本發(fā)明涉及一種綠豆品種的鑒定方法，特別涉及一套適于栽培綠豆品種鑒定的SSR引物組合以及利用該SSR引物組合進(jìn)行栽培綠豆品種鑒定的方法。本發(fā)明屬于種質(zhì)資源鑒定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

綠豆是最主要的食用豆類栽培種之一，在溫帶、亞熱帶和熱帶高海拔地區(qū)被廣泛種植，主要分布在印度、中國(guó)、巴基斯坦、緬甸等亞洲國(guó)家。綠豆在中國(guó)的年均種植面積約80萬(wàn)公頃，年均產(chǎn)量約100萬(wàn)噸，是中國(guó)的重要出口創(chuàng)匯農(nóng)產(chǎn)品之一。綠豆具有生育期短、抗旱耐瘠等特點(diǎn)，且可以與根瘤菌共生固氮，在農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)調(diào)整中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)隨著綠豆雜交育種技術(shù)的發(fā)展，綠豆新品種數(shù)量不斷增加。為了加快育種進(jìn)度，提高選擇效率，各育種單位往往選用少數(shù)優(yōu)良品種作為骨干親本，從而導(dǎo)致育成品種的遺傳基礎(chǔ)越來(lái)越窄，品種相似性越來(lái)越高，加大了利用外觀表型性狀區(qū)分不同綠豆品種的難度，給品種管理和保護(hù)造成了困難。

此外，外觀表型鑒定還存在著鑒定周期長(zhǎng)、工作量大、受季節(jié)和地域限制的缺陷。分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)具有測(cè)試周期短、不受環(huán)境影響和季節(jié)限制、供選擇的標(biāo)記數(shù)量多、且可以進(jìn)行高通量測(cè)試分析等優(yōu)勢(shì)，已逐步應(yīng)用于作物新品種鑒定、種子純度及品種真實(shí)性檢測(cè)中。

因此，尋找和開發(fā)合適的分子標(biāo)記，利用分子標(biāo)記技術(shù)建立DNA指紋圖譜，可以為綠豆種質(zhì)資源和品種鑒別、純度檢測(cè)等提供有力的工具。RFLP、RAPD、AFLP等分子標(biāo)記曾先后用于綠豆的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建以及QTL定位等研究，但由于上述標(biāo)記或者由于操作過(guò)程較為繁瑣，不易掌握，或者由于重復(fù)性差等缺陷，限制了它們?cè)诰G豆遺傳研究中應(yīng)用。

隨著對(duì)綠豆的分子遺傳及分子生物學(xué)研究的進(jìn)步，綠豆轉(zhuǎn)錄組和基因組相繼公布，這為其他DNA分子標(biāo)記的開發(fā)鑒定提供了條件。其中，以微衛(wèi)星序列為基礎(chǔ)的SSR(Simple sequence repeat)分子標(biāo)記具有獨(dú)特的優(yōu)越性，它不僅覆蓋范圍廣、呈共顯性遺傳、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富，而且操作簡(jiǎn)單，成本低廉。可以高效準(zhǔn)確的應(yīng)用于綠豆品種和種質(zhì)資源的鑒定與分析。

本發(fā)明是基于SSR分子標(biāo)記鑒定法建立的，利用多態(tài)性好、PCR擴(kuò)增穩(wěn)定的30對(duì)SSR引物組成的一套引物組合對(duì)不同綠豆品種進(jìn)行鑒定的技術(shù)體系。該技術(shù)體系能夠快速、準(zhǔn)確的對(duì)不同栽培綠豆品種進(jìn)行鑒定，能準(zhǔn)確區(qū)分綠豆品種間差異并最大限度準(zhǔn)確反映綠豆品種間的親緣關(guān)系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一套基于綠豆轉(zhuǎn)錄組和基因組序列開發(fā)的SSR核心引物組，這些引物具有擴(kuò)增穩(wěn)定、電泳條帶清晰、多態(tài)性豐富的優(yōu)點(diǎn)，可有效用于DNA指紋圖譜構(gòu)建、品種鑒定等研究。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明的一套適于栽培綠豆品種鑒定的SSR引物組合，該引物組合由30對(duì)多態(tài)性好、擴(kuò)增穩(wěn)定的SSR引物組成，所述的30對(duì)多態(tài)性好、擴(kuò)增穩(wěn)定的SSR引物序列分別如SEQ ID NO.1-60所示。

一種適于栽培綠豆品種鑒定的試劑盒，其含有本發(fā)明所述的SSR引物組合以及PCR檢測(cè)用試劑。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的SSR引物組合在栽培綠豆品種鑒定中的用途。

一種使用本發(fā)明所述的SSR引物組合鑒定綠豆品種的方法，包括如下步驟：

(1)提取待鑒定綠豆籽粒樣品基因組DNA；

(2)采用權(quán)利要求1所述的SSR引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(3)將步驟(2)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析；

(4)根據(jù)特異性圖譜進(jìn)行綠豆品種的鑒定。

在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟(1)中采用CTAB法或改良的CTAB法進(jìn)行待鑒定綠豆籽粒樣品基因組DNA的提取。

在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟(2)中用于擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

PCR反應(yīng)體系為10μL，含1×PCR緩沖液，0.2mM dNTPs,上下游引物各0.2μM，20ng待測(cè)綠豆品種的基因組DNA，0.5U Taq酶；

PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min，然后每個(gè)循環(huán)：95度變性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共進(jìn)行35次循環(huán)，最后72℃延伸10min。

在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，步驟(3)中所述的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析為使用8％(w/w)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，在PCR產(chǎn)物中加2μL上樣緩沖液，280V恒電壓電泳1h，0.1％(w/w)AgNO₃染色10min，使用含0.5％(v/v)甲醛1.5％(w/w)NaOH溶液顯影。

相較于現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明利用一套多態(tài)性好、PCR擴(kuò)增穩(wěn)定的SSR引物對(duì)鑒定品種的遺傳信息進(jìn)行分析，與現(xiàn)在廣泛使用的表型鑒定方法和之前報(bào)道的分子鑒定方法相比更加準(zhǔn)確。另外本發(fā)明直接利用綠豆籽粒提取基因組DNA，省去了將待測(cè)品種進(jìn)行發(fā)芽或育苗后再取樣的過(guò)程，鑒定過(guò)程更加簡(jiǎn)潔迅速。

附圖說(shuō)明

圖1為29個(gè)綠豆栽培品種基于30對(duì)綠豆SSR引物的聚類分析圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

實(shí)施例1綠豆SSR引物的開發(fā)及篩選

利用SSRLocatorI V.1軟件掃描綠豆轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的SSR位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)引物。在上海英駿生物技術(shù)有限公司合成其中的3000對(duì)引物，利用6份代表性綠豆資源進(jìn)行多態(tài)性引物篩選，從中選擇出30對(duì)多態(tài)性好、擴(kuò)增穩(wěn)定的SSR引物作為品種鑒定分析的核心引物(見表1)。

表1 30對(duì)綠豆SSR引物信息

實(shí)施例2本發(fā)明的SSR引物組合在栽培綠豆品種鑒定中的應(yīng)用

1、綠豆基因組DNA提取

選取29份主栽綠豆栽培品種作為鑒定材料(表2)。

表2 本發(fā)明中用于綠豆品種鑒定的材料信息

DNA提取具體步驟如下：

1)各取3-5粒參試綠豆材料的種子，利用研缽或組織研磨儀研成粉末，置于2ml離心管中，加入800μl 65℃預(yù)熱的CTAB提取液，渦旋震蕩1min。

2)將離心管置于65℃水浴40min，每10min顛倒混勻一次。將樣品從水浴鍋中取出，靜置片刻，加入800μl氯仿與異戊醇的混合液(24氯仿：1異戊醇)，混勻15min，然后靜置10min，10000rpm室溫離心10min。

3)取600μl上清液于另一新的2ml離心管中，加入900μl 95％乙醇，-20℃放置30min。10000rpm離心10min，倒掉上清液，留沉淀。

4)加入500μl 75％乙醇，輕輕將沉淀彈起，10000rpm離心5min，倒掉上清液。

5)重復(fù)步驟4)一次。

6)將離心管開口朝下傾斜放置，便于多余乙醇流出，室溫干燥1h或50℃烘干20min。加入150μl滅菌ddH₂O或1×TE。置65℃水浴鍋溶解1h。

7)取出離心管，放置至室溫，10000rpm離心2min，將上清液吸取到新的1.5ml離心管中，以便去除淀粉等沉淀物。利用nanodrop2000進(jìn)行DNA濃度測(cè)定和質(zhì)量檢測(cè)，-20℃冰箱保存，備用。

2、鑒定材料PCR擴(kuò)增

利用實(shí)施例1表1中給出的SSR引物對(duì)待鑒定材料DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序如下：

PCR反應(yīng)體系為10μL，含1×PCR緩沖液，0.2mM dNTPs，上下游引物各0.2μM，20ng待測(cè)綠豆品種的基因組DNA，0.5UTaq酶；

PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min，然后每個(gè)循環(huán)：95度變性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共進(jìn)行35次循環(huán)，最后72℃延伸10min。

3、8％(w/w)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳與銀染檢測(cè)

采用8％(w/w)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。在PCR產(chǎn)物中加2μL上樣緩沖液，每一個(gè)加樣孔加入1.5μL樣品，280V恒電壓電泳1h。0.1％(w/w)AgNO₃染色10min，1.5％(w/w)NaOH(含0.5％(v/v)甲醛)溶液顯影5-10min。最后用蒸餾水漂洗2次。

4、根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)和引物的遷移率記錄結(jié)果，遷移率最大(分子量最小)的條帶記為01，遷移率次之的記為02，依次類推，無(wú)條帶記為00，建立供試材料SSR基因型信息數(shù)據(jù)庫(kù)。

統(tǒng)計(jì)每個(gè)品種在引物中的擴(kuò)增情況，構(gòu)建DNA指紋圖譜(表3)，通過(guò)比較各引物擴(kuò)增位點(diǎn)的差異，發(fā)現(xiàn)任意2個(gè)品種的DNA指紋圖譜都不相同。

表3. 28份綠豆品種DNA指紋數(shù)據(jù)

5、利用NTSYSpc2.10分析軟件計(jì)算綠豆各品種間的遺傳相似系數(shù)，然后基于相似系數(shù)矩陣，利用SHAN子程序按照UPGMA算法進(jìn)行聚類分析(圖1)。

在相似系數(shù)為1(兩個(gè)品種基因型完全相同時(shí)，二者相似系數(shù)＝1)時(shí)，29個(gè)綠豆栽培品種各自處于不同的分支上，表明29個(gè)測(cè)試材料為不同品種。在相似系數(shù)0.39處，29個(gè)測(cè)試材料分為明顯的兩類，其中一類主要集中了來(lái)自北京、河北石家莊、河北保定的綠豆品種，如中綠5號(hào)、中綠8號(hào)、中綠11號(hào)、中綠12號(hào)均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所育成；冀綠7號(hào)、冀綠10號(hào)、冀綠11號(hào)、冀綠13號(hào)、冀綠0518、冀綠0509均為河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所育成；冀綠2號(hào)和保942均為保定市農(nóng)科院育成。同時(shí)，在該分類內(nèi)的一些品種具有親緣關(guān)系，如冀綠7號(hào)、冀綠10號(hào)、保942均使用了冀綠2號(hào)作為雜交親本之一，冀綠0509則使用了保942作為雜交親本之一。另一類則主要集中了來(lái)自于東北和內(nèi)蒙古地區(qū)的綠豆品種。如白綠8號(hào)、白綠9號(hào)、白綠11號(hào)、吉綠4號(hào)，吉綠5號(hào)、遼綠8號(hào)、內(nèi)蒙古綠豆、科綠1號(hào)等。這部分品種多具有半直立生長(zhǎng)的特性。

以上結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明的綠豆SSR引物組合可以很好的區(qū)分綠豆栽培品種，并反映出品種的親緣、地理來(lái)源等信息，可用于綠豆品種鑒定及多樣性分析。

序列表

<110> 河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所

<120> 一套適于栽培綠豆品種鑒定的SSR引物組合及其應(yīng)用

<130> KLPI161247

<160> 60

<170> PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 1

gtgatggtgc tgcttttc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 2

atgcgtgggg agaagtaa 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 3

ttcacaccct tttctgattc 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 4

gtttccttct tggtctcc 18

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 5

acgttcattg ttcctttccc tctg 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 6

gtgctcgaag agttcgtctt cctc 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 7

acggctattc atcgttttgc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 8

caacccgaag ccaaaaacta 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 9

cagcaacgga aagaaaatcg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 10

tgttgtgaag gcaccaacat 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 11

ttcccctttc tgcttcttca 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 12

acgctgacgt tgactcctct 20

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 13

tctcttcctc tatggctt 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 14

gctcctcttt ttgctgca 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 15

gtcgtttccg gaaactgt 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 16

gatccgaacc tctttctg 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 17

gaagggaatg aaaatgaa 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 18

gttcaatcca ttcagtct 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 19

agaagaaccc taccacag 18

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 20

ccaaaaacgt tccctcag 18

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 21

ccggggtgaa attgatacac 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 22

caaaggggct atgaacagga 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 23

gaggttccaa catctcagcc 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 24

ggatggacaa tgttgtgctg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 25

atgtttgagg catttccctg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 26

atcaggcaac aacaaccaca 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 27

acgcaaagag aggtgcagat 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 28

tccctaccat tttccagatc a 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 29

gcaggcaata cgaggagttc 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 30

agggtcggtc catcaacata 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 31

attcaagcca gagaaggcaa 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 32

ggtgggaggg tattggctat 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 33

aagactaaaa ggcgccgaac 20

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 34

aaggagaaag ataccgtttt caga 24

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 35

catgcagacg aagcagag 18

<210> 36

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 36

gagcgtcgtc gtttcgat 18

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 37

aagcactggc ttcaccagat 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 38

tcgcagcatt tgaaaaatca 20

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 39

tccaatgttt ggtttcatgt tt 22

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 40

tctgagctct gaggtgggat 20

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 41

cattcaacgc tgtgtaaggt ccag 24

<210> 42

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 42

ttgcagaaga gctttgtgat gagg 24

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 43

cccactgcag aggttatcgt 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 44

gaagatccag cacaacccat 20

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 45

tctgcgaaaa tcttcttcca a 21

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 46

ggtggggaaa agaaccctaa 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 47

tggaactcct tcccctcttt 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 48

ggaagcgagt ccacgagtag 20

<210> 49

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 49

gcttcacatg catagtac 18

<210> 50

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 50

ttaacttggg ttgtctgc 18

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 51

ctcattgtac cactggatat 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 52

gcctcctttc aggtgattgt 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 53

ggcagcataa gagaagccac 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 54

aacccccttt tcatgctctt 20

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 55

ctccatgtcc ctcttttcca 20

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 56

tgggttgagt ttgtttcttg g 21

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 57

caatcatgga tttggggaac 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 58

cgatctcatt cacgcacttt 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 59

gcctgcattt tggtttgaat 20

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 60

tcccaaagtc tgcaagatcc 20