本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年10月28日，申請(qǐng)?zhí)枮?01080049721.1，發(fā)明名稱為“多能干細(xì)胞”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

本專利申請(qǐng)要求于2009年10月29日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)no.61/256,149的優(yōu)先權(quán)，將該臨時(shí)申請(qǐng)全文以引用方式并入本文。

本發(fā)明提供了從成體細(xì)胞制備多能干細(xì)胞的方法。具體地講，本發(fā)明提供了在不使用飼養(yǎng)細(xì)胞層或可增加逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染效率的試劑的情況下從體細(xì)胞制備多能干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

用于i型糖尿病的細(xì)胞替代療法的進(jìn)展以及可移植胰島的缺乏已使得注意力集中在開發(fā)適于移植物移入的胰島素生成細(xì)胞或β細(xì)胞的來源上。一種方法是從多能干細(xì)胞(例如胚胎干細(xì)胞或從成體細(xì)胞產(chǎn)生的多能干細(xì)胞)產(chǎn)生功能性β細(xì)胞。

從成體細(xì)胞產(chǎn)生的多能干細(xì)胞或“誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞”或“ips細(xì)胞”是通過誘導(dǎo)某些基因的“強(qiáng)制”表達(dá)而以人為方式來源于非多能細(xì)胞(例如成體體細(xì)胞)的多能干細(xì)胞類型。據(jù)信，誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞與天然多能干細(xì)胞(如胚胎干細(xì)胞)在很多方面都相同，如某些干細(xì)胞基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)、染色質(zhì)甲基化模式、倍增時(shí)間、胚狀體形成、畸胎瘤形成、有活力的嵌合體形成以及潛能和分化能力。

在一個(gè)例子中，takahashi等人聲稱：“我們證明了通過在es細(xì)胞培養(yǎng)條件下引入四個(gè)因子oct3/4、sox2、c-myc和klf4，可從小鼠胚胎或成體成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞”(cell126：663-676，2006)。

又如，li等人聲稱：“我們揭示了基因重編程和化學(xué)條件相結(jié)合可產(chǎn)生和維持大鼠ipsc(ripsc)，從而產(chǎn)生畸胎瘤并且大大有助于產(chǎn)生嵌合體大鼠。采用相同的策略也足以產(chǎn)生非典型人ipsc(hipscs)，所述非典型人ipsc表現(xiàn)出與mesc類似的集落形態(tài)和自我更新要求/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)響應(yīng)?！?cellstemcell4：16-19，2009)。

又如，maherali等人聲稱：“四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子oct4、sox2、c-myc和klf4的異位表達(dá)足以將多能狀態(tài)賦予成纖維細(xì)胞基因組，從而產(chǎn)生誘導(dǎo)型多能干(ips)細(xì)胞。仍然未知的是，這四個(gè)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞核重編程是否整體重置分化的細(xì)胞和多能細(xì)胞之間的表觀遺傳差異。在這里，我們使用新選擇方法從成纖維細(xì)胞產(chǎn)生ips細(xì)胞，以表征它們的表觀遺傳狀態(tài)。雌性ips細(xì)胞顯示出體細(xì)胞沉默的x染色體的重新激活，并且在分化時(shí)經(jīng)歷了隨機(jī)x失活。兩個(gè)關(guān)鍵組蛋白修飾的全基因組分析表明ips細(xì)胞與es細(xì)胞高度類似。與這些觀察相符的是，ips細(xì)胞可產(chǎn)生有活力的高度嵌合體，并影響生殖細(xì)胞系。這些數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的重編程可使體細(xì)胞表觀基因組整體逆轉(zhuǎn)為類es狀態(tài)?！?cellstemcell1：55-70，2007)。

又如，stadtfeld等人聲稱：“我們構(gòu)建了強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的慢病毒系統(tǒng)，用于在成纖維細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)四個(gè)重編程因子c-myc、klf4、oct4和sox2。”(cellstemcell2：230-240)。

又如，nakagawa等人聲稱：“我們?cè)诖嗣枋隽瞬恍枰猰yc逆轉(zhuǎn)錄病毒的ips細(xì)胞產(chǎn)生的改進(jìn)方案。我們使用該方案獲得的非ips背景細(xì)胞顯著減少，并且產(chǎn)生的ips細(xì)胞始終具有高質(zhì)量。在研究期間，myc-ips細(xì)胞來源小鼠不形成腫瘤。該方案也能夠有效分離ips細(xì)胞而無需藥物選擇。此外，我們?cè)跓omyc的情況下從成體表皮成纖維細(xì)胞產(chǎn)生了人ips細(xì)胞?！?naturebiotechnology26：101-106，2008)。

又如，takahashi等人聲稱：“我們證明了利用同樣的四個(gè)因子：oct3/4、sox2、klf4和c-myc，可以從成人表皮成纖維細(xì)胞產(chǎn)生ips細(xì)胞。”(cell131：861-872，2007)。

又如，okita等人聲稱：“我們之前的研究顯示通過逆轉(zhuǎn)錄病毒引入oct3/4(也稱為pou5f1)、sox2、c-myc和klf4，并隨后對(duì)fbx15(也稱為fbxo15)表達(dá)進(jìn)行選擇，可從小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。這些誘導(dǎo)型多能干(ips)細(xì)胞(在下文中稱為fbx15ips細(xì)胞)在形態(tài)、增殖和畸胎瘤形成方面與胚胎干(es)細(xì)胞類似；然而，就基因表達(dá)和dna甲基化模式而言它們則不同，而且不能制備成體嵌合體。這里我們得出結(jié)論，對(duì)nanog表達(dá)進(jìn)行選擇可得到具有生殖系嵌合能力的ips細(xì)胞，與fbx15ips細(xì)胞相比，該ips細(xì)胞具有增強(qiáng)的類es細(xì)胞基因表達(dá)和dna甲基化模式?！?nature448：313-317，2007)。

又如，wernig等人聲稱：“成纖維細(xì)胞可在缺少c-myc的情況下通過oct4、sox2和klf4重編程為多能狀態(tài)?！?cellstemcell2：10-12，2008)。

又如，park等人聲稱：“我們從胎兒、新生兒和成人原代細(xì)胞(包括從健康研究受試者的皮膚活檢組織分離的表皮成纖維細(xì)胞)得到了ips細(xì)胞。”(nature451：141-146，2008)。

又如，yu等人聲稱：“我們的研究表明，四個(gè)因子(oct4、sox2、nanog和lin28)足以將人體細(xì)胞重編程為表現(xiàn)出胚胎干(es)細(xì)胞的基本特性的多能干細(xì)胞。”(science318：1917-1920，2007)。

然而，所述前景并未充分展現(xiàn)，部分由于常規(guī)衍生、傳代和維持多能狀態(tài)的源于體細(xì)胞的多能干細(xì)胞存在困難。體細(xì)胞來源多能干細(xì)胞的穩(wěn)定和持續(xù)長期培養(yǎng)的一個(gè)特殊限制是多能干細(xì)胞需要在細(xì)胞飼養(yǎng)層上衍生。飼養(yǎng)細(xì)胞(通常為有絲分裂失活的成纖維細(xì)胞)提供未完全確定的培養(yǎng)組分的來源，所述組分可支持體細(xì)胞來源多能干細(xì)胞的貼壁、生長和傳代。然而，由于飼養(yǎng)細(xì)胞中固有的可變因素，飼養(yǎng)層培養(yǎng)物阻礙了培養(yǎng)條件標(biāo)準(zhǔn)化以及體細(xì)胞來源多能干細(xì)胞的定向分化。因此，通常將體細(xì)胞來源多能干細(xì)胞從基于飼養(yǎng)層的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)換為由細(xì)胞外基質(zhì)蛋白構(gòu)成的貼附層上的無飼養(yǎng)層培養(yǎng)物，以為了進(jìn)行充分表征了的和受控制的培養(yǎng)和分化。遺憾的是，在飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)得到的體細(xì)胞來源多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)換為無飼養(yǎng)層體系的過程會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，并且可導(dǎo)致自發(fā)分化和/或核型不穩(wěn)定性。

因此，仍然明顯地需要產(chǎn)生足夠質(zhì)量的且可擴(kuò)增以滿足當(dāng)前臨床需要的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞。本發(fā)明利用替代方法來產(chǎn)生誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞，其中多能干細(xì)胞由體細(xì)胞形成，而無需使用飼養(yǎng)細(xì)胞層。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了在不使用飼養(yǎng)細(xì)胞層或可增加病毒轉(zhuǎn)染效率的試劑的情況下從體細(xì)胞產(chǎn)生多能干細(xì)胞的方法。

在備選實(shí)施例中，本發(fā)明提供從羊水來源細(xì)胞衍生的多能干細(xì)胞群，所用方法不需要使用飼養(yǎng)細(xì)胞層或可增加病毒轉(zhuǎn)染效率的試劑。

附圖說明

圖1示出了人胚胎干細(xì)胞系h1的細(xì)胞和crl2522細(xì)胞系來源多能干細(xì)胞的多能性相關(guān)基因的表達(dá)。

圖2示出了多能干細(xì)胞集落的形態(tài)。圖a和b示出了衍生自羊水來源細(xì)胞的多能干細(xì)胞集落的代表性顯微圖。圖c和d示出了衍生自羊水來源細(xì)胞(afd1)、傳代五次后的多能干細(xì)胞。圖e示出了未轉(zhuǎn)導(dǎo)的羊水來源細(xì)胞。

圖3示出了衍生自羊水來源細(xì)胞的多能干細(xì)胞的多能性相關(guān)基因的表達(dá)。

圖4示出了衍生自羊水來源細(xì)胞(afd1)的多能干細(xì)胞的多能性相關(guān)基因的表達(dá)，其在指定的傳代次數(shù)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

圖5示出了衍生自羊水來源細(xì)胞(afd1)的多能干細(xì)胞的多能性相關(guān)基因的表達(dá)，其在第5次傳代時(shí)通過免疫熒光檢測(cè)。

圖6示出了crl2522細(xì)胞系來源的多種多能干細(xì)胞的多能性相關(guān)基因的表達(dá)。

圖7示出了衍生自羊水來源細(xì)胞的兩個(gè)多能干細(xì)胞群中定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的表達(dá)。

圖8示出了crl2522細(xì)胞系來源的多能干細(xì)胞群中定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的表達(dá)。

圖9示出了衍生自羊水來源細(xì)胞的多能干細(xì)胞群中胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的表達(dá)。

圖10示出了使用衍生自羊水來源細(xì)胞、crl2522細(xì)胞和人胚胎干細(xì)胞系h1的細(xì)胞的多能干細(xì)胞形成的胚狀體。也示出了多種胚狀體的基因表達(dá)譜比較。

圖11示出了衍生自羊水來源細(xì)胞的多能干細(xì)胞在缺乏飼養(yǎng)細(xì)胞層和貼附層的表面上的生長和貼附。

圖12示出了衍生自羊水來源細(xì)胞的多能干細(xì)胞在缺乏飼養(yǎng)細(xì)胞層和貼附層的表面上培養(yǎng)時(shí)的多能性相關(guān)基因的表達(dá)。

圖13示出了衍生自羊水來源細(xì)胞的多能干細(xì)胞群在缺乏飼養(yǎng)細(xì)胞層和貼附層的表面上培養(yǎng)時(shí)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的表達(dá)。

具體實(shí)施方式

為了以不受限制的方式清晰說明本公開，將本發(fā)明的具體實(shí)施方式分成下列描述或闡明本發(fā)明某些特征、實(shí)施例或應(yīng)用的小節(jié)。

定義

干細(xì)胞是由它們?cè)趩渭?xì)胞水平上既自我更新又分化產(chǎn)生子代細(xì)胞的能力來定義的未分化細(xì)胞，包括自我更新祖細(xì)胞、非更新祖細(xì)胞和末端分化細(xì)胞。干細(xì)胞的特征還在于：其具有在體外由多種胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)分化成各種細(xì)胞譜系的功能細(xì)胞以及移植后產(chǎn)生多種胚層的組織和注入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的話)組織形成的能力。

干細(xì)胞根據(jù)其發(fā)育潛能分為：(1)全能，指能夠產(chǎn)生所有的胚胎和胚胎外細(xì)胞類型；(2)多能，指能夠產(chǎn)生所有的胚胎細(xì)胞類型；(3)專能，指能夠產(chǎn)生細(xì)胞譜系的亞群，但所有細(xì)胞譜系都只分布于特定組織、器官或生理系統(tǒng)內(nèi)(例如造血干細(xì)胞(hsc)可產(chǎn)生的后代細(xì)胞包括：hsc(自我更新)、局限于血細(xì)胞的寡能祖細(xì)胞以及作為血液正常組分的所有細(xì)胞類型和成分(如血小板))；(4)寡能，指能夠產(chǎn)生比專能干細(xì)胞更有限的細(xì)胞譜系亞群；以及(5)單能，指能夠產(chǎn)生單一細(xì)胞譜系(如生精干細(xì)胞)。

分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的細(xì)胞獲得特化細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞或肌肉細(xì)胞)的特征的過程。分化的細(xì)胞或誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是已經(jīng)在細(xì)胞譜系中占據(jù)更特化的(“定向的”)位置的細(xì)胞。術(shù)語“定向的”當(dāng)應(yīng)用到分化的過程時(shí)，指在分化途徑中已經(jīng)進(jìn)行到這么一種程度的細(xì)胞：在正常環(huán)境下，它會(huì)繼續(xù)分化成特定的細(xì)胞類型或細(xì)胞類型子集，且在正常環(huán)境下不能分化成另一細(xì)胞類型或回復(fù)到分化不足的細(xì)胞類型。去分化指細(xì)胞回復(fù)到細(xì)胞的譜系當(dāng)中特化(或定向)不足的地位的過程。本文所用的“細(xì)胞的譜系”限定細(xì)胞的遺傳關(guān)系，即它來自哪些細(xì)胞和它能產(chǎn)生什么細(xì)胞。細(xì)胞譜系將細(xì)胞定位于發(fā)育和分化的遺傳計(jì)劃內(nèi)。譜系特異性標(biāo)志物指與所關(guān)注譜系的細(xì)胞的表型明確相關(guān)的特征，可用來評(píng)估未定向細(xì)胞向所關(guān)注譜系的分化。

如本文所用，“表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞”或“第1階段細(xì)胞”或“第1階段”是指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞：sox17、gata4、hnf3β、gsc、cer1、nodal、fgf8、brachyury、mix樣同源盒蛋白、fgf4cd48、脫中胚蛋白(eomesodermin，eomes)、dkk4、fgf17、gata6、cxcr4、c-kit、cd99或otx2。表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括原條前體細(xì)胞、原條細(xì)胞、中內(nèi)胚層細(xì)胞和定形內(nèi)胚層細(xì)胞。

本文所用的“表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞”指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞：pdx1、hnf1β、ptf1α、hnf6、nkx6.1或hb9。表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞、原腸管細(xì)胞和后前腸細(xì)胞。

如本文所用，“定形內(nèi)胚層”指具有在原腸胚形成過程中從上胚層產(chǎn)生的細(xì)胞的特性并形成胃腸道及其衍生物的細(xì)胞。定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)下列標(biāo)志物：hnf3β、gata4、sox17、cerberus、otx2、goosecoid、c-kit、cd99和mixl1。

如本文所用，“標(biāo)志物”是在所關(guān)注細(xì)胞中差異表達(dá)的核酸或多肽分子。關(guān)于這一點(diǎn)，差異表達(dá)意指陽性標(biāo)志物的水平增加，而陰性標(biāo)志物的水平降低。標(biāo)志物核酸或多肽的可檢測(cè)水平，在所關(guān)注細(xì)胞中充分地高于或低于在其他細(xì)胞中，使得可使用多種本領(lǐng)域公知的方法中的任何一種將所關(guān)注細(xì)胞與其他細(xì)胞鑒別和區(qū)分開來。

如本文所用，“胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞”或“胰腺激素表達(dá)細(xì)胞”指能夠表達(dá)下列激素中的至少一種的細(xì)胞：胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。

本發(fā)明的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞的產(chǎn)生

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的多能干細(xì)胞通過引入至少一個(gè)選自sox2、oct4、lin28和nanog的基因從體細(xì)胞衍生，而無需使用飼養(yǎng)細(xì)胞層。所述至少一個(gè)基因可通過任何合適的手段引入體細(xì)胞，例如核酸轉(zhuǎn)染、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或直接引入所述至少一個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)。

在所述至少一個(gè)基因通過病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)引入的情況下，體細(xì)胞可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。任何能夠?qū)⑺鲋辽僖粋€(gè)基因引入體細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒都適用于本發(fā)明。在一個(gè)實(shí)施例中，逆轉(zhuǎn)錄病毒是慢病毒。

在備選實(shí)施例中，體細(xì)胞可以使用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。任何能夠?qū)⑺鲋辽僖粋€(gè)基因引入體細(xì)胞的病毒都適用于本發(fā)明。例如，用于本發(fā)明方法的病毒可以是腺病毒。作為另外一種選擇，用于本發(fā)明方法的病毒可以是桿狀病毒。

可增加病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染效率的試劑通過中和病毒粒子與體細(xì)胞的細(xì)胞膜上的唾液酸之間的電荷相斥來發(fā)揮作用。此類試劑包括(例如)聚凝胺(polybrene)。

在一個(gè)實(shí)施例中，多能干細(xì)胞衍生自體細(xì)胞，而無需使用飼養(yǎng)細(xì)胞層或可增加逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染效率的試劑，其包括以下步驟：

a.在組織培養(yǎng)基質(zhì)上接種體細(xì)胞，

b.用至少一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)接種的體細(xì)胞，該逆轉(zhuǎn)錄病毒含有編碼至少一種選自以下的基因的核酸：sox2、oct4、lin28和nanog，

c.將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)三天，然后將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到包被有細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的組織培養(yǎng)板上，并且在補(bǔ)充有可抑制rho激酶活性的試劑和bfgf的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞一周，以及

d.將培養(yǎng)的細(xì)胞傳代至包被有細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的組織培養(yǎng)板上，并且在補(bǔ)充有bfgf的調(diào)理培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代細(xì)胞。

所述至少一種逆轉(zhuǎn)錄病毒可以含有編碼所述至少一種基因中的一種或不止一種的核酸。在一個(gè)實(shí)施例中，體細(xì)胞使用含有單獨(dú)編碼所述至少一種基因的核酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。

在一個(gè)實(shí)施例中，調(diào)理培養(yǎng)基使用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞調(diào)理。

在一個(gè)實(shí)施例中，接種的體細(xì)胞用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，該慢病毒含有編碼至少一種選自以下的基因的核酸：sox2、oct4、lin28和nanog。在備選實(shí)施例中，接種的體細(xì)胞用含有編碼sox2、oct4、lin28和nanog的核酸的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。在備選實(shí)施例中，接種的體細(xì)胞用至少一個(gè)含有單獨(dú)編碼sox2、oct4、lin28和nanog的核酸的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。

在一個(gè)實(shí)施例中，抑制rho激酶活性的試劑選自：y-27632、法舒地爾、(s)-(+)-4-甘氨酰基-2-甲基-1-[(4-甲基-5-異喹啉基)磺?；鵠-六氫-1h-1，4-二氮雜卓二鹽酸鹽(本文稱為h1152-甘氨酰)和羥基法舒地爾。

細(xì)胞外基質(zhì)可以是(例如)纖連蛋白、玻連蛋白、層粘連蛋白、膠原、明膠、血小板反應(yīng)蛋白等等。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞外基質(zhì)是matrigel。

在一個(gè)實(shí)施例中，體細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)讓給lifescan，inc.的美國專利申請(qǐng)11/420,895中公開的羊水來源細(xì)胞。

在備選實(shí)施例中，體細(xì)胞可以是wo2003/042405中公開的羊水來源細(xì)胞。

在備選實(shí)施例中，體細(xì)胞可以是美國公布的專利申請(qǐng)us2005/0054093中公開的羊水來源細(xì)胞。

在備選實(shí)施例中，體細(xì)胞可以是int’anker等人，blood102：1548-1549，2003中公開的羊水來源細(xì)胞。

在備選實(shí)施例中，體細(xì)胞可以是tsai等人，humanreproduction19，1450-1456，2004中公開的羊水來源細(xì)胞。

在備選實(shí)施例中，體細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)讓給lifescan，inc.的美國專利申請(qǐng)11/762,714中公開的絨毛膜絨毛來源細(xì)胞。

在備選實(shí)施例中，體細(xì)胞可以是chang&jones，prenataldiagnosis8：367-378，1988中公開的絨毛膜絨毛來源細(xì)胞。

在備選實(shí)施例中，體細(xì)胞可以是rong-hao等人，humanreproduction11：1328-1333，1996中公開的絨毛膜絨毛來源細(xì)胞。

在備選實(shí)施例中，體細(xì)胞可以是wo2003/042405中公開的絨毛膜絨毛來源細(xì)胞。

在備選實(shí)施例中，體細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)讓給lifescan，inc.的wo2006/094286中公開的胰腺來源細(xì)胞。

在備選實(shí)施例中，多能干細(xì)胞可以由轉(zhuǎn)讓給lifescan，inc.的美國專利申請(qǐng)12/108,872中公開的細(xì)胞形成。

適于支持從體細(xì)胞產(chǎn)生多能干細(xì)胞的任何培養(yǎng)基均可用于本發(fā)明的方法。然而，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，其他類型的細(xì)胞也可得益于在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)，因此本發(fā)明的組合物可無限制地用于這些目的。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過基本上涉及以下步驟的方法產(chǎn)生調(diào)理培養(yǎng)基：

a.培養(yǎng)供應(yīng)調(diào)理因子的細(xì)胞，

b.將基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加至該細(xì)胞，

c.使該基礎(chǔ)培養(yǎng)基暴露于該細(xì)胞持續(xù)足夠調(diào)理該培養(yǎng)基的一段時(shí)間，以及

d.移出該調(diào)理培養(yǎng)基。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過基本上涉及以下步驟的方法制成產(chǎn)生培養(yǎng)基：

a.培養(yǎng)供應(yīng)調(diào)理因子的細(xì)胞，

b.使細(xì)胞失活，

c.重新接種該供應(yīng)調(diào)理因子的細(xì)胞，

d.將基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加至該細(xì)胞，

e.使該基礎(chǔ)培養(yǎng)基暴露于該細(xì)胞持續(xù)足夠調(diào)理該培養(yǎng)基的一段時(shí)間，

f.移出調(diào)理培養(yǎng)基，以及

g.移出調(diào)理培養(yǎng)基。

如本文所用，“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”是指能夠有效支持培養(yǎng)物中的非多能細(xì)胞生長的鹽和營養(yǎng)物質(zhì)的溶液。

如本文所用，“調(diào)理培養(yǎng)基”是指進(jìn)一步補(bǔ)充有源自飼養(yǎng)細(xì)胞的可溶性因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

如本文所用，“飼養(yǎng)細(xì)胞”是指多能干細(xì)胞接種于其上的非多能干細(xì)胞。非多能干細(xì)胞提供有利于接種的多能干細(xì)胞生長的環(huán)境。

用于調(diào)理的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可具有任何若干不同配方。培養(yǎng)基必須能夠支持至少用于培養(yǎng)基調(diào)理的細(xì)胞系的增殖。便利的是，調(diào)理后培養(yǎng)基還能支持多能干細(xì)胞的增殖。然而，作為替代方案，調(diào)理后可將培養(yǎng)基補(bǔ)充其他因子或者以別的方式處理以使其適應(yīng)于增殖多能干細(xì)胞。

為了使多能干細(xì)胞在無飼養(yǎng)培養(yǎng)基中增殖，合適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基也可以由下列組分制成，例如，達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(dmem)，gibco貨號(hào)11965-092；knockout達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(kodmem)，gibco貨號(hào)10829-018；ham′sf12/50％dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基；200mml-谷氨酰胺，gibco貨號(hào)15039-027；非必需氨基酸溶液，gibco11140-050；b-巰基乙醇，sigma貨號(hào)m7522；人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bfgf)，gibco貨號(hào)13256-029。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基與用于對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)理的細(xì)胞組合，所述調(diào)理的環(huán)境允許細(xì)胞將可使多能干細(xì)胞增殖的組分釋放到培養(yǎng)基中。任選地，用于調(diào)理培養(yǎng)基的細(xì)胞可通過例如輻射、用化學(xué)失活劑(如絲裂霉素c)處理或者通過任何其他有效方法來失活(也就是使其不能夠?qū)嵸|(zhì)復(fù)制)。在用于支持多能干細(xì)胞培養(yǎng)前使培養(yǎng)基與調(diào)理細(xì)胞分離的情況下，細(xì)胞的失活不是必須的。

將用于調(diào)理培養(yǎng)基的細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)足夠的時(shí)間，以允許釋放因子達(dá)到足夠濃度(或消耗培養(yǎng)基組分)，從而產(chǎn)生可支持多能干細(xì)胞增殖而不分化的培養(yǎng)基。通常，通過在37℃下培養(yǎng)24h來調(diào)理的培養(yǎng)基可產(chǎn)生能夠支持多能干細(xì)胞培養(yǎng)物24小時(shí)的培養(yǎng)基。然而，可上調(diào)或下調(diào)培養(yǎng)期，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)(或通過測(cè)定必需因子的濃度)確定適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)期。在收集一批調(diào)理培養(yǎng)基后，可將細(xì)胞用于在另一培養(yǎng)期內(nèi)調(diào)理另一批培養(yǎng)基，可根據(jù)需要循環(huán)多次，只要細(xì)胞能夠保持充分調(diào)理培養(yǎng)基的能力。

本發(fā)明的誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞的擴(kuò)增和培養(yǎng)

多能干細(xì)胞可表達(dá)階段特征性胚胎抗原(ssea)3和4以及可用稱為tra-1-60和tra-1-81的抗體檢測(cè)的標(biāo)志物中的一種或多種(thomson等人，science282：1145，1998)。多能干細(xì)胞體外分化導(dǎo)致喪失ssea-4、tra1-60和tra1-81的表達(dá)(如果存在的話)，并增加ssea-1的表達(dá)。未分化的多能干細(xì)胞通常具有堿性磷酸酶活性，該酶可通過用4％多聚甲醛固定細(xì)胞，然后用vectorred作為底物顯影來檢測(cè)，如生產(chǎn)商所描述的(vectorlaboratories，burlingamecalif)。未分化的多能干細(xì)胞通常也表達(dá)oct4和tert，這可通過rt-pcr檢測(cè)。

增殖的多能干細(xì)胞的另一理想表型是分化成所有三個(gè)胚層即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織的細(xì)胞的潛能。多能干細(xì)胞的多能性可例如通過這樣來證實(shí)：將細(xì)胞注射進(jìn)重癥聯(lián)合免疫缺陷(scid)小鼠中，用4％多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后對(duì)它們進(jìn)行組織學(xué)檢驗(yàn)以確定是否存在來自三個(gè)胚層的細(xì)胞類型。作為另外一種選擇，可以通過產(chǎn)生胚狀體并評(píng)估胚狀體中三個(gè)胚層相關(guān)的標(biāo)志物的存在來確定多能性。

可以使用標(biāo)準(zhǔn)g帶技術(shù)并與已公布的相應(yīng)靈長類物種的核型相比較來分析增殖的多能干細(xì)胞系的核型。希望獲得具有“正常核型”的細(xì)胞，其意指細(xì)胞為整倍體，其中所有人染色體都存在并且沒有明顯的改變。

本發(fā)明的方法形成的多能干細(xì)胞的培養(yǎng)

在一個(gè)實(shí)施例中，將本發(fā)明的方法形成的多能干細(xì)胞在以多種方式支持多能干細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)。作為另外一種選擇，將本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞在基本上不含飼養(yǎng)細(xì)胞、但支持多能干細(xì)胞增殖而不經(jīng)歷實(shí)質(zhì)分化的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)。使用通過預(yù)先用另一細(xì)胞類型培養(yǎng)而調(diào)理的培養(yǎng)基支持通過本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞在無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中的生長而不分化。作為另外一種選擇，使用化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基支持本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞在無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中的生長而不分化。

例如，reubinoff等人(naturebiotechnology18：399-404(2000))和thompson等人(science6november1998：vol.282.no.5391，pp.1145-1147)公開了用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞層來培養(yǎng)來自人胚泡的多能干細(xì)胞系。

richards等人(stemcells21：546-556，2003)評(píng)價(jià)了一組11種不同的成人、胎兒和新生兒飼養(yǎng)細(xì)胞層在支持人多能干細(xì)胞培養(yǎng)方面的能力。richards等人聲稱：“在成人皮膚成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞系保持了人胚胎干細(xì)胞形態(tài)并保持了多能性”。

us20020072117公開了可產(chǎn)生支持靈長類多能干細(xì)胞在無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中生長的培養(yǎng)基的細(xì)胞系。所采用的細(xì)胞系是從胚胎組織獲得或從胚胎干細(xì)胞分化而來的間質(zhì)細(xì)胞系和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系。us20020072117還公開了所述細(xì)胞系作為原代飼養(yǎng)細(xì)胞層的用途。

又如，wang等人(stemcells23：1221-1227，2005)公開了用于人多能干細(xì)胞在衍生自人胚胎干細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞層上長期生長的方法。

又如，stojkovic等人(stemcells200523：306-314，2005)公開了從自發(fā)分化的人胚胎干細(xì)胞獲取的飼養(yǎng)細(xì)胞體系。

在其他例子中，miyamoto等人(stemcells22：433-440，2004)公開了得自人胎盤的飼養(yǎng)細(xì)胞來源。

amit等人(biol.reprod68：2150-2156，2003)公開了衍生自人包皮的飼養(yǎng)細(xì)胞層。

又如，inzunza等人(stemcells23：544-549，2005)公開了來自人出生后包皮成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞層。

us6642048公開了可支持靈長類多能干(pps)細(xì)胞在無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中生長的培養(yǎng)基以及可用于產(chǎn)生這種培養(yǎng)基的細(xì)胞系。us6642048聲稱：“本發(fā)明包括從胚胎組織獲得或從胚胎干細(xì)胞分化而來的間質(zhì)細(xì)胞系和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系。在本公開中描述并闡明了用于衍生這種細(xì)胞系、處理培養(yǎng)基以及用該調(diào)理培養(yǎng)基培養(yǎng)干細(xì)胞的方法”。

又如，wo2005014799公開了用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞維持、增殖和分化的調(diào)理培養(yǎng)基。wo2005014799聲稱：“通過鼠細(xì)胞(特別是分化并永生化的轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞，稱為mmh(met鼠肝細(xì)胞))的細(xì)胞分泌活性對(duì)根據(jù)本發(fā)明制備的培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)理”。

又如，xu等人(stemcells22：972-980，2004)公開了得自人胚胎干細(xì)胞衍生物的調(diào)理培養(yǎng)基，所述干細(xì)胞衍生物已經(jīng)過基因修飾而過表達(dá)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶。

又如，us20070010011公開了一種用于維持多能干細(xì)胞的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基。

一種備選的培養(yǎng)體系采用補(bǔ)充有能促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖的生長因子的無血清培養(yǎng)基。例如，cheon等人(bioreproddoi：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公開了一種無飼養(yǎng)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)體系，其中胚胎干細(xì)胞維持在補(bǔ)充有能引發(fā)胚胎干細(xì)胞自我更新的不同生長因子的未經(jīng)調(diào)理的血清替代(sr)培養(yǎng)基中。

又如，levenstein等人(stemcells24：568-574，2006)公開了使用補(bǔ)充有bfgf的培養(yǎng)基，在不存在成纖維細(xì)胞或調(diào)理培養(yǎng)基的情況下長期培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法。

又如，us20050148070公開了一種在無血清且無成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞的成分確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法，該方法包括：在含有白蛋白、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、至少一種轉(zhuǎn)鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白替代品、至少一種胰島素或胰島素替代品的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，該培養(yǎng)基基本上無哺乳動(dòng)物胎兒血清且含有至少約100ng/ml能激活成纖維細(xì)胞生長因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體的成纖維細(xì)胞生長因子，其中該生長因子的供給來源不是僅為成纖細(xì)胞飼養(yǎng)層，該培養(yǎng)基支持干細(xì)胞在無飼養(yǎng)細(xì)胞或調(diào)理培養(yǎng)基的情況下以未分化狀態(tài)增殖。

又如，us20050233446公開了一種用于培養(yǎng)干細(xì)胞，包括未分化的靈長類原始干細(xì)胞的限定培養(yǎng)基。在溶液中，此培養(yǎng)基與培養(yǎng)中的干細(xì)胞相比基本上是等滲的。在給定的培養(yǎng)物中，特定的培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和各為一定量的bfgf、胰島素和抗壞血酸，所述一定量的bfgf、胰島素和抗壞血酸為支持原始干細(xì)胞進(jìn)行實(shí)質(zhì)上非分化性生長所必需的。

又如，us6800480聲稱：“在一個(gè)實(shí)施例中，提供了用于以基本上未分化狀態(tài)培養(yǎng)靈長類來源的原始干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包括低滲透壓、低內(nèi)毒素基礎(chǔ)培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基對(duì)于支持靈長類來源的原始干細(xì)胞的生長是有效的。該基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合了有效支持靈長類來源的原始干細(xì)胞生長的營養(yǎng)血清和選自飼養(yǎng)細(xì)胞和衍生自飼養(yǎng)細(xì)胞的胞外基質(zhì)組分的基質(zhì)。該培養(yǎng)基還包含非必需氨基酸、抗氧化劑和選自核苷和丙酮酸鹽的第一生長因子”。

又如，us20050244962描述：“在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)靈長類胚胎干細(xì)胞的方法。在基本上不含哺乳動(dòng)物胎血清(優(yōu)選也基本上不含任何動(dòng)物血清)的培養(yǎng)物中，并在存在由不只是成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的來源提供的成纖維細(xì)胞生長因子情況下培養(yǎng)干細(xì)胞。在優(yōu)選的形式中，通過添加足量的成纖維細(xì)胞生長因子，使得之前為維持干細(xì)胞培養(yǎng)物所需的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層變?yōu)榉潜匦璧摹薄?/p>

在另外的例子中，wo2005065354公開了一種基本上無飼養(yǎng)細(xì)胞和無血清的成分確定的等滲培養(yǎng)基，其包含：a.基礎(chǔ)培養(yǎng)基；b.bfgf，其量足以支持實(shí)質(zhì)上未分化的哺乳動(dòng)物干細(xì)胞生長；c.胰島素，其量足以支持實(shí)質(zhì)上未分化的哺乳動(dòng)物干細(xì)胞生長；和d.抗壞血酸，其量足以支持實(shí)質(zhì)上未分化的哺乳動(dòng)物干細(xì)胞生長。

又如，wo2005086845公開了一種維持未分化的干細(xì)胞的方法，所述方法包括使干細(xì)胞暴露于轉(zhuǎn)化生長因子-β(tgf-β)蛋白家族的成員、成纖維細(xì)胞生長因子(fgf)蛋白家族的成員或煙酰胺(nic)，所述成員或煙酰胺的量足以維持細(xì)胞處于未分化狀態(tài)達(dá)足以實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果的一段時(shí)間。

可將通過本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞接種在合適的培養(yǎng)基質(zhì)上。在一個(gè)實(shí)施例中，合適的培養(yǎng)基材是胞外基質(zhì)組分，例如衍生自基底膜的組分，或者可形成粘附分子受體-配體偶聯(lián)物的一部分的組分。在一個(gè)實(shí)施例中，合適的培養(yǎng)基質(zhì)是(bectondickenson)。是得自engelbreth-holmswarm腫瘤細(xì)胞的可溶性制劑，其在室溫下膠凝而形成重構(gòu)的基底膜。

其他的細(xì)胞外基質(zhì)組分和組分混合物適合作為替代物。取決于所擴(kuò)增的細(xì)胞類型，這可包括單獨(dú)的層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它們的各種組合。

可將通過本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞以合適的分布以及在存在可促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖和保持所需特性的培養(yǎng)基的情況下接種到基質(zhì)上。所有這些特性可得益于對(duì)接種分布的認(rèn)真考慮并可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。

合適的培養(yǎng)基可用如下組分制備，例如達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(dmem)，gibco貨號(hào)11965-092；knockout達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(kodmem)，gibco貨號(hào)10829-018；ham′sf12/50％dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基；200mml-谷氨酰胺，gibco貨號(hào)15039-027；非必需氨基酸溶液，gibco11140-050；β-巰基乙醇，sigma貨號(hào)m7522；人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bfgf)，gibco貨號(hào)13256-029。

用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的多能干細(xì)胞的分化

使用本發(fā)明的方法形成的多能干細(xì)胞可通過本領(lǐng)域的任何合適方法分化為多種其他細(xì)胞類型。例如，可使用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞、心臟細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞等等。

例如，可根據(jù)wo2007030870中公開的方法，使用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化為神經(jīng)祖細(xì)胞和心肌細(xì)胞。

又如，可根據(jù)美國專利6,458,589中公開的方法，使用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成肝細(xì)胞。

用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞

可通過本領(lǐng)域的任何方法，使用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

例如，可根據(jù)d’amour等人，naturebiotechnology23，1534-1541(2005)中公開的方法，使用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

例如，可根據(jù)shinozaki等人，development-131，1651-1662(2004)中公開的方法，使用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

例如，可根據(jù)mclean等人，stemcells25，29-38(2007)中公開的方法，使用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

例如，可根據(jù)d’amour等人，naturebiotechnology24，1392-1401(2006)中公開的方法，使用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

又如，可根據(jù)轉(zhuǎn)讓給lifescan，inc.的美國專利申請(qǐng)no.11/736,908中公開的方法，使用本發(fā)明的方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

又如，可根據(jù)轉(zhuǎn)讓給lifescan，inc.的美國專利申請(qǐng)no.11/779,311中公開的方法，使用本發(fā)明的方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

又如，可根據(jù)轉(zhuǎn)讓給lifescan，inc.的美國專利申請(qǐng)no.12/493,741中公開的方法，使用本發(fā)明的方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

又如，可根據(jù)轉(zhuǎn)讓給lifescan，inc.的美國專利申請(qǐng)no.12/494,789中公開的方法，將使用本發(fā)明的方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的形成可通過在進(jìn)行特定方案之前或之后檢測(cè)該標(biāo)志物的存在來確定。多能干細(xì)胞通常不表達(dá)這類標(biāo)志物。因而，當(dāng)細(xì)胞開始表達(dá)它們時(shí)即檢測(cè)到多能細(xì)胞的分化。

用本發(fā)明的方法形成的多能干細(xì)胞分化為表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞

可通過本領(lǐng)域的任何方法，使用本發(fā)明的方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

例如，可根據(jù)d’amour等人，naturebiotechnology24，1392-1401(2006)中公開的方法，使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

例如，還通過下述方法，使根據(jù)本發(fā)明的方法得到的表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞：用成纖維細(xì)胞生長因子和hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑kaad-環(huán)巴胺處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，然后除去含有成纖維細(xì)胞生長因子和kaad-環(huán)巴胺的培養(yǎng)基，隨后將細(xì)胞在含有視黃酸、成纖維細(xì)胞生長因子和kaad-環(huán)巴胺的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。此方法的一個(gè)例子在naturebiotechnology24，1392-1401(2006)中進(jìn)行了公開。

例如，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給lifescan，inc.的美國專利申請(qǐng)no.11/736,908中公開的方法，通過用視黃酸和至少一種成纖維細(xì)胞生長因子處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞一段時(shí)間，來使根據(jù)本發(fā)明的方法得到的表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

例如，通過用視黃酸(sigma-aldrich，mo)和毒蜥外泌肽4處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，然后除去含有dapt(sigma-aldrich，mo)和毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基，隨后在含有毒蜥外泌肽1、igf-1和hgf的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，來使根據(jù)本發(fā)明的方法得到的表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化為表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。此方法的一個(gè)例子在naturebiotechnology24，1392-1401(2006)中進(jìn)行了公開。

例如，可通過將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞在含有毒蜥外泌肽-4的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后除去含有毒蜥外泌肽-4的培養(yǎng)基，并且隨后將所述細(xì)胞在含有毒蜥外泌肽1、igf-1和hgf的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，來使根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。該方法的例子在d’amour等人，naturebiotechnology，2006中公開。

例如，通過將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞在含有dapt(sigma-aldrich，mo)和毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，來使根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。該方法的例子在d’amour等人，naturebiotechnology，2006中公開。

例如，通過將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞在含有毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，來使根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。該方法的例子在d’amour等人，naturebiotechnology，2006中公開。

例如，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給lifescan，inc.的美國專利申請(qǐng)no.11/736,908中公開的方法，通過用抑制notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的因子處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，使根據(jù)本發(fā)明的方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

例如，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給lifescan，inc.的美國專利申請(qǐng)no.11/779,311中公開的方法，通過用抑制notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的因子處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，使根據(jù)本發(fā)明的方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

例如，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給lifescan，inc.的美國專利申請(qǐng)no.60/953,178中公開的方法，通過用抑制notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的因子處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，使根據(jù)本發(fā)明的方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

例如，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給lifescan，inc.的美國專利申請(qǐng)no.60/990,529中公開的方法，通過用抑制notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的因子處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，使根據(jù)本發(fā)明的方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物選自sox17、gata4、hnf3β、gsc、cer1、nodal、fgf8、brachyury、mix樣同源盒蛋白、fgf4cd48、脫中胚蛋白(eomes)、dkk4、fgf17、gata6、cxcr4、c-kit、cd99和otx2。適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞為原條前體細(xì)胞。在另一方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。在另一方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是定形內(nèi)胚層細(xì)胞。

胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物選自pdx1、hnf1β、ptf1α、hnf6、hb9和prox1。適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)胰腺內(nèi)胚層系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞為胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。

用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化為表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞

可通過本領(lǐng)域的任何方法，使用本發(fā)明方法形成的多能干細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

例如，可通過將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞在含有毒蜥外泌肽-4的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后除去含有毒蜥外泌肽-4的培養(yǎng)基，并隨后將所述細(xì)胞在含有毒蜥外泌肽1、igf-1和hgf的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，來使根據(jù)本發(fā)明的方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。該方法的例子在d’amour等人，naturebiotechnology，2006中公開。

例如，通過在含有dapt(sigma-aldrich，mo)和毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，使根據(jù)本發(fā)明方法獲得的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。該方法的例子在d’amour等人，naturebiotechnology，2006中公開。

例如，通在含有毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，使根據(jù)本發(fā)明方法獲得的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。該方法的例子在d’amour等人，naturebiotechnology，2006中公開。

例如，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給lifescan，inc.的美國專利申請(qǐng)no.11/736,908中公開的方法，通過用抑制notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的因子處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，使根據(jù)本發(fā)明的方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

例如，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給lifescan，inc.的美國專利申請(qǐng)no.11/779,311中公開的方法，通過用抑制notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的因子處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，使根據(jù)本發(fā)明的方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

例如，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給lifescan，inc.的美國專利申請(qǐng)no.60/953,178中公開的方法，通過用抑制notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的因子處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，使根據(jù)本發(fā)明方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

例如，根據(jù)轉(zhuǎn)讓給lifescan，inc.的美國專利申請(qǐng)no.60/990,529中公開的方法，通過用抑制notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的因子處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，使根據(jù)本發(fā)明的方法得到的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。

胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物選自ngn3、neurod、isl1、pdx1、nkx6.1、pax4和ptf-1α。在一個(gè)實(shí)施例中，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞能夠表達(dá)以下激素中的至少一種：胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可為表達(dá)胰激素的細(xì)胞。作為另外一種選擇，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可為分泌胰激素的細(xì)胞。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞為表達(dá)β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。表達(dá)β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞可表達(dá)pdx1和至少一種下列轉(zhuǎn)錄因子：ngn3、nkx2.2、nkx6.1、neurod、isl1、hnf3β、mafa、pax4和pax6。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是β細(xì)胞。

療法

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于治療患有1型糖尿病，或有發(fā)展1型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的患者的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，本方法涉及從體細(xì)胞產(chǎn)生多能干細(xì)胞，對(duì)該多能干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使該多能干細(xì)胞體外分化成β-細(xì)胞譜系，以及將該β-細(xì)胞譜系的細(xì)胞移植到患者體內(nèi)。

如果合適，可用有利于該植入細(xì)胞存活和功能的藥劑或生物活性劑對(duì)患者進(jìn)行進(jìn)一步處理。這些試劑可包括(例如)胰島素、tgf-β家族的成員(包括tgf-β1、2和3)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bmp-2、bmp-3、bmp-4、bmp-5、bmp-6、bmp-7、bmp-11、bmp-12和bmp-13)、成纖維細(xì)胞生長因子-1和-2、血小板衍生生長因子-aa和-bb、血小板富集血漿、胰島素生長因子(igf-i、ii)、生長分化因子(gdf-5、gdf-6、gdf-7、gdf-8、gdf-10、gdf-15)、血管內(nèi)皮細(xì)胞衍生生長因子(vegf)、多效蛋白(pleiotrophin)、內(nèi)皮素等等。其他藥物化合物可包括(例如)煙酰胺、高血糖素樣肽-i(glp-1)和高血糖素樣肽-ii、glp-1和2模擬體、毒蜥外泌肽-4、視黃酸、甲狀旁腺激素、mapk抑制劑例如美國已公布的專利申請(qǐng)2004/0209901和美國已公布的專利申請(qǐng)2004/0132729中所公開的化合物。

可在移植進(jìn)接受者前，使從體細(xì)胞產(chǎn)生的多能干細(xì)胞分化成胰島素生成細(xì)胞。在具體實(shí)施例中，可在移植進(jìn)接受者前，使從體細(xì)胞產(chǎn)生的多能干細(xì)胞完全分化成β-細(xì)胞。作為另一種選擇，可將多能干細(xì)胞以未分化狀態(tài)或部分分化的狀態(tài)移植進(jìn)接受者中?？稍谠摻邮苷咧邪l(fā)生進(jìn)一步分化。

可將定形內(nèi)胚層細(xì)胞或，作為另一選擇，胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞，或作為另一種選擇，β細(xì)胞作為分散細(xì)胞進(jìn)行移植，或可使這些細(xì)胞形成簇，可將這些細(xì)胞簇輸注進(jìn)肝門靜脈內(nèi)。作為另一種選擇，可將細(xì)胞設(shè)置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性裝置中或可進(jìn)行封裝以保護(hù)其免受宿主免疫應(yīng)答的破壞?？蓪⒓?xì)胞移植進(jìn)接受者中的合適位置內(nèi)。植入位點(diǎn)包括(例如)肝臟、天然的胰腺、腎包膜下空間、網(wǎng)膜、腹膜、漿膜下空間、腸、胃或皮下袋。

為了增強(qiáng)植入細(xì)胞的進(jìn)一步分化、存活率或活性，可在施用細(xì)胞之前、與之同時(shí)或之后施用額外的因子，例如生長因子、抗氧化劑或抗炎劑。在某些實(shí)施例中，生長因子用于使施用的細(xì)胞體內(nèi)分化。這些因子可以由內(nèi)源細(xì)胞分泌并就地暴露于施用的細(xì)胞?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的內(nèi)源生長因子或外源施用的生長因子的任意組合來誘導(dǎo)植入細(xì)胞進(jìn)行分化。

移植中所用的量取決于多種因素，包括患者的狀況和對(duì)該療法的響應(yīng)，并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于治療患有糖尿病，或有發(fā)展糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的患者的方法。該方法涉及培養(yǎng)多能干細(xì)胞，使培養(yǎng)的細(xì)胞體外分化成β-細(xì)胞譜系，以及將該細(xì)胞摻入三維支持物中。在移植進(jìn)患者前，可使細(xì)胞在該支持物上體外維持。作為另一種選擇，可將容納有該細(xì)胞的支持物直接移植進(jìn)患者中而無需進(jìn)行額外的體外培養(yǎng)?？扇芜x將至少一種有利于植入細(xì)胞的存活和功能的藥劑摻入該支持物中。

適用于本發(fā)明目的的支持材料包括可用于組織修復(fù)的組織模板、導(dǎo)管、屏障物和貯器。具體地講，已經(jīng)在體外和體內(nèi)用于生物組織重建或再生，以及用于遞送趨化劑來誘導(dǎo)組織生長的泡沫、海綿、凝膠、水凝膠、紡織物和非織造結(jié)構(gòu)形式的合成材料和天然材料適用于實(shí)踐本發(fā)明的方法。參見，例如在美國專利5,770,417、美國專利6,022,743、美國專利5,567,612、美國專利5,759,830、美國專利6,626,950、美國專利6,534,084、美國專利6,306,424、美國專利6,365,149、美國專利6,599,323、美國專利6,656,488、美國已公布的專利申請(qǐng)2004/0062753a1、美國專利4,557,264和美國專利6,333,029中所公開的材料。

為了形成摻有藥劑的支持物，可在形成支持物前將藥劑與聚合物溶液混合。作為另一種選擇，可將藥劑涂覆于制好的支持物上，優(yōu)選在存在藥物載體的情況下進(jìn)行。藥物可以液體、細(xì)分固體或任何其他合適的物理形式存在。作為另一種選擇，可將賦形劑添加至支持物中以改變藥劑的釋放速率。在一個(gè)備選實(shí)施例中，將至少一種為抗炎化合物的藥物化合物(例如在美國專利6,509,369中所公開的化合物)摻入支持物中。

可將至少一種為抗凋亡化合物的藥物化合物(例如在美國專利6,793,945中所公開的化合物)摻入支持物中。

可將至少一種為纖維變性抑制劑的藥物化合物(例如在美國專利6,331,298中所公開的化合物)摻入支持物中。

支持物還可摻有至少一種能夠增強(qiáng)血管生成的藥物化合物，例如美國已公布的專利申請(qǐng)2004/0220393和美國已公布的專利申請(qǐng)2004/0209901中所公開的化合物。

支持物還可摻有至少一種為免疫抑制化合物的藥物化合物，例如美國已公布的專利申請(qǐng)2004/0171623中所公開的化合物。

支持物還可摻有至少一種為生長因子的藥物化合物，例如tgf-β家族的成員(包括tgf-β1、tgf-β2和tgf-β3)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bmp-2、bmp-3、bmp-4、bmp-5、bmp-6、bmp-7、bmp-11、bmp-12和bmp-13)、成纖維細(xì)胞生長因子-1和-2、血小板衍生生長因子-aa和-bb、血小板富集血漿、胰島素生長因子(igf-i、igf-ii)、生長分化因子(gdf-5、gdf-6、gdf-8、gdf-10、gdf-15)、血管內(nèi)皮細(xì)胞衍生生長因子(vegf)、多效蛋白、內(nèi)皮素等等。其他藥物化合物可包括(例如)煙酰胺、缺氧誘導(dǎo)因子1-α、高血糖素樣肽-i(glp-1)、glp-1和glp-2模擬體、毒蜥外泌肽-4、nodal、成頭蛋白、ngf、視黃酸、甲狀旁腺激素、腱生蛋白-c、彈性蛋白原、凝血酶衍生的肽、凱薩林菌素(cathelicidin)、防御素(defensin)、層粘連蛋白、含有粘附性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白例如纖連蛋白和玻連蛋白的細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域和肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的生物肽、mapk抑制劑(例如在美國已公布的專利申請(qǐng)2004/0209901和美國已公布的專利申請(qǐng)2004/0132729中所公開的化合物)。

可通過將細(xì)胞簡單地沉積在該支架上來實(shí)現(xiàn)將本發(fā)明細(xì)胞摻入支架中。細(xì)胞可通過簡單擴(kuò)散進(jìn)入支架中(j.pediatr.surg.23(1pt2)：3-9(1988))。已經(jīng)發(fā)展了若干其他方法來增強(qiáng)細(xì)胞接種的效率。例如，已經(jīng)將轉(zhuǎn)瓶用于將軟骨細(xì)胞接種于聚乙醇酸支架上(biotechnol.prog.14(2)：193-202(1998))。用于細(xì)胞接種的另一種方法是利用離心，這種離心產(chǎn)生最小的應(yīng)力給接種的細(xì)胞并增強(qiáng)接種效率。例如，yang等人開發(fā)了一種細(xì)胞接種方法(j.biomed.mater.res.55(3)：379-86(2001))，稱為離心細(xì)胞固定(centrifugationalcellimmobilization，cci)。

本發(fā)明通過(但不限于)以下實(shí)例進(jìn)一步說明。

實(shí)例

實(shí)例1

使用stemgent^tm人轉(zhuǎn)染因子試劑盒用飼養(yǎng)細(xì)胞從體細(xì)胞產(chǎn)生多能干細(xì)胞

使用stemgent^tm人tf慢病毒套裝(產(chǎn)品目錄號(hào)00-0005)，通過stemgent^tm人轉(zhuǎn)染因子試劑盒所述的方法從成人包皮成纖維細(xì)胞產(chǎn)生多能干細(xì)胞。將得自atcc的crl2522細(xì)胞(在stemgent方案中人包皮成纖維細(xì)胞稱為“bj”細(xì)胞)以100,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到裝有生長培養(yǎng)基的6孔板中，得到40-50％的匯合度。該生長培養(yǎng)基由450mlemem、50ml胚胎干細(xì)胞專用級(jí)fbs、5ml10mm非必需氨基酸、5ml青霉素(10,000u/ml)-鏈霉素(10,000μg/ml)、5ml200mml-谷氨酰胺和0.9ml55mmβ-巰基乙醇構(gòu)成(本文稱為bj細(xì)胞生長培養(yǎng)基)。細(xì)胞接種的第二天，將培養(yǎng)基更換為新鮮的含有聚凝胺和慢病毒的bj細(xì)胞生長培養(yǎng)基，總體積為2.5ml(表1的條件#1和2)。慢病毒滴度由制造商使用p24衣殼抗原elisa測(cè)定法確定。病毒滴度如下：sox2-慢病毒滴度：68.80ng/ml；oct4-慢病毒滴度：6.64ng/ml；lin28-慢病毒滴度：68.80ng/ml；以及nanog-慢病毒滴度：82.80ng/ml。

輕輕搖晃細(xì)胞培養(yǎng)皿確保培養(yǎng)基均勻分布，然后將細(xì)胞在37℃和5％co2下溫育過夜。轉(zhuǎn)導(dǎo)二十四小時(shí)后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，以200×g離心5分鐘，重懸于bj細(xì)胞生長培養(yǎng)基中，并且在6孔板的3個(gè)孔中以1比3的接種比率重新接種于前一天接種的cf-1mef飼養(yǎng)細(xì)胞上。將病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的crl2522細(xì)胞在飼養(yǎng)細(xì)胞上37℃和5％co2下溫育過夜。重新接種二十四小時(shí)后，將bj細(xì)胞生長培養(yǎng)基更換為人es/ips細(xì)胞培養(yǎng)基(包含dmem-f12培養(yǎng)基200ml、knockout血清替代物50ml、200mml-谷氨酰胺+2-巰基乙醇溶液1.25ml、非必需氨基酸100x溶液2.5ml和4ng/ml終濃度的b-fgf溶液)。在最初七天中每天更換es/ips細(xì)胞培養(yǎng)基。七天后，將培養(yǎng)基更換為mef調(diào)理培養(yǎng)基(mefcm)。通過將es/ips細(xì)胞培養(yǎng)基暴露于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞來產(chǎn)生mefcm。

培養(yǎng)三十八天后，用分散酶處理細(xì)胞，使細(xì)胞通過酶法傳代至mefcm中的matrigel^tm上，其中mefcm補(bǔ)充有10ng/mlbfgf和5μmrho激酶抑制劑y27632。此后，每天給細(xì)胞提供補(bǔ)充有10ng/mlbfgf的新鮮mefcm。病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)42天后觀察到第一個(gè)較小的多能細(xì)胞集落。繼續(xù)傳代細(xì)胞，直到顯示出典型的人es形態(tài)。產(chǎn)生了十二個(gè)無性系。儲(chǔ)藏并凍存第6代細(xì)胞系，3個(gè)克隆現(xiàn)在已培養(yǎng)傳代15次?？寺”３至硕嗄苄螒B(tài)和多能干細(xì)胞特性。此外，細(xì)胞可使用胚狀體試驗(yàn)分化成所有三個(gè)胚層，并且它們的分化可使用限定方案專一定向形成定形內(nèi)胚層。典型多能干細(xì)胞集落的顯微圖在圖1中示出。

實(shí)例2

在不使用飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下用stemgent^tm人轉(zhuǎn)染因子試劑盒從體細(xì)胞產(chǎn)生多能干細(xì)胞

將根據(jù)美國專利申請(qǐng)11/420,895中公開的方法分離的100,000個(gè)羊水來源細(xì)胞接種在裝有amniomax^tm培養(yǎng)基的六孔平皿的10cm²孔中。第二天根據(jù)表1中的條件#7用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。將培養(yǎng)基更換為新鮮的含有慢病毒的amniomax^tm培養(yǎng)基，總體積為2.5ml。慢病毒滴度由制造商使用p24衣殼抗原elisa測(cè)定法確定。病毒滴度如下：sox2-慢病毒滴度：68.80ng/ml；oct4-慢病毒滴度：6.64ng/ml；lin28-慢病毒滴度：68.80ng/ml；以及nanog-慢病毒滴度：82.80ng/ml。

用于該實(shí)例的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)不使用轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑聚凝胺(第二天根據(jù)表1中的條件#7用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞)。第3天時(shí)，將細(xì)胞解離并且接種于涂布有與mefcm以1∶30稀釋的matrigel^tm的表面上，其中mefcm補(bǔ)充有用于0代(p0)的8ng/mlbfgf(mefcm8)和5μmrock抑制劑y27632。接種細(xì)胞并且此后每天給細(xì)胞提供新鮮的mefcm8。

培養(yǎng)一周后，將細(xì)胞用分散酶傳代至新鮮的1∶30matrigel^tm涂布平板(第一代＝p1)。10天后觀察到大約20個(gè)人胚胎干細(xì)胞樣集落(圖2，a&b)。手工選擇最密集的“胚胎干細(xì)胞樣”集落，并合并用于傳代。將該培養(yǎng)物指定為細(xì)胞系afd1(圖2，c&d)。手工選擇單集落用于傳代，并將其指定為afd2。

儲(chǔ)藏并凍存第5代細(xì)胞系afd1和2，該細(xì)胞系現(xiàn)在已培養(yǎng)傳代11-12次并且保持了多能形態(tài)和多能干細(xì)胞特性。

實(shí)例3

在不使用飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下用stemgent^tm人轉(zhuǎn)染因子試劑盒從體細(xì)胞產(chǎn)生多能干細(xì)胞

在飼養(yǎng)細(xì)胞上不使用聚凝胺的情況下，我們不能用mef細(xì)胞飼養(yǎng)層衍生多能細(xì)胞(參見表1的條件#3-6)。將crl22429細(xì)胞(包皮成纖維細(xì)胞，atcc(manassasvausa))或af細(xì)胞以100,000個(gè)細(xì)胞的濃度接種到六孔平皿的單獨(dú)10cm²孔中過夜。第二天用含推薦量病毒的新鮮培養(yǎng)基在無聚凝胺的情況下處理細(xì)胞24小時(shí)。第三天用tryple處理細(xì)胞，并且傳代到hesc/ips細(xì)胞培養(yǎng)基中的mef細(xì)胞上，該培養(yǎng)基含5mmrock抑制劑y27632以促進(jìn)貼壁。平行的細(xì)胞群也用三種已報(bào)道能夠改善多能干細(xì)胞集落形成的化合物處理：100nm的chir99021、1μm的bix01294和2μm的r(t)bayk8644。在14天里每天更換培養(yǎng)基。在含飼養(yǎng)細(xì)胞和af細(xì)胞的孔中培養(yǎng)14天后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的死亡。

為了拯救細(xì)胞，用膠原酶將它們傳代至不含補(bǔ)充化合物的hesc/ips細(xì)胞培養(yǎng)基中的新飼養(yǎng)層上。在培養(yǎng)額外時(shí)間后未觀察到集落。在含crl2429和飼養(yǎng)細(xì)胞的孔中培養(yǎng)6周后細(xì)胞仍然存活。在培養(yǎng)6周后用膠原酶將細(xì)胞傳代至1∶30matrigel上，然而未觀察到集落。無論是否添加化合物，與crl2429細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞的共培養(yǎng)物相比，af細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞的共培養(yǎng)物中均觀察到明顯的細(xì)胞死亡。

實(shí)例4

根據(jù)本發(fā)明方法衍生的多能干細(xì)胞的表征

根據(jù)實(shí)例1和2中描述的方法衍生多能干細(xì)胞。通過qrt-pcr、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)和相差顯微術(shù)表征該多能干細(xì)胞，以確定多能干細(xì)胞共有的基因表達(dá)和形態(tài)。

使用qrt-pcr(圖3)觀察到第4代(p4)細(xì)胞系afd1中多能特征性基因(oct4、nanog、sox2、tert和cripto)的表達(dá)水平相當(dāng)于人胚胎干細(xì)胞系h1(表達(dá)水平設(shè)定為1.0)。還注意到af細(xì)胞(afd)親代群體，在第1代(p1)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)13天后但在多能細(xì)胞集落出現(xiàn)前，并未顯著表達(dá)sox2、tert和cripto，而且nanog的表達(dá)量遠(yuǎn)低于p4時(shí)的afd1。這些結(jié)果表明在p4時(shí)觀察到的sox2和nanog的表達(dá)是由于內(nèi)源表達(dá)，而不是病毒構(gòu)建體，這符合公布的觀察結(jié)果，即病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后體細(xì)胞完全轉(zhuǎn)化為多能狀態(tài)需要使病毒構(gòu)建體沉默。有趣的是，afd在p1時(shí)表達(dá)oct4的水平相當(dāng)于hesc細(xì)胞系h1，并且在p4時(shí)保持高水平，這表明oct4的早期表達(dá)和持續(xù)表達(dá)對(duì)于多能狀態(tài)的獲得是必須的。

相似地，crl2522細(xì)胞來源的多能干細(xì)胞也表達(dá)多能細(xì)胞特征性基因：oct4、nanog、fgf4和cdh1，并且表達(dá)水平相當(dāng)于人胚胎干細(xì)胞系h1(表達(dá)水平設(shè)定為1.0)，而且表達(dá)水平顯著高于親代crl2522細(xì)胞系中觀察到的表達(dá)水平。

還通過相差顯微術(shù)表征了細(xì)胞(圖2)，證明afd1多能干細(xì)胞集落具有密集的中心和光滑的邊緣，與人胚胎干細(xì)胞集落外觀相符，而且形態(tài)與af細(xì)胞親代群體顯著不同。當(dāng)通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定第4、5和6代時(shí)，afd1細(xì)胞的多能干細(xì)胞特征性標(biāo)志物(包括ssea3、ssea4、cd9、tra-160和tra-181)具有高的表面表達(dá)(圖4)，而在親代af細(xì)胞上蛋白質(zhì)未表達(dá)。還通過免疫熒光觀察到ssea4的表達(dá)，并且表達(dá)模式與oct4觀察到的類似(圖5)。這些結(jié)果與人胚胎干細(xì)胞系h1上發(fā)現(xiàn)的表達(dá)模式相符，而且也為crl2522細(xì)胞來源多能干細(xì)胞所復(fù)制(圖1)。此外，細(xì)胞核密度顯著高于未轉(zhuǎn)導(dǎo)的親代crl2522成纖維細(xì)胞，其中親代crl2522成纖維細(xì)胞的ssea4表達(dá)為陰性(圖1)。

當(dāng)通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定第6代時(shí)，crl2522細(xì)胞來源多能干細(xì)胞的多能干細(xì)胞特征性標(biāo)志物(包括ssea3、ssea4、cd9、tra-160和tra-181)具有高的表面表達(dá)(圖6)，而在親代crl2522細(xì)胞上蛋白質(zhì)未表達(dá)。還通過免疫熒光觀察到ssea4的表達(dá)，并且表達(dá)模式與oct4觀察到的類似(圖1)。這些結(jié)果與hesc細(xì)胞系h1上發(fā)現(xiàn)的表達(dá)模式相符，而且表明從人包皮成纖維細(xì)胞crl2522“bj”細(xì)胞衍生了多能干細(xì)胞(圖1)。

實(shí)例5

根據(jù)本發(fā)明方法衍生的多能干細(xì)胞的分化

使用幾種方法使根據(jù)本發(fā)明方法從人包皮成纖維細(xì)胞或羊水細(xì)胞產(chǎn)生的多能干細(xì)胞分化，以確定它們的多能性。使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，以及表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。另外，當(dāng)置于非貼壁懸浮培養(yǎng)物中時(shí)，通過本發(fā)明方法制備的多能干細(xì)胞顯示出能形成胚狀體。

通過用de培養(yǎng)基處理多能干細(xì)胞，使本發(fā)明的多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系(de)特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，其中de培養(yǎng)基包括含有2％無脂肪酸牛血清白蛋白(fafbsa)、20ng/mlwnt3a、8ng/mlbfgf和100ng/ml激活素a的rpmi1640培養(yǎng)基。在分化的第2天和第3天，從de培養(yǎng)基移除wnt3a。培養(yǎng)3天后通過tryple^tm處理解離樣品，并且通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定標(biāo)志物cd184(cxcr4蛋白)的表達(dá)，該標(biāo)志物與定形內(nèi)胚層的形成相關(guān)。當(dāng)定向分化為定形內(nèi)胚層時(shí)，羊水來源多能干細(xì)胞1和2(afd1和afd2)的cxcr4和cd99表達(dá)水平與h1人胚胎干細(xì)胞相似。通過qrt-pcr確定這些結(jié)果，該結(jié)果顯示de特征性基因(cxcr4、sox17、gsc、cer1和foxa2)的誘導(dǎo)與人es細(xì)胞系h1相比顯著相似(圖7)。

人包皮成纖維細(xì)胞crl2522來源多能干細(xì)胞也觀察到相似的結(jié)果。使crl2522來源多能干細(xì)胞的8個(gè)克隆分化為定形內(nèi)胚層，并且每個(gè)克隆的de標(biāo)志物cxcr4表達(dá)水平都得到提高，與h1hes細(xì)胞對(duì)照組cxcr4的60％陽性相比，其表達(dá)水平在23.4％至58.3％陽性的范圍內(nèi)(表2)。如免疫熒光所檢測(cè)，向de分化的crl2522來源多能干細(xì)胞樣品也觀察到sox17的高水平表達(dá)，sox17是定形內(nèi)胚層特征性轉(zhuǎn)錄因子，并且是定形內(nèi)胚層所需的(圖8)。這些結(jié)果表明，如通過流式細(xì)胞術(shù)、qrt-pcr和免疫熒光所測(cè)量的，af和crl2522來源多能干細(xì)胞形成定形內(nèi)胚層的比率與人胚胎干細(xì)胞系h1的de形成相符。

在正常發(fā)育中，定形內(nèi)胚層可形成多個(gè)譜系，包括肺、腸、肝、胰腺、胸腺和甲狀腺。使用顯示出可促進(jìn)h1人胚胎干細(xì)胞中的胰腺命運(yùn)的方案，使de定向分化為表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。除de形成第一階段之外的附加分化階段包括：第2階段：在含2％fafbsa、0.25mmsant-1和50ng/mlfgf-7的rpmi1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天；第3階段：在含0.5xits、0.1％bsa、0.25μmsant-1、50ng/mlfgf-7、100ng/ml成頭蛋白、20ng/ml激活素a和2μmra的dmem高葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)四天；第3.5階段：在含0.5xits、0.1％bsa、10ng/mlfgf-7和100ng/ml成頭蛋白的dmem高葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天；第4階段：在含0.5xits、0.1％bsa、10ng/mlfgf-7、100ng/ml成頭蛋白和1μmalk5抑制劑的dmem高葡萄糖中培養(yǎng)3天；以及第5階段：在含0.5xits、0.1％bsa、100ng/ml成頭蛋白和1μmalk5抑制劑的dmem高葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。

使用該方法觀察到胰腺激素：胰島素、胰高血糖素和生長抑素表達(dá)的顯著增加，以及胰島β細(xì)胞共有的轉(zhuǎn)錄因子(包括nkx6.1、pdx1和neurod)的增加，如通過qrt-pcr在羊水和crl2522細(xì)胞來源psc中所測(cè)量(表3)。還觀察到通過第5階段分化的羊水來源多能干細(xì)胞的nkx6.1表達(dá)和pdx1表達(dá)，如免疫熒光所測(cè)量(圖9)。這些結(jié)果表明af或crl2522細(xì)胞來源多能干細(xì)胞能夠形成內(nèi)胚層，并且可向胰腺命運(yùn)分化。

除了通過定向分化確定af和crl2522來源多能干細(xì)胞的多能性之外，還使用胚狀體形成試驗(yàn)測(cè)試了細(xì)胞是否能夠形成所有三個(gè)胚層。af或crl2522細(xì)胞來源多能干細(xì)胞在涂布matrigel的培養(yǎng)物表面上生長，并且通過以下方式剝離表面：用0.1％分散酶溶液溫育細(xì)胞，用補(bǔ)充有10％fbs的dmem培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，用橡膠刮刀剝離細(xì)胞，然后將dmem培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10％fbs)中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到低結(jié)合培養(yǎng)皿，進(jìn)行非貼壁懸浮培養(yǎng)。在含高血清的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)生長的多能干細(xì)胞將自發(fā)形成胚狀體；球形多細(xì)胞結(jié)構(gòu)由所有三個(gè)胚層譜系組成。譜系的形成通過qrt-pcr測(cè)試每個(gè)譜系(中胚層、內(nèi)胚層和外胚層)共有的基因表達(dá)確定。af或crl2522細(xì)胞來源多能干細(xì)胞形成胚狀體，并且基因表達(dá)模式表明存在所有三個(gè)胚層(圖10)。

神經(jīng)元/外胚層譜系標(biāo)志物(cdh2和otx)的水平升高，而中內(nèi)胚層(t)和定形內(nèi)胚層的早期標(biāo)志物(sox17、afp、foxa2和cxcr4)的水平也升高，正如中胚層和定形內(nèi)胚層共有的標(biāo)志物(gsc、cer1、gata4和mixl1)以及存在于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和β胰島細(xì)胞的標(biāo)志物(mnx)(圖10)。這些結(jié)果表明從af或crl2522細(xì)胞產(chǎn)生的多能干細(xì)胞的確是多能的，并且能夠從三個(gè)胚層中的每個(gè)產(chǎn)生組織。

實(shí)例6

當(dāng)細(xì)胞在無飼養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的情況下培養(yǎng)時(shí)，rho激酶對(duì)本發(fā)明的多能干細(xì)胞培養(yǎng)物的抑制效果

將多能干細(xì)胞系afd1維持在nunclondelta^tm平板上的mef調(diào)理培養(yǎng)基中，該平板在研究前用低生長因子matrigel^tm的1∶30稀釋液處理。通過1mg/ml分散酶分離，將細(xì)胞從表面分離以進(jìn)行傳代。然后將afd1細(xì)胞接種于表面改性平板4(6孔格式)的未處理孔上。平行地，將afd1細(xì)胞也接種在nunclondelta^tm平板上，該平板用低生長因子matrigel^tm的1∶30稀釋液處理，以提供陽性對(duì)照。在所有處理中，細(xì)胞均維持于mef條件培養(yǎng)基中。

接種于表面改性平板4的afd1細(xì)胞會(huì)貼壁，然而貼壁效率大大低于對(duì)照平板(圖11)。向培養(yǎng)基中添加rho激酶抑制劑后，貼壁效率大大增加。在培養(yǎng)的最初24小時(shí)內(nèi)添加10μm濃度的y-27632或3μm濃度的h1152-甘氨酰，會(huì)使細(xì)胞的接種效率顯著增加到類似于對(duì)照平板所觀察到的速率(圖11)。此后將細(xì)胞分別維持在10μm恒定濃度的y-27632或1μm低濃度的h1152-甘氨酰中，每天更換培養(yǎng)基。

在存在y-27632或h1152-甘氨酰的情況下，將細(xì)胞在表面改性平板4上傳代兩次，并且通過qrt-pcr測(cè)試多能性相關(guān)基因的表達(dá)(圖12)。與對(duì)照平板上生長的細(xì)胞相比，多能性相關(guān)和必需的基因(oct4、nanog、sox2、tert和cripto/tdgf)的表達(dá)在改性表面4上生長的afd1細(xì)胞中得到保持。還觀察到與自發(fā)分化相關(guān)的若干基因(afp、hand2和gata2)向胚外外胚層或滋養(yǎng)層命運(yùn)的相對(duì)表達(dá)顯著降低。這可能是由于nanog表達(dá)量增加，nanog通過抑制胚外外胚層或滋養(yǎng)層相關(guān)基因的表達(dá)抑制分化。另外，與對(duì)照平板相比，在改性表面4上通過差速貼壁和增殖多能性更高且分化程度更小的細(xì)胞，可出現(xiàn)胚外外胚層或滋養(yǎng)層相關(guān)基因表達(dá)的降低。

改性表面4上生長的細(xì)胞的多能性也通過測(cè)試它們分化為定形內(nèi)胚層的能力確定。觀察到，在改性表面4上、補(bǔ)充有rho激酶抑制劑的mef調(diào)理培養(yǎng)基中生長數(shù)代后分化為de的細(xì)胞，顯示出de分化相關(guān)基因的強(qiáng)效表達(dá)，相當(dāng)于h1hes分化為de觀察到的表達(dá)水平和模式(圖13)。另外，當(dāng)通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試時(shí)，用rho激酶抑制劑培養(yǎng)兩代且在改性表面4上分化的afd1細(xì)胞具有63％的cxcr4(一種定形內(nèi)胚層形成相關(guān)表面蛋白)陽性表達(dá)，并且該表達(dá)水平與分化為de的h1hes細(xì)胞中觀察到的表達(dá)水平相符(60％cxcr4陽性；表2)。

表1：本發(fā)明使用的轉(zhuǎn)導(dǎo)條件匯總

表2：crl2522細(xì)胞來源多能干細(xì)胞分化后，定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的表達(dá)

表3：衍生自crl2522和羊水來源細(xì)胞的多能干細(xì)胞分化后，胰內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的表達(dá)

在整篇文檔中引用的出版物據(jù)此全文以引用方式并入。盡管上文已結(jié)合實(shí)例和優(yōu)選實(shí)施例描述了本發(fā)明的各個(gè)方面，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的范圍不受上述具體實(shí)施方式的限定，而受以下在專利法原則下恰當(dāng)理解的權(quán)利要求書的限定。