaatata atgatgtggt ctttctgaag ctggactgta accaggacaa caggccatta 420

gcgaaggaac taggcataaa ggtggttccg acattcaaga ttctgaagaa caataagatc 480

gttaaagaag tcactggagc aaaacttgat gatttagtag cagcaattga gggtgtgcga 540

tcaagttaa 549

<210> 2

<211> 1

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(182)

<400> 2

Met Ala Leu Gln Val Gln Val Asn Gln Val Leu Leu Lys Ser Ser Val Ala Pro Thr Pro

1 5 10 15 20

Ala Gln Ser Ala Ser Ser Pro Trp Arg Phe Asn Asn Gln Ser Val Val Cys Val Ala Gly

25 30 35 40

Asp Tyr Gly Phe Ser Ser Arg Val Leu Arg Ser Arg Gly Leu Ser Leu Lys Val Lys Cys

45 50 55 60

Ser Ser Ser Asp Ala Thr Val Thr Thr Thr Thr Val Thr Val Gly Gln Val Thr Glu Val

65 70 75 80

Cys Lys Asp Thr Phe Trp Pro Ile Val Glu Ala Ala Gly Glu Lys Thr Val Val Val Asp

85 90 95 100

Met Tyr Thr Gln Trp Cys Gly Pro Cys Lys Val Ile Ala Pro Lys Phe Gln Glu Leu Ser

105 110 115 120

Lys Lys Tyr Asn Asp Val Val Phe Leu Lys Leu Asp Cys Asn Gln Asp Asn Arg Pro Leu

125 130 135 140

Ala Lys Glu Leu Gly Ile Lys Val Val Pro Thr Phe Lys Ile Leu Lys Asn Asn Lys Ile

145 150 155 160

Val Lys Glu Val Thr Gly Ala Lys Leu Asp Asp Leu Val Ala Ala Ile Glu Gly Val Arg

165 170 175 180

Ser Ser

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> StTrxF-GC-F

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(24)

<400> 3

aatagcaaaa atggcgttac aagt 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> StTrxF-GC-R

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<400> 4

tttaacttga tcgcacaccc tc 22