本發(fā)明涉及一種蛋白制備方法。更具體地說，本發(fā)明涉及一種豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法。

背景技術(shù)：

豬的各個(gè)部位都具有重要的營養(yǎng)價(jià)值。尤其是豬腦不僅肉質(zhì)細(xì)膩，鮮嫩可口，富含腦磷脂和蛋白質(zhì)，而且鈣、磷、鐵的含量高于豬肉，可增加機(jī)體的免疫力，促進(jìn)新陳代謝和健腦功能。

腦組織營養(yǎng)豐富，含有豐富的蛋白質(zhì)，近年來，研究者從動(dòng)物腦組織中分離蛋白質(zhì)，酶法酶解成含游離的氨基酸和低分子肽的酶解物，用其治療腦方面的疾病。奧地利依比威藥廠(Ebewe)制造的腦活素注射液是臨床應(yīng)用最廣泛的腦蛋白酶解物產(chǎn)品，它是由豬腦蛋白經(jīng)酶法酶解后進(jìn)一步提取制得的藥物制劑，其組成為75％的游離氨基酸和25％的小分子肽，研究表明腦活素的生物活性與其含有的小分子肽類密切相關(guān)，目前對(duì)豬腦蛋白及多肽的相關(guān)研究較少，因此研究動(dòng)物腦組織酶解物中小分子肽的制備方法、分離純化及其生物活性對(duì)社會(huì)發(fā)展具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法，其利用超聲輔助酶堿提，快速高效地提取制備豬腦蛋白抗氧化肽；其操作簡單，處理時(shí)間短，蛋白得率高。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法，其包括以下步驟：

步驟一，預(yù)處理：

取新鮮豬腦沖洗，切碎，經(jīng)過脫脂、干燥并研磨成粉，制得脫脂腦蛋白粉備用；

步驟二、超聲波處理豬腦蛋白粉：

取步驟一制得的脫脂腦蛋白粉按照體積比為1:200的比例加入去離子水，磁力攪拌20-40min，置于40-60℃水浴中保溫0.5-1.5h，使腦蛋白粉完全溶解；

逆流脈沖超聲波處理：將冷卻至室溫的腦蛋白粉置于逆流脈沖超聲波處理器中處理，其中，超聲頻率為20kHz，功率為60-100W，超聲4-6min，期間超聲時(shí)間2s，間歇時(shí)間2s；

步驟三，酶解提取粗豬腦多肽：超聲后的豬腦蛋白溶液加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，其中酶底比為1000-3000U/g；pH值為8.0-9.0，酶解溫度為30-50℃，酶解時(shí)間為80-100min；酶解后立即將酶解液置于沸水浴中靜置5-15min；待冷卻至室溫，于8000-12000rpm離心10-20min，取上清液，制得豬腦多肽粗提液；

步驟四，分離：

將超聲輔助酶解得到的豬腦多肽粗提液，采用截留分子量為3-5kDa的超濾膜進(jìn)行分級(jí)分離，收集所得產(chǎn)物冷凍干燥后制得豬腦多肽，其中，控制超濾膜出口壓力小于5Bar；

步驟五，純化：

利用DEAE-52纖維樹脂層析柱對(duì)步驟四制備的豬腦多肽進(jìn)行二次純化；制得豬腦蛋白抗氧化肽。

優(yōu)選的是，所述預(yù)處理中所述脫脂具體包括：將切碎后的新鮮豬腦加入其體積4-6倍的沸水中煮沸5-15min，過濾后再加入2-4倍體積的75-90％的乙醇，60-80℃下脫脂20-40min，冷卻至室溫，之后于3000-6000rmp離心10-20min，收集沉淀；所述干燥具體指，于烘箱中50-70℃下干燥至恒重。

優(yōu)選的是，所述步驟二的超聲波處理過程中用0.1-0.5mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)所述豬腦蛋白溶液的pH值恒定為8.0-9.0。

優(yōu)選的是，所述步驟五的純化具體為：稱取步驟四制備的豬腦多肽50-100mg，溶于5-10mL pH 7.5-8.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液，于3000-5000rpm離心5-10min，取上清液作為進(jìn)樣液；

將進(jìn)樣液滴加到DEAE-52纖維樹脂層析柱中，依次用pH 7.5-8.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液、pH 8.0Tris-HCl緩沖液，進(jìn)行洗脫，使用DHL-A恒流泵，控制流速0.8-1.0mL/min，用自動(dòng)分部收集器收集，收集液采用截留分子量為300Da的多肽透析袋進(jìn)行脫鹽；脫鹽后冷凍干燥制得豬腦蛋白抗氧化肽。

優(yōu)選的是，所述pH 8.0Tris-HCl緩沖液含有0.0-2.0mol/L的NaCl。

優(yōu)選的是，所述豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法，包括以下步驟：

步驟一，預(yù)處理：

取新鮮豬腦沖洗，切碎，經(jīng)過脫脂、干燥并研磨成粉，制得脫脂腦蛋白粉備用；所述脫脂具體包括：將切碎后的新鮮豬腦加入其體積4-6倍的沸水中煮沸5-15min，過濾后再加入2-4倍體積的75-90％的乙醇，60-80℃下脫脂20-40min，冷卻至室溫，之后于3000-6000rmp離心10-20min，收集沉淀；所述干燥具體指，于烘箱中50-70℃下干燥至恒重；

步驟二、超聲波處理豬腦蛋白粉：

取步驟一制得的脫脂腦蛋白粉按照體積比為1:200的比例加入去離子水，磁力攪拌20-40min，置于40-60℃水浴中保溫0.5-1.5h，使腦蛋白粉完全溶解；用0.1-0.5mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)所述豬腦蛋白溶液的pH值恒定為8.0-9.0；

逆流脈沖超聲波處理：將冷卻至室溫的腦蛋白粉置于逆流脈沖超聲波處理器中處理，其中，超聲頻率為20kHz，功率為60-100W，超聲4-6min，期間超聲時(shí)間2s，間歇時(shí)間2s；

步驟三，酶解提取粗豬腦多肽：超聲后的豬腦蛋白溶液加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，其中酶底比為1000-3000U/g；pH值為8.0-9.0，酶解溫度為30-50℃，酶解時(shí)間為80-100min；酶解后立即將酶解液置于沸水浴中靜置5-15min；待冷卻至室溫，于8000-12000rpm離心10-20min，取上清液，制得豬腦多肽粗提液；

步驟四，分離：

將超聲輔助酶解得到的豬腦多肽粗提液，采用截留分子量為3-5kDa的超濾膜進(jìn)行分級(jí)分離，收集所得產(chǎn)物冷凍干燥后制得豬腦多肽，其中，控制超濾膜出口壓力小于5Bar；

步驟五，純化：

利用DEAE-52纖維樹脂層析柱對(duì)步驟四制備的豬腦多肽進(jìn)行二次純化；制得豬腦蛋白抗氧化肽；所述純化具體為：稱取步驟四制備的豬腦多肽50-100mg，溶于5-10mL pH 7.5-8.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液，于3000-5000rpm離心5-10min，取上清液作為進(jìn)樣液；

將進(jìn)樣液滴加到DEAE-52纖維樹脂層析柱中，依次用pH 7.5-8.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液、pH 8.0Tris-HCl緩沖液，進(jìn)行洗脫，使用DHL-A恒流泵，控制流速0.8-1.0mL/min，之后將收集到的液體再次滴加到DEAE-52纖維樹脂層析柱中進(jìn)行二次純化后得收集液，收集液采用截留分子量為300Da的多肽透析袋進(jìn)行脫鹽；脫鹽后冷凍干燥制得豬腦蛋白抗氧化肽；所述pH 8.0Tris-HCl緩沖液含有0.0-2.0mol/L的NaCl。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：本發(fā)明所述豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法，將豬腦蛋白粉溶液在酶解之前采用逆流脈沖超聲波處理，豬腦蛋白經(jīng)超處理聲后，更多的腦蛋白中的肽鍵被暴露，從而有利于蛋白酶發(fā)揮蛋白的酶解作用。將較于常規(guī)的酶解方式，本發(fā)明中蛋白酶解度提高了30.6％。本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法中水解曲線圖；

圖2為本發(fā)明所述豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法酶解后多肽的濃度曲線圖；

圖3為本發(fā)明豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法中不同濃度UPCHPs清除ABTS+·能力曲線圖；

圖4為本發(fā)明豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法中UPCHPs超濾組分(1mg/mL)對(duì)ABTS自由基的清除能力曲線圖；

圖5為本發(fā)明豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法中UPCHPs-III的DEAE-52洗脫曲線圖；

圖6為本發(fā)明豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法中UPCHPs-F3的Tricine-SDS-PAGE電泳圖；

圖7為本發(fā)明豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法中UPCHPs—F3經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分離純化組分對(duì)ABTS+·的清除能力曲線圖；

圖8為本發(fā)明豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法Ultra MALDI-TOF/TOF-MS鑒定氨基酸序列圖；

圖9為本發(fā)明豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法Ultra MALDI-TOF/TOF-MS鑒定氨基酸序列圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語并不排除一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。

本發(fā)明提供一種豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法，其包括以下步驟：

步驟一，預(yù)處理：

取新鮮豬腦沖洗，切碎，經(jīng)過脫脂、干燥并研磨成粉，制得脫脂腦蛋白粉備用；

步驟二、超聲波處理豬腦蛋白粉：

取步驟一制得的脫脂腦蛋白粉按照體積比為1:200的比例加入去離子水，磁力攪拌20-40min，置于40-60℃水浴中保溫0.5-1.5h，使腦蛋白粉完全溶解；

逆流脈沖超聲波處理：將冷卻至室溫的腦蛋白粉置于逆流脈沖超聲波處理器中處理，其中，超聲頻率為20kHz，功率為60-100W，超聲4-6min，期間超聲時(shí)間2s，間歇時(shí)間2s；

步驟三，酶解提取粗豬腦多肽：超聲后的豬腦蛋白溶液加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，其中酶底比為1000-3000U/g；pH值為8.0-9.0，酶解溫度為30-50℃，酶解時(shí)間為80-100min；酶解后立即將酶解液置于沸水浴中靜置5-15min；待冷卻至室溫，于8000-12000rpm離心10-20min，取上清液，制得豬腦多肽粗提液；

步驟四，分離：

將超聲輔助酶解得到的豬腦多肽粗提液，采用截留分子量為3-5kDa的超濾膜進(jìn)行分級(jí)分離，收集所得產(chǎn)物冷凍干燥后制得豬腦多肽，其中，控制超濾膜出口壓力小于5Bar；

步驟五，純化：

利用DEAE-52纖維樹脂層析柱對(duì)步驟四制備的豬腦多肽進(jìn)行二次純化；制得豬腦蛋白抗氧化肽。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述預(yù)處理中所述脫脂具體包括：將切碎后的新鮮豬腦加入其體積4-6倍的沸水中煮沸5-15min，過濾后再加入2-4倍體積的75-90％的乙醇，60-80℃下脫脂20-40min，冷卻至室溫，之后于3000-6000rmp離心10-20min，收集沉淀；所述干燥具體指，于烘箱中50-70℃下干燥至恒重。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟二的超聲波處理過程中用0.1-0.5mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)所述豬腦蛋白溶液的pH值恒定為8.0-9.0。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟五的純化具體為：稱取步驟四制備的豬腦多肽50-100mg，溶于5-10mL pH 7.5-8.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液，于3000-5000rpm離心5-10min，取上清液作為進(jìn)樣液；

將進(jìn)樣液滴加到DEAE-52纖維樹脂層析柱中，依次用pH 7.5-8.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液、pH 8.0Tris-HCl緩沖液，進(jìn)行洗脫，使用DHL-A恒流泵，控制流速0.8-1.0mL/min，用自動(dòng)分部收集器收集，收集液采用截留分子量為300Da的多肽透析袋進(jìn)行脫鹽；脫鹽后冷凍干燥制得豬腦蛋白抗氧化肽。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述pH 8.0Tris-HCl緩沖液含有0.0-2.0mol/L的NaCl。

實(shí)施例1

所述豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法包括以下步驟：

(1)脫脂豬腦蛋白粉的制備

新鮮豬腦：購自鎮(zhèn)江市場，除去血塊和腦膜(軟腦膜和蛛網(wǎng)膜)，用生理鹽水沖洗，切碎，加入4倍的沸水，煮沸5min，過濾后再加入2倍體積的75-90％的乙醇，60℃下脫脂20min，冷卻至室溫后，3000-6000rmp離心10-20min，收集沉淀后，于烘箱中50℃下干燥至恒重，研磨，于干燥皿中保存，備用。

(2)超聲輔助酶解制備豬腦多肽

脫脂腦蛋白粉1g置于500mL錐形瓶中，加入200mL的去離子水，磁力攪拌20-40min，置于40℃水浴中保溫0.5h，使腦蛋白粉完全溶解，冷卻至室溫。逆流脈沖超聲波處理器條件：超聲頻率為20kHz，功率為60-100W，超聲4-6min(超聲時(shí)間2s，間歇時(shí)間2s)。用0.1-0.5mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值恒定為8.0-9.0。

超聲后豬腦蛋白溶液加入堿性蛋白酶0.1g(酶底比，1000-3000U/g)，于pH 8.0-9.0，酶解溫度30-50℃進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間80min后，立即將酶解液置于沸水浴中靜置5min；待冷卻至室溫，于8000-12000rpm離心10-20min，取上清液備用。

(3)超濾分離

將得到的粗超聲輔助酶解得到的豬腦多肽(UPCHPs)，采用截留分子量(MWCO)5kDa的超濾膜對(duì)UPCHPs進(jìn)行分級(jí)分離，控制超濾膜出口壓力小于5Bar。收集所得組分UPCHPs-III(3-5kDa)，并將各組分冷凍干燥后備用。

(4)DEAE-52纖維素柱分離純化

稱取冷凍干燥后的多肽50mg，溶于5mL pH 7.5-8.5醋酸鈉緩沖液(0.02mol/L)，充分溶解后3000-5000g離心5-10min，取上清液作為進(jìn)樣液，備用。

將進(jìn)樣液滴加到DEAE-52層析柱中，依次用pH 7.5-8.5醋酸鈉緩沖液(0.02mol/L)、pH 8.0Tris-HCl緩沖液(含有0.0-2.0mol/L的NaCl)、進(jìn)行洗脫，使用DHL-A恒流泵，控制流速0.8-1.0mL/min，用自動(dòng)分部收集器收集。合并各洗脫峰的洗脫液濃縮后，將DEAE-52離子柱分離得到抗氧化活性最高組分采用截留分子量為300Da的多肽透析袋進(jìn)行脫鹽，收集樣品凍干后即得。

實(shí)施例2

所述豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法包括以下步驟：

(1)脫脂豬腦蛋白粉的制備

新鮮豬腦：購自鎮(zhèn)江市場，除去血塊和腦膜(軟腦膜和蛛網(wǎng)膜)，用生理鹽水沖洗，切碎，加入6倍的沸水，煮沸15min，過濾后再加入4倍體積的75-90％的乙醇，80℃下脫脂20-40min，冷卻至室溫后，3000-6000rmp離心10-20min，收集沉淀后，于烘箱中50-70℃下干燥至恒重，研磨，于干燥皿中保存，備用。

(2)超聲輔助酶解制備豬腦多肽

脫脂腦蛋白粉2g置于500mL錐形瓶中，加入400mL的去離子水，磁力攪拌40min，置于40-60℃水浴中保溫1.5h，使腦蛋白粉完全溶解，冷卻至室溫。逆流脈沖超聲波處理器條件：超聲頻率為20kHz，功率為60-100W，超聲4-6min(超聲時(shí)間2s，間歇時(shí)間2s)。用0.1-0.5mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值恒定為8.0-9.0。

超聲后豬腦蛋白溶液加入堿性蛋白酶0.1-0.2g(酶底比，1000-3000U/g)，于pH 8.0-9.0，酶解溫度30-50℃進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間80-100min后，立即將酶解液置于沸水浴中靜置5-15min；待冷卻至室溫，于8000-12000rpm離心20min，取上清液備用。

(3)超濾分離

將得到的粗超聲輔助酶解得到的豬腦多肽(UPCHPs)，采用截留分子量(MWCO)3kDa的超濾膜對(duì)UPCHPs進(jìn)行分級(jí)分離，控制超濾膜出口壓力小于5Bar。收集所得組分UPCHPs-Ⅳ(1-3kDa)，并將組分冷凍干燥后備用。

(4)DEAE-52纖維素柱分離純化

稱取冷凍干燥后的多肽100mg，溶于5-10mL pH 7.5-8.5醋酸鈉緩沖液(0.02mol/L)，充分溶解后3000-5000g離心5-10min，取上清液作為進(jìn)樣液，備用。

將進(jìn)樣液滴加到DEAE-52層析柱中，依次用pH 7.5-8.5醋酸鈉緩沖液(0.02mol/L)、pH 8.0Tris-HCl緩沖液(含有0.0-2.0mol/L的NaCl)、進(jìn)行洗脫，使用DHL-A恒流泵，控制流速0.8-1.0mL/min，用自動(dòng)分部收集器收集。合并各洗脫峰的洗脫液濃縮后，將DEAE-52離子柱分離得到抗氧化活性最高組分采用截留分子量為300Da的多肽透析袋進(jìn)行脫鹽，收集樣品凍干后。

實(shí)施例3

所述豬腦蛋白抗氧化肽的制備方法包括以下步驟：

(1)脫脂豬腦蛋白粉的制備

新鮮豬腦：購自鎮(zhèn)江市場，除去血塊和腦膜(軟腦膜和蛛網(wǎng)膜)，用生理鹽水沖洗，切碎，加入5倍的沸水，煮沸10min，過濾后再加入2-4倍體積的75-90％的乙醇，70℃下脫脂20-40min，冷卻至室溫后，3000-6000rmp離心15min，收集沉淀后，于烘箱中50-70℃下干燥至恒重，研磨，于干燥皿中保存，備用。

(2)超聲輔助酶解制備豬腦多肽

脫脂腦蛋白粉1.5g置于500mL錐形瓶中，加入300mL的去離子水，磁力攪拌20-40min，置于50℃水浴中保溫1.0h，使腦蛋白粉完全溶解，冷卻至室溫。逆流脈沖超聲波處理器條件：超聲頻率為20kHz，功率為60-100W，超聲4-6min(超聲時(shí)間2s，間歇時(shí)間2s)。用0.1-0.5mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值恒定為8.0-9.0。

超聲后豬腦蛋白溶液加入堿性蛋白酶0.1-0.2g(酶底比，1000-3000U/g)，于pH 8.0-9.0，酶解溫度30-50℃進(jìn)行酶解，酶解時(shí)間80-100min后，立即將酶解液置于沸水浴中靜置5-15min；待冷卻至室溫，于8000-12000rpm離心10-20min，取上清液備用。

(3)超濾分離

將得到的粗超聲輔助酶解得到的豬腦多肽(UPCHPs)，采用截留分子量(MWCO)1kDa的超濾膜對(duì)UPCHPs進(jìn)行分級(jí)分離，控制超濾膜出口壓力小于5Bar。收集所得組分UPCHPs-Ⅴ(<1kDa)并將各組分冷凍干燥后備用。

(4)DEAE-52纖維素柱分離純化

稱取冷凍干燥后的多肽80mg，溶于8mL pH 7.5-8.5醋酸鈉緩沖液(0.02mol/L)，充分溶解后3000-5000g離心5-10min，取上清液作為進(jìn)樣液，備用。

將進(jìn)樣液滴加到DEAE-52層析柱中，依次用pH 7.5-8.5醋酸鈉緩沖液(0.02mol/L)、pH 8.0Tris-HCl緩沖液(含有0.0-2.0mol/L的NaCl)、進(jìn)行洗脫，使用DHL-A恒流泵，控制流速0.8-1.0mL/min，用自動(dòng)分部收集器收集。合并各洗脫峰的洗脫液濃縮后，將DEAE-52離子柱分離得到抗氧化活性最高組分采用截留分子量為300Da的多肽透析袋進(jìn)行脫鹽，收集樣品凍干后即得。

對(duì)比例4

(1)脫脂豬腦蛋白粉的制備

新鮮豬腦：購自鎮(zhèn)江市場，除去血塊和腦膜(軟腦膜和蛛網(wǎng)膜)，用生理鹽水沖洗，切碎，加入4～6倍的沸水，煮沸5～15min，過濾后再加入2～4倍體積的75～90％的乙醇，60～80℃下脫脂20～40min，冷卻至室溫后，3000～6000rmp離心10～20min，收集沉淀后，于烘箱中50～70℃下干燥至恒重，研磨，于干燥皿中保存，備用。

(2)酶解制備豬腦多肽

脫脂腦蛋白粉1～2g置于500mL錐形瓶中，加入200～400mL的去離子水，磁力攪拌20～40min，置于40～60℃水浴中保溫0.5～1.5h，使腦蛋白粉完全溶解，冷卻至室溫。采用常規(guī)酶解。

(3)將得到的粗超聲輔助酶解得到的豬腦多肽(UPCHPs)，采用截留分子量(MWCO)分別為10kDa，5kDa的超濾膜對(duì)UPCHPs進(jìn)行分級(jí)分離，控制超濾膜出口壓力小于5Bar。收集所得組分UPCHPs-I(>10kDa)，UPCHPs-II(5～10kDa)；并將各組分冷凍干燥后備用。

(4)DEAE-52纖維素柱分離純化

稱取冷凍干燥后的多肽80mg，溶于8mL pH 7.5-8.5醋酸鈉緩沖液(0.02mol/L)，充分溶解后3000-5000g離心5-10min，取上清液作為進(jìn)樣液，備用。

將進(jìn)樣液滴加到DEAE-52層析柱中，依次用pH 7.5-8.5醋酸鈉緩沖液(0.02mol/L)、pH 8.0Tris-HCl緩沖液(含有0.0-2.0mol/L的NaCl)、進(jìn)行洗脫，使用DHL-A恒流泵，控制流速0.8-1.0mL/min，用自動(dòng)分部收集器收集。合并各洗脫峰的洗脫液濃縮后，將DEAE-52離子柱分離得到抗氧化活性最高組分采用截留分子量為300Da的多肽透析袋進(jìn)行脫鹽，收集樣品凍干后即得。

在制備過程中，進(jìn)行以下參數(shù)的檢測：

a，水解度測定

水解度的測定參考Adler-Nissen等建立的pH-stat法。

式中：DH—水解度，N_b—NaOH的濃度(mol/L)，B—NaOH的體積(mL)，M_p—水解蛋白質(zhì)的質(zhì)量(g)，h_tot—底物蛋白中總的肽鍵數(shù)，豬腦蛋白為7.6mmol/g，α—的平均解離度。

b，多肽濃度測定

4mL Folin-phenol(試劑A)，加入0.5mL的樣品，室溫下反應(yīng)10min，再加入0.5mL Folin-phenol(試劑B)，室溫下反應(yīng)30min后，于500nm處測定其吸光度，并以去離子水替代樣品溶液做空白對(duì)照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算樣品中多肽的含量(BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍：0～50μg/mL)。

c，ABTS⁺·清除率

ABTS⁺·用去離子水配成7mM，與2.45mM過硫酸鉀溶液混合(5mL的ABTS⁺·和88μL的過硫酸鉀溶液)，混合物于室溫下避光放置12～16h。ABTS⁺·溶液用乙醇稀釋(1mL的ABTS⁺·溶液+70mL的乙醇)，使其在734nm處的吸光度為0.70±0.02。100μL ABTS⁺·溶液加入50μL不同濃度的多肽溶液，70min后在734nm下測定吸光度(A_S)。去離子水用作空白對(duì)照(A_B)。V_C為陽性對(duì)照。所以的溶液當(dāng)天配制，實(shí)驗(yàn)平行測試3次。ABTS⁺·清除率公式如下：

式中：A_B—空白的吸光值；A_S—樣品的吸光值

其中，在酶解過程中，每2min取樣，進(jìn)行多肽的含量以及水解度的監(jiān)測。超濾分離和純化步驟后測定清除ABTS+·的活性，制得的成品進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳。最后利用基質(zhì)輔助激光電離解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-TOF-MS)鑒定多肽的氨基酸序列。

其中，Tricine-SDS-PAGE電泳具體為：電泳內(nèi)槽裝陰極緩沖液，外槽裝陽極緩沖液，在冰浴環(huán)境下進(jìn)行，恒壓電泳，先于30V電壓下，進(jìn)行1～2h，當(dāng)樣品全部進(jìn)入分離膠后，將電壓升至100V，最后當(dāng)樣品全部進(jìn)入濃縮膠時(shí)將電泳電壓升至150V，并繼續(xù)進(jìn)行約6h的電泳操作，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)膠片底部時(shí)停止電泳。

基質(zhì)輔助激光電離解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，檢索條件為：檢索類型：MS/MS Ion Search；酶：胰蛋白酶；可選修飾：乙酞化,氧化；質(zhì)量值：單同位素峰；分子量范圍：未限制；肽質(zhì)量容差：±0.3Da；片段容差：±0.9Da；最大漏切數(shù)：

儀器類型：MALDI-TOF-TOF。

結(jié)果如下：

如圖1所示，在前20min內(nèi)，常規(guī)酶解和超聲輔助酶解的水解反應(yīng)速率均較快，但隨著水解反應(yīng)的時(shí)間的延長，速率逐漸減緩。但在相同時(shí)間下，超聲輔助酶解的蛋白水解度均大于常規(guī)酶解法，當(dāng)水解時(shí)間達(dá)90min時(shí)，與常規(guī)酶解相比，超聲輔助酶解的蛋白水解度提高了30.6％。這是因?yàn)樨i腦蛋白經(jīng)超處理聲后，更多的腦蛋白中的肽鍵被暴露，從而有利于蛋白酶發(fā)揮蛋白的水解作用。

由圖2可知，在前20min水解過程中，隨著水解時(shí)間的延長，兩種酶解方法所得多肽濃度不斷增加；但在20min后，隨時(shí)間延長，水解所得多肽濃度基本穩(wěn)定，這主要是由于可反應(yīng)底物數(shù)量的減少，酶的自我消解和抑制所造成的。由圖中可知，在水解時(shí)間20-25min時(shí)，超聲酶解豬腦多肽的濃度達(dá)到最大，為225.6μg/mL。蛋在水解時(shí)間20min時(shí)，常規(guī)酶解的豬腦多肽濃度僅157.2μg/mL?？梢?，超聲輔助酶解可增加水解度，獲得更多的多肽類物質(zhì)。但隨著水解時(shí)間的延長，隨著蛋白的水解度的增加，游離氨基酸的數(shù)目增加，肽鍵的數(shù)目減少，并且離心后沉淀形成的數(shù)量也隨之增加，因此后續(xù)以超聲輔助酶解和常規(guī)酶解時(shí)間20min時(shí)得到的粗多肽(UPCHPs和PCHPs)為研究對(duì)象，測定其多肽得率分別為81.5％和66.7％。

由圖3可知，隨著UPCHPs濃度的增加，其清除ABTS⁺·的能力逐漸增強(qiáng)。且當(dāng)豬腦濃度為5mg/kg時(shí)，清除ABTS⁺·的能力達(dá)90.2％，其EC₅₀值為0.63mg/mL。

由圖4可知，得到五種組分，分別為：UPCHPs-I(MW>10kDa)、UPCHPs-II(5～10kDa)、UPCHPs-III(3～5kDa)、UPCHPs-Ⅳ(1～3kDa)和UPCHPs-Ⅴ(<1kDa)。結(jié)果表明，UPCHPs分子量小于5kDa的三個(gè)組分清除ABTS⁺·的能力接近，均顯著高于U PCHPs-I(>10kDa)和UPCHPs-II(5～10kDa)具有顯著性差異(p<0.05)。

由圖5可知，經(jīng)DEAE-52分離后的蛋白峰峰型對(duì)稱，分離效果較好。收集峰值管，經(jīng)透析，冷凍干燥后，用2mL相應(yīng)緩沖液復(fù)溶，測定其清除ABTS⁺·的活力。一組分于0.5mg/mL時(shí)清除ABTS⁺·為72.4％，各組分中清除自由基能力最強(qiáng)的于0.5mg/mL時(shí)對(duì)ABTS⁺·為93.3％，將各組分中清除自由基能力最強(qiáng)的定名為F3，且F3為UPCHPs-III中主要的抗氧化組分，故選擇F3進(jìn)行下一步鑒定分析。

如圖6所示，1號(hào)條帶為豬腦酶解多肽經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳分析，在5856-3313Da之間和3313Da以下出現(xiàn)了譜帶，且在5856～3313Da之間的位置譜帶較寬，顏色較深；在3313Da以下的位置譜帶分布稍窄，顏色較淺，因此可以得出酶解得到的UPCHPs-F3主要由<5kDa間的多肽組成。因此，進(jìn)一步對(duì)超濾組分分子量小于5kDa的UPCHPs-F3進(jìn)行第二次的DEAE-52纖維樹脂的分離。2號(hào)條帶為豬腦酶解多肽經(jīng)DEAE-52纖維樹脂二次分離后的Tricine-SDS-PAGE電泳分析。在<3kDa處出現(xiàn)了明顯的譜帶，其分布稍窄，顏色較深，多肽含量比例較大。其次在<5kDa處出現(xiàn)了較明顯的譜帶，兩目標(biāo)條帶分別命名為F31和F32。

由圖7可知，UPCHPs-F31和UPCHPs-F32組分清除ABTS⁺·的EC₅₀值分別為0.185和0.241mg/mL，UPCHPs-F31的EC₅₀值是未純化的UPCHPs的29％，所以UPCHPs-F31用于下一步分析。

由圖8和圖9所知，通過Ultra MALDI-TOF/TOF-MS的LIFT串聯(lián)質(zhì)譜圖譜，用Bio Tools4.0軟件分析m/z：451.67和1105.59Da的肽段，氨基酸序列分別為Ile-Tyr-Arg(IY R)和Glu-Ala-Ser-Ile-Glu-Trp-Ser-Arg-Lys(EASIEWSRK)，正好對(duì)應(yīng)于SAW760的161-163和81-98肽位點(diǎn)。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。