本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)領域，具體涉及一種枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)方法，還涉及上述的枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)過程中專用的設備。

背景技術：

枯草芽孢桿菌是在自然界廣泛存在的一種好氧的產芽抱桿菌，它具有很強的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等酶活性，代謝旺盛，對人畜無害，不污染環(huán)境。近幾年，枯草芽孢桿菌作為一種安全、高效、多功能和極具開發(fā)潛力的微生物菌種已廣泛應用于工業(yè)、農業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、食品、畜牧業(yè)、水產及科研諸領域。

芽孢是細菌營養(yǎng)體在必需養(yǎng)料即將耗盡時，在細胞內形成的含水量極低、抗逆性極強的休眠體。很多研究表明，枯草芽抱桿菌所產生的芽孢具有耐熱、耐旱、抗紫外線和有機溶劑等多種抗逆性，由于芽孢極強的抗逆性，在工業(yè)機械化生產及高溫干燥的過程中，可以保證微生物菌劑的活性，提高其產品質量。目前，在工業(yè)生產過程中主要存在芽孢形成率不高、生產成本過高等問題。

因此，需要從培養(yǎng)工藝和培養(yǎng)設備上入手，發(fā)明一種高效培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的方法，通過一種逐步改變培養(yǎng)條件的連續(xù)培養(yǎng)方式，提高枯草芽抱桿菌發(fā)酵過程中的芽孢數(shù)量，同時降低生產成本，實現(xiàn)枯草芽孢桿菌的高效生產。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決上述的技術問題，本發(fā)明提供了一種高效生產枯草芽孢桿菌的設備；

本發(fā)明還提供了高效的培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的方法，采用本發(fā)明的三級連續(xù)培養(yǎng)方法生產得到的枯草芽孢桿菌，其活菌數(shù)可達到100-130億/mL，其芽孢率高達93％以上；

本發(fā)明的枯草芽孢桿菌的連續(xù)培養(yǎng)方法具體步驟如下：

(1)種子培養(yǎng)

a.試管斜面菌種活化

將保存的枯草芽孢桿菌菌種轉接到試管斜面培養(yǎng)基上，保持32-35℃，培養(yǎng)24-36小時進行菌種活化；

試管斜面培養(yǎng)基配方為：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl 1g/L，牛肉膏0.5g/L，瓊脂20g/L，pH7.0-7.5，121℃滅菌20分鐘；

b.三角瓶種子培養(yǎng)

從活化好的試管中挑取1-2環(huán)菌種接種到三角瓶中，接種后保持32-35℃，100-150rpm，培養(yǎng)16-18小時；

三角瓶培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，NaCl5g/L，牛肉膏0.5g/L，pH7.0-7.5，121℃滅菌30分鐘；

c.種子罐菌種培養(yǎng)

將上述培養(yǎng)好的三角瓶菌種按0.5-1％接種量接種到種子罐中的培養(yǎng)料A中，培養(yǎng)溫度30-32℃，通氣量0.5-1(V/V·min)，轉速100-150rpm，培養(yǎng)18-20小時；

種子罐培養(yǎng)料A配方為：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，蛋白胨15g/L，牛肉膏0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl₂ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L，KH₂PO₄ 0.3g/L，K₂HPO₄ 0.7g/L，消泡劑1g/L，pH7.0-7.5，該培養(yǎng)料經連消裝置滅菌后，輸送至種子罐中。

(2)取培養(yǎng)料B：培養(yǎng)料B配料為，淀粉20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉30g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl₂ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L，KH₂PO₄ 0.3g/L，K₂HPO₄ 0.7g/L，MnSO₄5mg/L，消泡劑1g/L，pH7.0-7.5；

(3)將步驟(2)中的培養(yǎng)料B經滅菌處理后輸送至一級培養(yǎng)罐，然后將種子罐中培養(yǎng)好的菌種接種至一級培養(yǎng)罐發(fā)酵培養(yǎng)；將所得的一級發(fā)酵液送至二級培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，得到的二級發(fā)酵液送至芽孢培養(yǎng)罐中培養(yǎng),得到含有枯草芽孢桿菌的終產物發(fā)酵液。

上述的枯草芽孢桿菌的連續(xù)培養(yǎng)方法中，

一級培養(yǎng)罐培養(yǎng)條件為，溫度33-35℃，攪拌槳轉速150rpm，通風量0.6-0.8(V/V·min)；

二級培養(yǎng)罐培養(yǎng)條件為，溫度33-35℃，攪拌槳轉速200rpm，通風量0.8-1.1(V/V·min)；

芽孢培養(yǎng)罐培養(yǎng)條件為，溫度38-40℃，攪拌槳轉速150rpm，通風量0.6-0.8(V/V·min)。

步驟(1)中培養(yǎng)料A的滅菌處理時，將配料罐中的物料通過輸送泵Ⅰ輸送至連消裝置滅菌，再輸送至維持罐中暫存，通過輸送泵Ⅱ將暫存的物料送至冷卻裝置中冷卻至30-37℃，將冷卻后的物料送至種子罐中；

步驟(3)中培養(yǎng)料B的滅菌處理步驟具體為，將配料罐中的物料通過輸送泵Ⅰ輸送至連消裝置滅菌，再輸送至維持罐中暫存，通過輸送泵Ⅱ將暫存的物料送至冷卻裝置中冷卻至30-37℃，將冷卻后的物料送至料液儲罐，從料液儲罐中將物料送至一級培養(yǎng)罐培養(yǎng)。

每次輸送至發(fā)酵罐的培養(yǎng)料B的體積為一級發(fā)酵罐總容積的80％。

從種子罐接種0.5-1％的種子到一級培養(yǎng)罐，培養(yǎng)6-10小時，然后從料液儲罐中以恒定速度輸入培養(yǎng)料B至一級培養(yǎng)罐，得到一級發(fā)酵液，同時以相同的速度將一級發(fā)酵液輸入滅過菌的二級培養(yǎng)罐，待二級培養(yǎng)罐內的二級發(fā)酵液達到罐體總體積的80％后，開始以同樣的速度將二級發(fā)酵液輸入滅過菌的芽孢培養(yǎng)罐，待芽孢培養(yǎng)罐內發(fā)酵液達到罐體總體積的80％后，開始以同樣的速度輸出發(fā)酵液。

每個連續(xù)生產的周期控制在10-12天以內，在一個生產周期內每隔24小時，取樣檢測是否污染雜菌，一旦發(fā)現(xiàn)污染雜菌，立即停止，重新滅菌開始新一輪生產。

上述的一級培養(yǎng)罐、二級培養(yǎng)罐、芽孢培養(yǎng)罐的體積比為2:2:1。

上述的發(fā)酵液控制其流經系統(tǒng)的速度，使一級培養(yǎng)罐和二級培養(yǎng)罐內發(fā)酵液的平均滯留培養(yǎng)時間均為6-10小時，芽孢培養(yǎng)罐內發(fā)酵液的平均滯留培養(yǎng)時間均為3-5小時，控制該連續(xù)系統(tǒng)內的平均總培養(yǎng)時間為15-25小時。

枯草芽孢桿菌的連續(xù)培養(yǎng)方法，包括下述的步驟：

(1)種子培養(yǎng)

a.試管斜面菌種活化

將保存的枯草芽孢桿菌菌種轉接到試管斜面培養(yǎng)基上，保持33℃，培養(yǎng)30小時進行菌種活化；

試管斜面培養(yǎng)基配方為：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl1g/L，牛肉膏0.5g/L，瓊脂20g/L，pH7.1，121℃滅菌20分鐘；

b.三角瓶種子培養(yǎng)

從活化好的試管中挑取1-2環(huán)枯草芽孢桿菌菌種接種到三角瓶中，接種后保持33℃，120rpm，培養(yǎng)17小時；

三角瓶培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，NaCl5g/L，牛肉膏0.5g/L，pH7.1，121℃滅菌30分鐘；

c.種子罐菌種培養(yǎng)

將上述培養(yǎng)好的三角瓶菌種按0.8％接種量接種到種子罐中的培養(yǎng)料A中，培養(yǎng)溫度31℃，通氣量0.8(V/V·min)，轉速120rpm，培養(yǎng)19小時；

種子罐培養(yǎng)料A配方為：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，蛋白胨15g/L，牛肉膏0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl₂ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L，KH₂PO₄ 0.3g/L，K₂HPO₄ 0.7g/L，消泡劑1g/L，pH7.0-7.5，該培養(yǎng)料經連消裝置滅菌后，輸送至種子罐中；

(2)取培養(yǎng)料B：培養(yǎng)料B配料為，淀粉20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉30g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl₂ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L，KH₂PO₄ 0.3g/L，K₂HPO₄ 0.7g/L，MnSO₄5mg/L，消泡劑1g/L，pH7.0-7.5；

(3)將步驟(2)中的培養(yǎng)料B在配料罐中混合均勻，送至連消裝置滅菌，再輸送至維持罐中，經過冷卻裝置冷卻，將冷卻后的培養(yǎng)料B輸送至已滅菌處理的料液儲罐中；

培養(yǎng)料B從料液儲罐中輸入一級培養(yǎng)罐，輸入培養(yǎng)料的量為一級培養(yǎng)罐總體積的80％，

從種子罐接種0.5-1％的種子到一級培養(yǎng)罐的培養(yǎng)料A中，培養(yǎng)6-10小時后，再次連續(xù)開始從料液儲罐以恒定速度向一級培養(yǎng)罐中輸入培養(yǎng)料B；

一級培養(yǎng)罐發(fā)酵培養(yǎng)的條件為，溫度33-35℃，攪拌槳轉速150rpm，通風量0.6-0.8(V/V·min)；

同時以同樣速度將經一級培養(yǎng)罐發(fā)酵所得的一級發(fā)酵液輸入滅過菌的二級培養(yǎng)罐，待二級培養(yǎng)罐內的二級發(fā)酵液達到罐體總體積的80％后，開始以同樣的速度將所得的二級發(fā)酵液輸送至滅過菌的芽孢培養(yǎng)罐；所述的二級培養(yǎng)罐發(fā)酵培養(yǎng)條件為，溫度33-35℃，攪拌槳轉速200rpm，通風量0.8-1.1(V/V·min)；

待芽孢培養(yǎng)罐內發(fā)酵液達到罐體總體積的80％后，開始以同樣的速度輸出最終所得的發(fā)酵液，然后一直維持該系統(tǒng)的恒定連續(xù)發(fā)酵狀態(tài)；

芽孢培養(yǎng)罐培養(yǎng)條件為，溫度38-40℃，攪拌槳轉速150rpm，通風量0.6-0.8(V/V·min)。

本發(fā)明的枯草芽孢桿菌的連續(xù)培養(yǎng)方法專用的發(fā)酵系統(tǒng)，包括依次串聯(lián)連接的配料罐、連消裝置、維持罐、冷卻裝置、料液儲罐、一級培養(yǎng)罐、二級培養(yǎng)罐、芽孢培養(yǎng)罐；

冷卻裝置與一級培養(yǎng)罐之間并聯(lián)有種子罐；

芽孢培養(yǎng)罐連接有輔料罐；

配料罐與連消裝置之間連接有輸送泵Ⅰ；所述的維持罐與冷卻裝置之間有輸送泵Ⅱ；

儲料罐、一級培養(yǎng)罐、二級培養(yǎng)罐、芽孢培養(yǎng)罐之間均有恒流泵。

冷卻裝置產生的熱水可用于連消裝置預熱，從而減少能耗，節(jié)約成本。

本發(fā)明的有益效果在于，可以高度機械化和自動化，枯草芽孢桿菌的質量和品質比較穩(wěn)定均一；

本發(fā)明方法由于高度的自動化操作，減少了人為因素和與外界接觸的機會，從而減少了操作帶來的污染幾率，不易發(fā)生雜菌污染和菌種變異；

本發(fā)明方法實施過程中，各個培養(yǎng)罐體內的溫度探頭等檢測儀器無須經過多次高溫滅菌，減少損傷，延長各檢測儀器的壽命；

本發(fā)明方法耗費在非生產的準備時間比較少，提高了產量和生產效率；

本發(fā)明方法將菌種繁殖、菌體高速生長和芽孢產生的過程分別進行控制，使二級培養(yǎng)罐和芽孢培養(yǎng)罐的菌體一直處于一個比較高的濃度，有效提高了枯草芽孢桿菌菌體濃度和芽孢率。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的枯草芽孢桿菌連續(xù)培養(yǎng)的流程圖；

圖中，1-配料罐，2-連消裝置，3-維持罐，4-輸送泵Ⅰ，5-料液儲罐，6-一級培養(yǎng)罐，7-種子罐，8-二級培養(yǎng)罐，9-芽孢培養(yǎng)罐，10-輔料罐，11-冷卻裝置，12-輸送泵Ⅱ。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施方式來對本發(fā)明作更進一步的說明，以便本領域的技術人員更了解本發(fā)明，但并不以此限制本發(fā)明。

實施例1

枯草芽孢桿菌的連續(xù)培養(yǎng)方法專用的發(fā)酵系統(tǒng)，包括依次串聯(lián)連接的配料罐1、連消裝置2、維持罐3、冷卻裝置11、料液儲罐5、一級培養(yǎng)罐6、二級培養(yǎng)罐8、芽孢培養(yǎng)罐9；

冷卻裝置11與一級培養(yǎng)罐6之間并聯(lián)有種子罐7；

芽孢培養(yǎng)罐9連接有輔料罐10；

配料罐1與連消裝置2之間連接有輸送泵Ⅰ4；維持罐3與冷卻裝置11之間有輸送泵輸送泵Ⅱ12；

儲料罐、一級培養(yǎng)罐6、二級培養(yǎng)罐8、芽孢培養(yǎng)罐9之間均有恒流泵。

具體的步驟是，從種子罐7接種0.5-1％的枯草芽孢桿菌菌種到一級培養(yǎng)罐6的培養(yǎng)料A中，培養(yǎng)8-12小時，然后從料液儲罐5中以恒定速度輸入培養(yǎng)料B至一級培養(yǎng)罐6，得到一級發(fā)酵液，再以相同的速度將發(fā)酵液輸入滅過菌的二級培養(yǎng)罐8，待二級培養(yǎng)罐8內的二級發(fā)酵液達到罐體總體積的80％后，開始以同樣的速度將二級發(fā)酵液輸入滅過菌的芽孢培養(yǎng)罐9，待芽孢培養(yǎng)罐9內發(fā)酵液達到罐體總體積的80％后，開始以同樣的速度輸出終產物發(fā)酵液。

步驟(1)中培養(yǎng)料A的滅菌處理時，將配料罐1中的物料通過輸送泵Ⅰ4輸送至連消裝置2滅菌，再輸送至維持罐3中暫存，通過輸送泵Ⅱ12將暫存的物料送至冷卻裝置11中冷卻至30-37℃，將冷卻后的物料送至種子罐中；

步驟(3)中培養(yǎng)料B的滅菌處理步驟具體為，將配料罐1中的物料通過輸送泵Ⅰ4輸送至連消裝置2滅菌，再輸送至維持罐3中暫存，通過輸送泵Ⅱ12將暫存的物料送至冷卻裝置11中冷卻至30-37℃，將冷卻后的物料送至料液儲罐5，從料液儲罐5中將物料送至一級培養(yǎng)罐6培養(yǎng)。

實施例2

枯草芽孢桿菌的連續(xù)培養(yǎng)方法，包括下述的步驟：

(1)種子培養(yǎng)

a.試管斜面菌種活化

將保存的枯草芽孢桿菌菌種轉接到試管斜面培養(yǎng)基上，保持33℃，培養(yǎng)30小時進行菌種活化；

試管斜面培養(yǎng)基配方為：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl1g/L，牛肉膏0.5g/L，瓊脂20g/L，pH7.1，121℃滅菌20分鐘；

b.三角瓶種子培養(yǎng)

從活化好的試管中挑取1-2環(huán)枯草芽孢桿菌菌種接種到三角瓶中，接種后保持33℃，120rpm，培養(yǎng)17小時；

三角瓶培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，NaCl5g/L，牛肉膏0.5g/L，pH7.1，121℃滅菌30分鐘；

c.種子罐菌種培養(yǎng)

將上述配制好的三角瓶菌種按0.8％接種量接種到種子罐中的培養(yǎng)料A中，培養(yǎng)溫度31℃，通氣量0.8(V/V·min)，轉速120rpm，培養(yǎng)19小時；

種子罐培養(yǎng)料A配方為：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，蛋白胨15g/L，牛肉膏0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl₂ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L，KH₂PO₄ 0.3g/L，K₂HPO₄ 0.7g/L，消泡劑1g/L，pH7.0-7.5。該培養(yǎng)料經連消裝置滅菌后，輸送至種子罐中；

(2)取培養(yǎng)料B：培養(yǎng)料B配料為，淀粉20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉30g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl₂ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L，KH₂PO₄ 0.3g/L，K₂HPO₄ 0.7g/L，MnSO₄5mg/L，消泡劑1g/L，pH7.0-7.5；

(3)將步驟(2)中的培養(yǎng)料在配料罐中混合均勻，送至連消裝置滅菌，再輸送至維持罐中，經過冷卻裝置冷卻，將冷卻后的培養(yǎng)料輸送至已滅菌處理的料液儲罐中；

培養(yǎng)料從料液儲罐中輸入一級培養(yǎng)罐，輸入培養(yǎng)料的量為一級培養(yǎng)罐總體積的80％，從種子罐接種0.8％的種子到一級培養(yǎng)罐，培養(yǎng)8小時后，再次連續(xù)開始從料液儲罐以恒定速度向一級培養(yǎng)罐中輸入培養(yǎng)料；

一級培養(yǎng)罐發(fā)酵培養(yǎng)的條件為，溫度34℃，攪拌槳轉速150rpm，通風量0.7V/V·min；

同時以同樣速度將經一級培養(yǎng)罐6發(fā)酵所得的一級發(fā)酵液輸入滅過菌的二級培養(yǎng)罐8，待二級培養(yǎng)罐8內的二級發(fā)酵液達到罐體總體積的80％后，開始以同樣的速度將所得的二級發(fā)酵液輸送至滅過菌的芽孢培養(yǎng)罐9；二級培養(yǎng)罐8發(fā)酵培養(yǎng)條件為，溫度34℃，攪拌槳轉速200rpm，通風量0.9V/V·min；

待芽孢培養(yǎng)罐9內發(fā)酵液達到罐體總體積的80％后，開始以同樣的速度輸出最終所得的發(fā)酵液，然后一直維持該系統(tǒng)的恒定連續(xù)發(fā)酵狀態(tài)；

芽孢培養(yǎng)罐9培養(yǎng)條件為，溫度39℃，攪拌槳轉速150rpm，通風量0.7V/V·min。

一級培養(yǎng)罐6、二級培養(yǎng)罐7、芽孢培養(yǎng)罐9的體積比為2:2:1。

每個連續(xù)生產的周期控制在10-12天以內，在一個生產周期內每隔24小時，取樣檢測是否污染雜菌，一旦發(fā)現(xiàn)污染雜菌，立即停止，重新滅菌開始新一輪生產。

發(fā)酵液控制其流經系統(tǒng)的速度，使一級培養(yǎng)罐6和二級培養(yǎng)罐8內發(fā)酵液的平均滯留培養(yǎng)時間均為8小時，芽孢培養(yǎng)罐9內發(fā)酵液的平均滯留培養(yǎng)時間均為4小時，控制該連續(xù)系統(tǒng)內的平均總培養(yǎng)時間為20小時。

該系統(tǒng)可實現(xiàn)高度機械化和自動化，減少了人為因素和與外界接觸的機會，減少污染幾率，能夠連續(xù)獲得高質量且穩(wěn)定的發(fā)酵液，發(fā)酵液的枯草芽孢桿菌活菌數(shù)可達到約120億/mL左右，其芽孢率高達95.0％；

與傳統(tǒng)的分批生產相比較，本發(fā)明各個培養(yǎng)罐體內的溫度探頭等檢測儀器無須經過多次高溫滅菌，減少損傷，延長各檢測儀器的壽命；

本發(fā)明方法在其生產周期內，備料、滅菌需要10小時左右，進入培養(yǎng)罐后到開始收獲發(fā)酵液耗時15-25小時，然后一直有產品形成，一直是生產時間，即本發(fā)明的連續(xù)系統(tǒng)內每個周期的平均總培養(yǎng)時間為15-25小時；而傳統(tǒng)的分批生產每批次都需要備料、滅菌耗費6小時，種子罐培養(yǎng)耗時20小時，培養(yǎng)罐耗時28小時，清洗罐體耗時4小時，即每個周期的耗時為58小時，由此可見本發(fā)明耗費在非生產的準備時間比較少，每個生產周期約生產效率提高了1倍左右。

若將上述的培養(yǎng)過程的培養(yǎng)基和培養(yǎng)料調整如下：

試管斜面菌種活化中，試管斜面培養(yǎng)基配方為：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl1g/L，牛肉膏0.5g/L，瓊脂20g/L，pH7.0-7.5，121℃下滅菌20分鐘；

三角瓶培養(yǎng)基配方為：葡萄糖15g/L，豆粕粉16g/L，蛋白胨1g/L，NaCl1g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.3g/L，pH7.0-7.5，121℃滅菌20分鐘：

種子罐中的培養(yǎng)料A的配方為：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉20g/L，(NH4)2HPO4 0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.7g/L，消泡劑1g/L，pH7.0-7.5；

取培養(yǎng)料B：培養(yǎng)料B配料為，淀粉/葡萄糖25g/L，玉米粉6g/L，豆粕粉30g/L，(NH4)2HPO4 0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl2 1g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4 0.3g/L，MnSO4 5mg/L，消泡劑1g/L，pH7.0-7.5；

培養(yǎng)的方法完全相同，僅僅是將培養(yǎng)基和培養(yǎng)料作調整，發(fā)酵液的枯草芽孢桿菌活菌數(shù)可達到約90億/mL左右，其芽孢率為89.1％；本發(fā)明人在實驗過程中，同時也研究了地衣芽孢桿菌的連續(xù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)上述的培養(yǎng)對于地衣芽孢桿菌，其培養(yǎng)效果較好，但是該培養(yǎng)基和培養(yǎng)料，用于枯草芽孢桿菌，其效果要差一些，以上的實驗表明，本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，培養(yǎng)基、培養(yǎng)料的選擇，也會對芽孢率和活菌數(shù)產生影響。從培養(yǎng)料A送到種子罐中接種三角瓶中的菌種，然后將培養(yǎng)料B送至一級培養(yǎng)罐中，同時將經種子罐培養(yǎng)后中的菌種接種至一級培養(yǎng)罐中發(fā)酵，再經過二級培養(yǎng)罐中發(fā)酵，再轉入芽孢培養(yǎng)罐中發(fā)酵，至最后得到含有枯草芽孢桿菌的終產物發(fā)酵液，此為一個生產周期。

實施例3

枯草芽孢桿菌的連續(xù)培養(yǎng)方法，包括下述的步驟：

(1)種子培養(yǎng)

a.試管斜面菌種活化

將保存的枯草芽孢桿菌菌種轉接到試管斜面培養(yǎng)基上，保持32℃，培養(yǎng)24小時進行菌種活化；

試管斜面培養(yǎng)基配方為：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl1g/L，牛肉膏0.5g/L，瓊脂20g/L，pH7.0，121℃滅菌20分鐘；

b.三角瓶種子培養(yǎng)

從活化好的試管中挑取1-2環(huán)菌種接種到三角瓶中，接種后保持32℃，100rpm，培養(yǎng)16小時；

所述的三角瓶培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，NaCl5g/L，牛肉膏0.5g/L，pH7.0，121℃滅菌30分鐘；

c.種子罐菌種培養(yǎng)

將上述配制好的三角瓶菌種按0.5-1％接種量接種到種子罐中的培養(yǎng)料A中，培養(yǎng)溫度30℃，通氣量0.5(V/V·min)，轉速100rpm，培養(yǎng)18小時；

種子罐培養(yǎng)料A配方為：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，蛋白胨15g/L，牛肉膏0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl₂ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L，KH₂PO₄ 0.3g/L，K₂HPO₄ 0.7g/L，消泡劑1g/L，pH7.0-7.5。該培養(yǎng)料經連消裝置滅菌后，輸送至種子罐中。

(2)取培養(yǎng)料B：培養(yǎng)料B配料為，淀粉20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉30g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl₂ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L，KH₂PO₄ 0.3g/L，K₂HPO₄ 0.7g/L，MnSO₄5mg/L，消泡劑1g/L，pH7.0；

(3)將步驟(2)中的培養(yǎng)料在配料罐中混合均勻，送至連消裝置滅菌，再輸送至維持罐中，經過冷卻裝置冷卻，將冷卻后的培養(yǎng)料輸送至已滅菌處理的料液儲罐中；

培養(yǎng)料從料液儲罐中輸入一級培養(yǎng)罐，輸入培養(yǎng)料的量為一級培養(yǎng)罐總體積的80％，從種子罐接種0.5％的種子到一級培養(yǎng)罐，培養(yǎng)6小時后，再次連續(xù)開始從料液儲罐以恒定速度向一級培養(yǎng)罐中輸入培養(yǎng)料；

一級培養(yǎng)罐發(fā)酵培養(yǎng)的條件為，溫度33℃，攪拌槳轉速150rpm，通風量0.6(V/V·min)；

同時以同樣速度將經一級培養(yǎng)罐發(fā)酵所得的一級發(fā)酵液輸入滅過菌的二級培養(yǎng)罐，待二級培養(yǎng)罐內的二級發(fā)酵液達到罐體總體積的80％后，開始以同樣的速度將所得的二級發(fā)酵液輸送至滅過菌的芽孢培養(yǎng)罐；所述的二級培養(yǎng)罐發(fā)酵培養(yǎng)條件為，溫度33℃，攪拌槳轉速200rpm，通風量0.8(V/V·min)；

待芽孢培養(yǎng)罐內發(fā)酵液達到罐體總體積的80％后，開始以同樣的速度輸出最終所得的發(fā)酵液，然后一直維持該系統(tǒng)的恒定連續(xù)發(fā)酵狀態(tài)；

芽孢培養(yǎng)罐培養(yǎng)條件為，溫度38℃，攪拌槳轉速150rpm，通風量0.6(V/V·min)。

發(fā)酵液的枯草芽孢桿菌活菌數(shù)可達到約116億/mL，其芽孢率高達94.2％。

實施例4

枯草芽孢桿菌的連續(xù)培養(yǎng)方法，包括下述的步驟：

(1)種子培養(yǎng)

a.試管斜面菌種活化

將保存的枯草芽孢桿菌菌種轉接到試管斜面培養(yǎng)基上，保持35℃，培養(yǎng)36小時進行菌種活化；

試管斜面培養(yǎng)基配方為：葡萄糖4g/L，蛋白胨3g/L，NaCl1g/L，牛肉膏0.5g/L，瓊脂20g/L，pH7.5，121℃滅菌20分鐘；

b.三角瓶種子培養(yǎng)

從活化好的試管中挑取1-2環(huán)菌種接種到三角瓶中，接種后保持35℃，150rpm，培養(yǎng)18小時；

三角瓶培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，NaCl5g/L，牛肉膏0.5g/L，pH7.5，121℃滅菌30分鐘；

c.種子罐菌種培養(yǎng)

將上述配制好的三角瓶菌種按1％接種量接種到種子罐中的培養(yǎng)料A中，培養(yǎng)溫度32℃，通氣量1(V/V·min)，轉速150rpm，培養(yǎng)20小時；

種子罐培養(yǎng)料A配方為：葡萄糖20g/L，玉米粉5g/L，蛋白胨15g/L，牛肉膏0.5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl₂ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L，KH₂PO₄ 0.3g/L，K₂HPO₄ 0.7g/L，消泡劑1g/L，pH7.5；該培養(yǎng)料經連消裝置滅菌后，輸送至種子罐中；

(2)取培養(yǎng)料B：培養(yǎng)料B配料為，淀粉20g/L，玉米粉5g/L，豆粕粉30g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 2.5g/L，CaCl₂ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L，KH₂PO₄ 0.3g/L，K₂HPO₄ 0.7g/L，MnSO₄5mg/L，消泡劑1g/L，pH7.5；

(3)將步驟(2)中的培養(yǎng)料在配料罐中混合均勻，送至連消裝置滅菌，再輸送至維持罐中，經過冷卻裝置冷卻，將冷卻后的培養(yǎng)料輸送至已滅菌處理的料液儲罐中；

培養(yǎng)料從料液儲罐中輸入一級培養(yǎng)罐，輸入培養(yǎng)料的量為一級培養(yǎng)罐總體積的80％，從種子罐接種1％的種子到一級培養(yǎng)罐，培養(yǎng)10小時后，再次連續(xù)開始從料液儲罐以恒定速度向一級培養(yǎng)罐中輸入培養(yǎng)料；

一級培養(yǎng)罐發(fā)酵培養(yǎng)的條件為，溫度35℃，攪拌槳轉速150rpm，通風量0.8(V/V·min)；

同時以同樣速度將經一級培養(yǎng)罐發(fā)酵所得的一級發(fā)酵液輸入滅過菌的二級培養(yǎng)罐，待二級培養(yǎng)罐內的二級發(fā)酵液達到罐體總體積的80％后，開始以同樣的速度將所得的二級發(fā)酵液輸送至滅過菌的芽孢培養(yǎng)罐；所述的二級培養(yǎng)罐發(fā)酵培養(yǎng)條件為，溫度35℃，攪拌槳轉速200rpm，通風量1.1(V/V·min)；

待芽孢培養(yǎng)罐內發(fā)酵液達到罐體總體積的80％后，開始以同樣的速度輸出最終所得的發(fā)酵液，然后一直維持該系統(tǒng)的恒定連續(xù)發(fā)酵狀態(tài)；

芽孢培養(yǎng)罐培養(yǎng)條件為，溫度40℃，攪拌槳轉速150rpm，通風量0.8(V/V·min)。

發(fā)酵液的枯草芽孢桿菌活菌數(shù)可達到約118億/mL，其芽孢率高達94.6％。