本發(fā)明涉及豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測方法，屬于熒光定量RT-PCR
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus，簡稱CSFV）和牛病毒性腹瀉病毒(Bovineviraldiarrheavirus，簡稱BVDV)同屬于黃病毒科、瘟病毒屬，長久以來，它們所引起的傳染病給養(yǎng)牛、養(yǎng)豬和養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。BVDV在世界范圍內(nèi)廣泛分布,山羊、綿羊、豬,鹿及小袋鼠等動物都是BVDV的宿主和傳染源。BVDV與CSFV的核苷酸序列約有60%的同源性，氨基酸約有85%的同源性，多克隆抗體對兩種病毒具有血清學(xué)交叉反應(yīng)。首先，CSFV與BVDV在自然條件下感染豬，其臨床癥狀和病理變化相似；其次，在獸用疫苗生產(chǎn)中,常使用牛血清、牛睪丸細(xì)胞、胰酶等牛源材料作為原材料，一旦這些原料被污染了BVDV,則必將導(dǎo)致疫苗產(chǎn)品的污染，尤其是豬用疫苗被污染BVDV后，會導(dǎo)致免疫豬感染，造成自身類似豬瘟的臨床癥狀，給豬瘟的診斷帶來困難外,還會成為污染源。CN101058830A公開了“豬瘟病毒熒光定量一診斷試劑盒”，CN101328506A公開了“一種特異檢測豬瘟病毒野毒感染的熒光定量快速診斷試劑盒及其應(yīng)用方法”；兩篇文獻(xiàn)均只對CSFV進(jìn)行了單獨(dú)檢測。OIE公布了檢測BVDV的引物探針序列，標(biāo)注不能區(qū)分豬瘟病毒；CN103397107A公開了“牛病毒性腹瀉病毒熒光定量一檢測試劑盒”，但只對BVDV進(jìn)行單獨(dú)檢測。臨床檢測結(jié)果表明，現(xiàn)有的CSFV或BVDV熒光定量RT-PCR試劑盒無法區(qū)分CSFV與BVDV。目前，針對CSFV和BVDV感染的聯(lián)合檢測方法還未完善,而對豬源BVDV的檢測也仍然在探索階段；還沒有能夠同時對豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒進(jìn)行同時檢測的相關(guān)試劑。技術(shù)實現(xiàn)要素：基于CSFV與BVDV基因序列相似，普通RT-PCR難以區(qū)分兩者的事實；本發(fā)明的目的在于提供一種具可區(qū)分豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的雙重?zé)晒舛縍T-PCR的檢測方法。技術(shù)方案一組熒光定量RT-PCR檢測用引物和探針，由第一組引物和探針或/和第二組引物和探針組成；所述第一組引物和探針為：CSFV-F：ATACATAAAGCCCGGCCCTG，如SEQIDNO.1所示；CSFV-R：CTTGCCATCACTACCCGTGA，如SEQIDNO.2所示；CSFV探針P：FAM-CCAGGACTACATGGGCCCAGTCTATCAC-BHQ1，如SEQIDNO.3所示；所述第二組引物和探針為：BVDV-F：AGCAACAGTGGTGAGTTCGT，如SEQIDNO.4所示；BVDV-R：CGTGGCATCTCGAGACCTTT，如SEQIDNO.5所示；BVDV探針P：HEX\VIC-ATGGCTTAAGCCCTGAGTACA-BHQ1，如SEQIDNO.6所示。本發(fā)明的上述引物和探針：其中第一組引物和探針用于擴(kuò)增豬瘟病毒特異序列，第二組引物和探針用于擴(kuò)增牛病毒性腹瀉病毒特異序列。第一組引物和探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列唯一與豬瘟病毒基因序列保守區(qū)（533bp-671bp）一致；第二組引物和探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列唯一與BVDV基因序列保守區(qū)（142bp-237bp）一致。采用本發(fā)明的上述引物進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測，能夠?qū)SFV與BVDV區(qū)分開來，解決了現(xiàn)有CSFV或BVDV熒光定量RT-PCR試劑盒無法區(qū)分CSFV與BVDV的技術(shù)問題。一種豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測試劑，含有上述引物和探針。上述檢測試劑，其組成為：DEPCH2O：2.75ul5×Buffer：2.5ul10×Buffer：1.25ul2.5mMdNTP：2ulCSFV-F:0.5ulCSFV-R:1ulCSFV探針P：0.5ulBVDV-F:0.5ulBVDV-R:1ulBVDV探針P：0.5ul20uMMgCl2：1.5ul酶混合物：1ul；所述CSFV-F、CSFV-R、CSFV探針P、BVDV-F、BVDV-R、BVDV探針P的濃度均為10μmol/L。上述檢測試劑，為檢測一份樣品的用量。一種豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測方法；將待測樣品的核酸10ul與15ul上述檢測試劑配成25ul的反應(yīng)體系，然后進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，讀取結(jié)果；所述熒光定量RT-PCR反應(yīng)：第一階段：反轉(zhuǎn)錄42℃/30min；第二階段：預(yù)變性94℃/3min；第三階段：92℃/15sec，45℃/30sec，72℃/60sec，共5個循環(huán)；第四階段：92℃/10sec，56℃/60sec，共40個循環(huán)；最后40℃/10sec；在第四階段每次循環(huán)的退火56℃延伸時收集熒光；所述讀取結(jié)果：如果FAM檢測通道出現(xiàn)“S”形擴(kuò)增曲線，且Ct值小于或等于30，則樣品中含有CSFV；如果HEX\VIC檢測通道出現(xiàn)“S”形擴(kuò)增曲線，且Ct值小于或等于30，則樣品中含有BVDV。上述檢測方法，用于擴(kuò)增豬瘟病毒特異序列的引物和探針為：引物CSFV-F、CSFV-R和CSFV探針P；用于擴(kuò)增牛病毒性腹瀉病毒特異序列的的引物和探針為：BVDV-F、引物BVDV-R和BVDV探針P。對上述檢測方法獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，CSFV探針P僅出現(xiàn)在與豬瘟病毒基因序列保守區(qū)（533bp-671bp）一致的擴(kuò)增產(chǎn)物中，BVDV探針P僅出現(xiàn)在與牛病毒性腹瀉病毒病毒基因序列保守區(qū)（142bp-237bp）一致的擴(kuò)增產(chǎn)物中。說明，每組引物和探針能排除另外一組引物和探針的干擾；因此，本發(fā)明的檢測方法能夠同時檢測豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒。有益效果采用本發(fā)明的上述引物進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測，能夠?qū)SFV與BVDV區(qū)分開來。本發(fā)明的檢測方法能夠同時檢測豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒。在本發(fā)明的檢測方法中，豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測方法采用病毒RNA柱式提取試劑盒，提取時間短，整個檢測過程不到3個小時，采取閉管反應(yīng)，檢測完畢直接處理，避免開蓋造成氣溶膠污染。過程簡單、檢測時間短、靈敏度高。附圖說明圖1-2為特異性實驗的擴(kuò)增結(jié)果圖；圖1中的“S”型曲線為CSFV的擴(kuò)增曲線，圖2中的“S”型曲線為BVDV的擴(kuò)增曲線，圖1、2中的直線均為豬藍(lán)耳病病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和陰性對照的陰性檢測結(jié)果；圖3-4為重復(fù)性實驗的擴(kuò)增結(jié)果圖；圖3中的“S”型曲線為豬瘟病毒不同毒株的擴(kuò)增曲線，圖4中的“S”型曲線為牛病毒性腹瀉病毒不同毒株的擴(kuò)增曲線，圖3、4中的直線均為陰性對照的檢測結(jié)果；圖5-6為靈敏度實驗的擴(kuò)增結(jié)果圖；圖5中的“S”型曲線為不同濃度的豬瘟病毒的擴(kuò)增曲線，其中，從上到下的四條曲線依次對應(yīng)稀釋10-1、10-2、10-3、10-4倍后的CSFV的擴(kuò)增曲線，稀釋10-5、10-6倍后的CSFV的擴(kuò)增曲線呈直線，陰性對照的檢測結(jié)果為直線；圖6中的“S”型曲線為不同濃度的BVDV的擴(kuò)增曲線，其中，從上到下的5條曲線依次對應(yīng)稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍后的BVDV的擴(kuò)增曲線，稀釋10-6倍后的CSFV的擴(kuò)增曲線呈直線，陰性對照的檢測結(jié)果為直線；由此可見，稀釋10-5、10-6倍后的CSFV的檢測結(jié)果呈陰性，稀釋10-6倍后的CSFV的檢測結(jié)果呈陰性。具體實施方式本具體實施方式中，所涉及的豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus），記載于2015年1月至2016年7月從發(fā)病的豬中分離鑒定得到的；現(xiàn)保存在山東省動物疫病預(yù)防與控制中心。所涉及的牛病毒性腹瀉病毒(Bovineviraldiarrheavirus)，記載于2013年1月至2014年7月從發(fā)病的豬中分離鑒定得到的；現(xiàn)保存在山東省動物疫病預(yù)防與控制中心。所涉及的豬藍(lán)耳病病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus），記載于2015年1月至2016年7月從發(fā)病的豬中分離鑒定得到的；現(xiàn)保存在山東省動物疫病預(yù)防與控制中心。所涉及的豬流行性腹瀉病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus）記載于2015年1月至2016年7月從發(fā)病的豬中分離鑒定得到的；現(xiàn)保存在山東省動物疫病預(yù)防與控制中心。所涉及的豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissiblegastroenteritisvirus）記載于2015年1月至2016年7月從發(fā)病的豬中分離鑒定得到的；現(xiàn)保存在山東省動物疫病預(yù)防與控制中心。設(shè)計引物和探針用于擴(kuò)增豬瘟病毒特異序列的引物和探針：上游引物CSFV-F：ATACATAAAGCCCGGCCCTG，如SEQIDNO.1所示；下游引物CSFV-R：CTTGCCATCACTACCCGTGA，如SEQIDNO.2所示；CSFV探針P：FAM-CCAGGACTACATGGGCCCAGTCTATCAC-BHQ1，如SEQIDNO.3所示；用于擴(kuò)增牛病毒性腹瀉病毒特異序列的的引物和探針：上游引物BVDV-F：AGCAACAGTGGTGAGTTCGT，如SEQIDNO.4所示；下游引物BVDV-R：CGTGGCATCTCGAGACCTTT，如SEQIDNO.5所示；BVDV探針P：HEX\VIC-ATGGCTTAAGCCCTGAGTACA-BHQ1，如SEQIDNO.6所示。特異性試驗1.2.1選取CSFV和BVDV原毒液，各取200ul于1.5ml離心管中。采用北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司的病毒RNA柱式提取試劑盒，參照說明書分別提取病毒液的核酸。同時將實驗室保存的豬藍(lán)耳病病毒3株，豬流行性腹瀉病毒3株，豬傳染性胃腸炎病毒3株，共9株病毒液。取這9株病毒液各200ul于1.5ml離心管中，采用北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司的病毒RNA柱式提取的試劑盒，參照說明書提取9份病毒液的核酸。將上述3株豬藍(lán)耳病病毒、3株豬流行性腹瀉病毒、3株豬傳染性胃腸炎病毒的核酸及豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的核酸進(jìn)行下述檢測：取配好的反應(yīng)液15ul，分別加入10ul上述核酸，最終配成25ul的反應(yīng)體系。反應(yīng)液配方如表1所示：表1組成量（uL）10μmol/L的CSFV-F0.510μmol/L的CSFV-R110μmol/L的CSFV探針P0.510μmol/L的BVDV-F0.510μmol/L的BVDV-R110μmol/L的BVDV探針P0.5DEPCH2O2.7510×Buffer1.255×Buffer2.5MgCl2（20mmol/L）1.5dNTP（25mmol/L）2酶混合物1將反應(yīng)體系上機(jī)進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，然后讀取結(jié)果。熒光定量PCR的反應(yīng)參數(shù)如下設(shè)置：第一階段：反轉(zhuǎn)錄42℃/30min；第二階段：預(yù)變性94℃/3min；第三階段：92℃/15sec，45℃/30sec，72℃/60sec，共5個循環(huán)；第四階段：92℃/10sec，56℃/60sec，共40個循環(huán)；最后40℃10sec；在第四階段每次循環(huán)的退火56℃延伸時收集熒光。結(jié)果讀?。簩τ诙嗤ǖ繮CR儀，分別利用FAM（465-510）通道和HEX\VIC（533-580）通道讀取結(jié)果；若用ABI儀器，分別選擇FAM熒光素對應(yīng)的通道和HEX熒光素對應(yīng)的通道無熒光淬滅基團(tuán)，讀取結(jié)果。本發(fā)明采用的是多通道PCR儀（包括ABI儀器）：在FAM（465-510）通道出現(xiàn)一條“S”型擴(kuò)增曲線，如圖1所示；因為檢測CSFV的探針以FAM熒光素標(biāo)記的,所以用FAM（465-510）通道接收的熒光信號為標(biāo)記FAM熒光素探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線，為CSFV的擴(kuò)增曲線。在HEX\VIC（533-580）通道出現(xiàn)一條“S”型擴(kuò)增曲線，如圖2所示；因為檢BVDV的探針以HEX熒光素標(biāo)記的,所以用HEX（533-580）通道接收的熒光信號為標(biāo)記HEX熒光素探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線，為BVDV的擴(kuò)增曲線。對反應(yīng)體系中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序；其中，標(biāo)記有CSFV探針P的擴(kuò)增產(chǎn)物，其序列為：atacataaagcccggccctgtctactaccaggactacatgggcccagtctatcacagagctcctttagagttctttgatgaggcccagttctgcgaggtgactaagagaataggcagggtcacgggtagtgatggcaag，如SEQIDNO.7所示，該序列唯一與豬瘟病毒基因序列保守區(qū)（533bp-671bp）一致；標(biāo)記有BVDV探針P的擴(kuò)增產(chǎn)物，其序列為：agcaacagtggtgagttcgttggatggcttaagccctgagtacagggtagtcgtcagtggttcgacgccttggaataaaggtctcgagatgccacg，如SEQIDNO.8所示，該序列唯一與BVDV基因序列保守區(qū)（142bp-237bp）一致。說明，引物CSFV-F、CSFV-R和CSFV探針P能特異性擴(kuò)增CSFV基因序列保守區(qū)，圖1的“S”型曲線為CSFV基因序列保守區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物的量的變化曲線。引物BVDV-F、BVDV-R和BVDV探針P能特異性擴(kuò)增BVDV基因序列保守區(qū)，圖2的“S”型曲線為BVDV基因序列保守區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物的量的變化曲線。而引物CSFV-F、CSFV-R和CSFV探針P，引物BVDV-F、BVDV-R和BVDV探針P，均不會對豬藍(lán)耳病病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒進(jìn)行擴(kuò)增。豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒雙重?zé)晒舛縍T-PCR不能檢測出混淆程度比較大的豬藍(lán)耳病病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒，具有很好的特異性。另外，CSFV探針P僅出現(xiàn)在與豬瘟病毒基因序列保守區(qū)（533bp-671bp）一致的擴(kuò)增產(chǎn)物中，BVDV探針P僅出現(xiàn)在與牛病毒性腹瀉病毒病毒基因序列保守區(qū)（142bp-237bp）一致的擴(kuò)增產(chǎn)物中，說明，每組引物和探針能排除另外一組引物和探針的干擾。重復(fù)性試驗選取經(jīng)鑒定的豬瘟病毒毒株10株，選取經(jīng)鑒定的豬源牛病毒性腹瀉病毒毒株3株。取10株CSFV病毒液各200ul于10個不同的1.5ml離心管中；取3株BVDV（BVDV-1型2株、BVDV-2型1株）200ul于1.5ml離心管中；采用北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司的病毒RNA柱式提取的試劑盒，參照說明書分別提取13份病毒液的核酸。將10株豬瘟病毒的核酸與3株牛病毒性腹瀉病毒的核酸混合后分成30份，最后形成30份兩種病毒液混合的核酸；把兩種病毒液的混合核酸當(dāng)作熒光定量RT-PCR反應(yīng)的模板。熒光定量RT-PCR反應(yīng)采用15ul反應(yīng)液，10ul模板，共25ul的體系；反應(yīng)液配方如表1所示。取配好的反應(yīng)液15ul，加入混合好的兩種病毒液的核酸10ul，最終配成25ul的反應(yīng)體系，同時設(shè)定陰性對照（反應(yīng)液15ul+DEPC水10ul），采用多通道PCR儀進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，然后讀取結(jié)果。熒光定量RT-PCR的反應(yīng)參數(shù)如下設(shè)置：第一階段：反轉(zhuǎn)錄42℃/30min；第二階段：預(yù)變性94℃/3min；第三階段：92℃/15sec，45℃/30sec，72℃/60sec，共5個循環(huán)，第四階段：92℃/10sec，56℃/60sec，共40個循環(huán)；最后40℃10sec；在第四階段每次循環(huán)的退火56℃延伸時收集熒光。結(jié)果讀?。豪肍AM（465-510）通道讀取結(jié)果，如圖3所示；利用HEX\VIC（533-580）讀取結(jié)果，如圖4所示。由圖3可知,10株不同的豬瘟病毒都能檢測出陽性，結(jié)果在可控的范圍之內(nèi)；可見，此雙重?zé)晒舛縍T-PCR對于豬瘟病毒的檢測比較穩(wěn)定。由圖4可知：3份牛病毒性腹瀉病毒都能檢測出陽性，結(jié)果在可控的范圍之內(nèi)，可見此雙重?zé)晒舛縍T-PCR對于牛病毒性腹瀉病毒的檢測比較穩(wěn)定。靈敏度試驗選取經(jīng)鑒定純化的豬瘟病毒和豬源牛病毒性腹瀉病毒毒株各1株，應(yīng)用病毒RNA柱式提取試劑盒操作流程提取核酸，全波長酶標(biāo)儀(SpectraMax?i3x)測定OD260，OD260/280計算核酸濃度為40.748ng/ul(CSFV)、39.803ng/ul（BVDV），做10-1，10-2，10-3，10-4,10-5，10-6十進(jìn)位倍比稀釋。將稀釋濃度相同的病毒液的核酸各取10ul后充分混合，最后形成6份不同稀釋度的兩種病毒液混合的核酸，把不同稀釋度的兩種病毒液的混合核酸當(dāng)作熒光定量RT-PCR反應(yīng)的模板。熒光定量RT-PCR反應(yīng)采用15ul反應(yīng)液，10ul模板，共25ul的體系；反應(yīng)液配方如表1所示。取配好的反應(yīng)液15ul，加入混合好的三種細(xì)菌的核酸10ul，最終配成25ul的反應(yīng)體系；同時設(shè)定陰性對照（反應(yīng)液15ul+DEPC水10ul），采用多通道PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，然后讀取結(jié)果。熒光定量PCR的反應(yīng)參數(shù)如下設(shè)置：第一階段：反轉(zhuǎn)錄42℃/30min；第二階段：預(yù)變性94℃/3min；第三階段：92℃/15sec，45℃/30sec，72℃/60sec，共5個循環(huán)；第四階段：92℃/10sec，56℃/60sec，共40個循環(huán)；最后40℃10sec；在第四階段每次循環(huán)的退火56℃延伸時收集熒光。結(jié)果讀?。豪肍AM（465-510）通道讀取結(jié)果，如圖5所示；圖5顯示，CSFV的檢測極限是40.748pg/ul。利用HEX\VIC（533-580）讀取結(jié)果，如圖6所示；圖6顯示，BVDV的檢測極限是3.9803pg/ul。與現(xiàn)有無法區(qū)分CSFV與BVDV的熒光定量RT-PCR檢測試劑相比，本發(fā)明的雙重?zé)晒釸T-PCR試劑盒的靈敏性并沒有降低。<110>山東省動物疫病預(yù)防與控制中心<120>豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測方法<160>8<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1ATACATAAAGCCCGGCCCTG20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2CTTGCCATCACTACCCGTGA20<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>3CCAGGACTACATGGGCCCAGTCTATCAC28<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4AGCAACAGTGGTGAGTTCGT20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5CGTGGCATCTCGAGACCTTT20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>6ATGGCTTAAGCCCTGAGTACA21<210>7<211>139<212>DNA<213>人工序列<400>7atacataaagcccggccctgtctactaccaggactacatgggcccagtctatcacagagc60tcctttagagttctttgatgaggcccagttctgcgaggtgactaagagaataggcagggt120cacgggtagtgatggcaag139<210>8<211>96<212>DNA<213>人工序列<400>8agcaacagtggtgagttcgttggatggcttaagccctgagtacagggtagtcgtcagtgg60ttcgacgccttggaataaaggtctcgagatgccacg96當(dāng)前第1頁1 2 3