本發(fā)明屬于醫(yī)藥化工領(lǐng)域,公開了一種L-瓜氨酸琥珀酸鹽及其制備方法和應(yīng)用。

技術(shù)背景

在國內(nèi)，對瓜氨酸的研究卻還只是處于認(rèn)識階段，生產(chǎn)方法沒有相應(yīng)的報道對其檢測方法和生理功能研究的也不多，只有少量的文獻(xiàn)報道。在瓜氨酸的生理功能方面，國外科學(xué)家已研究得出瓜氨酸具有一些很重要的藥理功能，如自由基清除作用，在人體的健康保健方面具有很重要的意義；血管舒張作用，這有望成為治療內(nèi)毒癥、膿毒癥的良藥。日本一科學(xué)家已研制出一種瓜氨酸新多肽并將該新多肽研究發(fā)展成抗艾滋病藥物。同時瓜氨酸被認(rèn)為是一種非常有效的抗氧化劑，這一功能已應(yīng)用于化妝品、藥物、保健食品等各個領(lǐng)域。近年來國外的眾多研究表明，瓜氨酸具有很多重要的生理功能，如清除自由基，異體排斥效應(yīng)指示劑，血管舒張作用，穩(wěn)定血壓以及診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，抗氧化等，應(yīng)用前景十分廣闊。

琥珀酸是在醫(yī)藥工業(yè)中用來生產(chǎn)磺胺藥、維生素A、維生素B等抗痙攣藥、利尿劑和止血藥物。琥珀酸已經(jīng)被美國FDA認(rèn)定為GRAS(一般認(rèn)為安全)，這使得它可用于多種用途。例如抗菌作用、抗?jié)冏饔?、增?qiáng)免疫功能和解毒作用。目前國內(nèi)還沒有L-瓜氨酸琥珀酸鹽的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種L-瓜氨酸琥珀酸鹽及其制備方法和在制藥中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是通過以下過程實現(xiàn)的：

一種L-瓜氨酸琥珀酸鹽，是由L-瓜氨酸與琥珀酸反應(yīng)后結(jié)晶獲得的鹽，其分子式如下所示：

所述的L-瓜氨酸琥珀酸鹽的制備方法，包括如下步驟：

1)將琥珀酸加入到L-瓜氨酸水溶液中，攪拌反應(yīng),得到L-瓜氨酸琥珀酸鹽溶液；

2)將步驟1)得到的L-瓜氨酸琥珀酸鹽溶液進(jìn)行結(jié)晶，干燥，得到L-瓜氨酸琥珀酸鹽。

L-瓜氨酸和琥珀酸的起始反應(yīng)摩爾比例為1.9-2.1:1。

所述L-瓜氨酸水溶液的濃度為180～250g/L。

所述反應(yīng)溫度為50～58℃，反應(yīng)時間40～45min。

所述結(jié)晶過程中pH為6-8,結(jié)晶時的溫度控制在15-50℃,攪拌轉(zhuǎn)速控制在150-200rpm。

步驟1)中優(yōu)選加入催化劑，例如鈀碳，加入催化劑可明顯縮短反應(yīng)時間，提高反應(yīng)效率。

結(jié)晶可以采取降溫、升溫、蒸發(fā)溶劑、加入反溶劑中的一種或多種方式，L-瓜氨酸琥珀酸鹽的結(jié)晶初始濃度為200～500g/L。

所述的反溶劑為親水有機(jī)溶劑,優(yōu)選以下物質(zhì)中的一種或者是多種的組合:甲醇、乙睛、丙醇、丙酮,所述的反溶劑的水溶液濃度在70-90％；反溶劑的添加速率為0.1～0.5mL/min,反溶劑的添加量為結(jié)晶液起始液體積的2-12倍。

將結(jié)晶的L-瓜氨酸琥珀酸鹽抽濾后用無水乙醇洗滌三次，得到L-瓜氨酸琥珀酸鹽的濕品，然后進(jìn)行干燥，將得到的L-瓜氨酸琥珀酸鹽濕品放到真空干燥箱中40℃干燥2h得到L-瓜氨酸琥珀酸鹽的成品。

所述的L-瓜氨酸琥珀酸鹽能夠可增強(qiáng)精子存活率，應(yīng)用于制備增強(qiáng)男性性功能或治療性功能障礙的藥物。

所述的L-瓜氨酸琥珀酸鹽可降解膽固醇，維持膽固醇的正常水平，可用于制備維持膽固醇正常類的藥物，所述的L-瓜氨酸琥珀酸鹽在制備增強(qiáng)身體免疫力、解毒或者鎮(zhèn)靜類藥物中的應(yīng)用。

L-瓜氨酸琥珀酸鹽可用來增強(qiáng)身體免疫力，可以使人的血管獲得松弛，用于增強(qiáng)男性性功能，以及治療性功能障礙；保持膽固醇正常水平；還可用于合成解毒劑、鎮(zhèn)靜劑等。

上述制備方法中，琥珀酸優(yōu)選采用琥珀酸粉末，也可以采用琥珀酸溶液進(jìn)行反應(yīng)，作為溶液加入要流加加入并且計算好正確的加入量；所述的L-瓜氨酸可以通過購買后配置成一定濃度的水溶液參與反應(yīng)，L-瓜氨酸的純度≥99％；也可以采用微生物發(fā)酵來制備，所述L-瓜氨酸水溶液的發(fā)酵制備方法具體步驟如下：

(1)平板活化，將菌株(保藏號為CGMCC No.11567)在無菌條件下接種到LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間為24h；

(2)擴(kuò)大培養(yǎng)：從步驟(1)的LB平板上挑取單菌落接到種子培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)時間12h；

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20、三水合磷酸氫二鉀1.5、磷酸二氫鉀0.5、尿素2.5、一水合硫酸錳0.02、七水合硫酸亞鐵0.02、生物素10^-4、VB1 2×10^-4、精氨酸0.2、七水合硫酸鎂0.4、氫氧化鉀調(diào)pH到6.5；

(3)5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：將擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌體接種到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，接種量為10％(v/v)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間60h，攪拌轉(zhuǎn)速500r/min，風(fēng)量1：1.0m³/m³·min(vvm)，控制溶氧20-30％，用無菌飽和氨水控制pH為6.8-7.2；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖80、三水合磷酸氫二鉀1.0、磷酸二氫鉀1.0、硫酸銨40、一水合硫酸錳0.02、七水合硫酸亞鐵0.02、氯化鋅10^-3、硫酸銅2×10^-4、碳酸鈣30、生物素10^-4、VB1 2×10^-4、精氨酸0.2、七水合硫酸鎂0.25、氫氧化鉀調(diào)pH到7.0。

通過發(fā)酵法獲得的L-瓜氨酸水溶液濃縮后將琥珀酸粉末加入到該溶液中,攪拌反應(yīng),得到L-瓜氨酸琥珀酸鹽溶液,再將L-瓜氨酸琥珀酸鹽以晶體形式析出。

有益效果：

本發(fā)明提供的L-瓜氨酸琥珀酸鹽可用來增強(qiáng)身體免疫力，可以使人的血管獲得松弛，用于增強(qiáng)男性性功能，以及治療性功能障礙；保持膽固醇正常水平；還可用于合成解毒劑、鎮(zhèn)靜劑等。制備方法簡單可行、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品的收率較高且純度高,可進(jìn)行工業(yè)化推廣。

附圖說明

圖1是L-瓜氨酸琥珀酸鹽的紅外光譜圖；

圖2是L-瓜氨酸琥珀酸鹽的氫譜圖；

圖3是L-瓜氨酸琥珀酸鹽的液相色譜圖；

圖4是L-瓜氨酸液相色譜圖。

具體的實施方式

以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述

實施例1

微生物發(fā)酵法制備L-瓜氨酸水溶液，包括如下步驟：

(1)平板活化，將菌株(保藏號為CGMCC No.11567)在無菌條件下接種到LB培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間為24h；

(2)擴(kuò)大培養(yǎng)：從步驟(1)的LB平板上挑取單菌落接到種子培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)的溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)時間12h；

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20、三水合磷酸氫二鉀1.5、磷酸二氫鉀0.5、尿素2.5、一水合硫酸錳0.02、七水合硫酸亞鐵0.02、生物素10^-4、VB1 2×10^-4、精氨酸0.2、七水合硫酸鎂0.4、氫氧化鉀調(diào)pH到6.5；

(3)5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：將擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌體接種到發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，接種量為10％(v/v)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間60h，攪拌轉(zhuǎn)速500r/min，風(fēng)量1：1.0m³/m³·min(vvm)，控制溶氧20-30％，用無菌飽和氨水控制pH為6.8-7.2；發(fā)酵結(jié)束后，得到L-瓜氨酸的發(fā)酵液。

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)為:葡萄糖80、三水合磷酸氫二鉀1.0、磷酸二氫鉀1.0、硫酸銨40、一水合硫酸錳0.02、七水合硫酸亞鐵0.02、氯化鋅10^-3、硫酸銅2×10^-4、碳酸鈣30、生物素10^-4、VB1 2×10^-4、精氨酸0.2、七水合硫酸鎂0.25、氫氧化鉀調(diào)pH到7.0。

L-瓜氨酸的發(fā)酵液可以直接或者濃縮至一定濃度，用于后續(xù)L-瓜氨酸琥珀酸鹽的制備，也可以純化得到L-瓜氨酸純品后配置成水溶液用于后續(xù)反應(yīng)。L-瓜氨酸的發(fā)酵液的純化處理方法步驟為：納濾、用2mol/L HCl調(diào)pH至4.5、用活性炭脫色，活性炭用量為L-瓜氨酸納濾清液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的0.5％、脫色溫度為50℃，脫色時間位30min，并用0.22微米的濾膜過濾脫色液、將L-瓜氨酸脫色液經(jīng)過反滲透膜濃縮至原體積的一半、將濃縮液在真空度≥0.095，蒸發(fā)溫度50℃的條件下濃縮至濃縮度含量≥80％的濃縮液，將溶液慢慢降溫至4℃冷卻過夜結(jié)晶，過濾、洗滌，真空干燥箱40℃干燥5h后取出。

實施例2

將實施例1制備得到的L-瓜氨酸配置成濃度為223g/L的水溶液，取20ml，加入1.5g的丁二酸，50℃攪拌反應(yīng)溶液至透明(攪拌時間40～45min)，將溶液降溫至常溫，加入無水乙醇11ml，使溶液快速接近飽和狀態(tài)。常溫下以0.48ml/min加入80％乙醇90ml并不斷攪拌，攪拌速度為200rpm。將溶液慢慢降溫至4℃冷卻過夜結(jié)晶，過濾、洗滌，真空干燥箱干燥晶體，產(chǎn)物3.53g，產(chǎn)率64.4％，產(chǎn)品的紅外光譜圖見圖1所示，氫譜圖見圖2所示，液相色譜圖見圖3所示，通過高效液相色譜測得純度為97.5％。

實施例3

將實施例1制備得到的L-瓜氨酸的發(fā)酵液經(jīng)過純化處理得到L-瓜氨酸的水溶液，將水溶液濃縮到200g/L，取22ml，加入1.5g的丁二酸，0.5g的鈀碳，溫度55℃攪拌反應(yīng)溶液至透明(攪拌時間約20-25min)，將溶液降溫至常溫，加入無水乙醇11ml，使溶液快速接近飽和狀態(tài)。常溫下以0.5ml/min加入80％乙醇90ml并不斷攪拌，攪拌速度為150rpm。將溶液慢慢降溫至4℃冷卻過夜結(jié)晶，過濾、洗滌，真空干燥箱干燥晶體，產(chǎn)物3.6406g，產(chǎn)率66.35％，通過高效液相色譜測得純度為98.1％。加入催化劑后反應(yīng)速率提高了近一倍，也就是反應(yīng)時間從40-45min縮短為20-25min。

以上實施例中采用高效液相色譜測定L-瓜氨酸琥珀酸鹽的測定條件為：色譜柱:Agilent C18色譜柱，檢測溫度：30℃，流速：1.0mL/min；流動相：稱取無水醋酸鈉15.17g，加水1850ml，溶解后用冰醋酸調(diào)pH至6.5，然后加乙腈140ml，混勻，用0.45mm濾膜過濾。

實施例4

取60只雄性小鼠，體重55-60g，隨機(jī)分成六組，每組10只，編號A、B、C、D、E、F。取A組為空白對照組，同時給這六組小鼠口服四氯化碳0.5mL，中毒12小時后，給B組的小鼠均注射1000mg/Kg的L-瓜氨酸，給C組的小鼠均注射1000mg/Kg的琥珀酸，給D組的小鼠均注射500mg/Kg的L-瓜氨酸琥珀酸鹽，給E組的小鼠均注射1000mg/Kg的L-瓜氨酸琥珀酸鹽，給F組的小鼠均注射2000mg/Kg的L-瓜氨酸琥珀酸鹽，48小時后，觀察小鼠存活狀況，結(jié)果如表1所示。

表1：

從表1中可以看出，L-瓜氨酸琥珀酸鹽可用作解毒劑。

實施例5

取30只雄性小鼠，體重55-60g，隨機(jī)分成六組，每組5只，編號A1、B1、C1、D1、E1、F1。取A1組為空白對照組。同時給這四組小鼠喂食蛋黃，連續(xù)飼養(yǎng)一個禮拜，測定30只小鼠內(nèi)膽固醇含量。給B1組的小鼠均注射1000mg/Kg的L-瓜氨酸，給C1組的小鼠均注射1000mg/Kg的琥珀酸，給D1組的小鼠均注射500mg/Kg的L-瓜氨酸琥珀酸鹽，給E1組的小鼠均注射1000mg/Kg的L-瓜氨酸琥珀酸鹽，給F1組的小鼠均注射1500mg/Kg的L-瓜氨酸琥珀酸鹽，連續(xù)給藥一個月。一個月后，測定小鼠體內(nèi)膽固醇含量，結(jié)果如表2所示。

表2：

該實驗證明了L-瓜氨酸琥珀酸鹽可降解膽固醇，維持膽固醇的正常水平。

實施例6

取50只雄性小鼠，體重125-130g，隨機(jī)分成五組，每組10只，編號A2、B2、C2、D2、E2。取A2組為空白對照組。對B2、C2、D2、E2組的全部小鼠用200ci的X射線進(jìn)行全身照射，空白對照組進(jìn)行假照射。B2組為照射對照組，C2、D2、E2組為照射給藥組。C2、D2、E2組每天分別注射1000mg/Kg的L-瓜氨酸、1000mg/Kg的琥珀酸、1000mg/Kg的L-瓜氨酸琥珀酸鹽，連續(xù)給藥一個月。一個月后，剖取睪丸和附睪，進(jìn)行睪丸重量、附睪重量、精子數(shù)和畸形精子數(shù)的統(tǒng)計。結(jié)果如表3所示。

表3：

該實驗證明了L-瓜氨酸琥珀酸鹽可增強(qiáng)精子存活率。L-瓜氨酸也能增強(qiáng)精子存活率，但是L-瓜氨酸琥珀酸鹽增強(qiáng)精子存活率的能力是L--瓜氨酸的兩倍多。