本發(fā)明涉及利用白酒丟糟制備活性肽的方法，屬于白酒釀造副產(chǎn)物的精深加工技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

白酒丟糟是以高粱、玉米等原料經(jīng)固態(tài)發(fā)酵、蒸餾提取酒精和香味成分后的殘留物，全國每年白酒丟糟產(chǎn)量在2500萬噸以上（李新社, 陸步詩. 大曲丟糟代替米糠生產(chǎn)小曲的效果研究[J]. 釀酒, 2006, 33(4): 65-66）。白酒丟糟的水分含量及酸度較大，容易腐敗而難于貯存，若直接扔棄或焚燒，將造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。白酒丟糟中粗蛋白含量占14-22%，淀粉含量占10-13%，脂肪含量占17-21%，并含有豐富的氨基酸、維生素、有機(jī)酸等有機(jī)成分。近年來，關(guān)于白酒丟糟的綜合化利用主要集中于提取蛋白質(zhì)、動(dòng)物飼料、丟糟酒、調(diào)味品、纖維素、食用菌培養(yǎng)基、酒精燃料等粗加工方面的研究，而對丟糟進(jìn)行精深加工仍處于空白狀態(tài)（王印召, 吳正云, 楊健, 等. 白酒丟糟資源化利用的研究進(jìn)展[J]. 釀酒科技, 2013, 9: 86-88）。由于丟糟總量的巨大和當(dāng)今社會(huì)經(jīng)濟(jì)、環(huán)境方面壓力的日益增加，探討更為高效的白酒丟糟利用途徑顯得十分重要。

高血壓是威脅人類健康的主要疾病之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)世界各國高血壓平均發(fā)病率為10-20%，全球每年因高血壓死亡人數(shù)達(dá)1200萬。我國高血壓患者已超過1.6億人。目前，公認(rèn)的卡托普利、賴諾普利等治療高血壓的合成藥物在臨床應(yīng)用過程中會(huì)產(chǎn)生低血壓、咳嗽、腎臟功能血管性水腫等不同程度的副作用。此外，由于機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的自由基若未及時(shí)清除，將導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)細(xì)胞信號傳導(dǎo)異常和DNA氧化損傷，嚴(yán)重危害人體健康。近年來，研究者致力于對天然的、安全有效的生物活性物質(zhì)進(jìn)行開發(fā)，而來源于食物蛋白降解產(chǎn)物的活性肽以其高效安全、人體易吸收等優(yōu)點(diǎn)倍受關(guān)注。國內(nèi)外相繼從酪蛋白、膠原蛋白、卵清蛋白及魚肉蛋白等（Jao CL, et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides: inhibition mode, bioavailability and antihypertensive effects-a review. Biomedicine, 2012, 2(4): 130-136）獲得ACE抑制肽。檢索中國專利文獻(xiàn)，關(guān)于丟糟再利用的申請有144余件，如CN201110119777.6 傳統(tǒng)白酒最大固體廢棄物丟糟的資源化和無害化處理方法、CN201210252105.7 蠅蛆資源化處理濃香型白酒丟糟的方法、CN201110119843.X 利用白酒丟糟固液丟糟結(jié)合發(fā)酵生產(chǎn)食醋用天然香精的方法等，而對丟糟及其酶解產(chǎn)物具有ACE抑制、抗氧化等生物活性的研究未見報(bào)道。丟糟作為一種制備活性肽的新資源進(jìn)行開發(fā)利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于以丟糟為原料，制備出低分子量、高活性、高純度的活性肽，提供一種可操作性強(qiáng)、生產(chǎn)周期短、易規(guī)?；a(chǎn)的活性肽制備方法，實(shí)現(xiàn)白酒釀酒副產(chǎn)物的高值化利用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：

利用白酒丟糟制備活性肽的方法，包括以下步驟：

1）原料預(yù)處理：取丟糟加8倍體積水充分?jǐn)嚢? min，用紗布濾去上層懸浮的稻殼，剩余混合物以20～25 KHz每隔2 min超聲破碎5～10次，共10～20 min，并組織勻漿20～25 min；

2）丟糟蛋白酶解：將上述勻漿液，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH值至5.5～6.0，50 ℃預(yù)熱5 min，加入重量比6%木瓜蛋白酶，50～60 ℃恒溫酶解4 h，于80 ℃滅酶10～15 min終止反應(yīng)，將酶解產(chǎn)物進(jìn)行3kDa膜超濾，收集膜外液冷凍干燥后得活性肽，測定分子量分布比例及生物活性；活性肽收率11-12%；

3）活性肽的提純：將上述所得活性肽溶于去離子水，上樣于Superdex-Peptide凝膠柱，流速為0.3～0.5 ml/min，以去離子水為洗脫液，在檢測波長220 nm下收集各組分，冷凍干燥測定ACE抑制率及DPPH·清除率；將活性較高的凍干組分用純水溶解后，上樣于高效液相色譜C₁₈柱，色譜條件為：流速1 ml/min，柱溫25 ℃，檢測波長220 nm，流動(dòng)相為乙腈和純水，流動(dòng)相的洗脫過程歷時(shí)35 min；在流動(dòng)相出口處收集各組分，測定其ACE抑制率和DPPH清除率，將活性最高的組分冷凍干燥，得純度達(dá)92.1%的活性肽。

丟糟為大曲酒、小曲酒、麩曲酒類白酒的蒸餾副產(chǎn)物；

步驟3)中流動(dòng)相分別為含0.03～0.04%三氟乙酸的乙腈溶液、含0.04～0.05%三氟乙酸的純水溶液；洗脫過程前5 min用100%純水進(jìn)行等度洗脫，后30 min用0～15%乙腈進(jìn)行線性洗脫。

獲得的活性肽，純度達(dá)92.1%，ACE抑制活性IC₅₀為1.14 mg/ml；DPPH·清除能力EC₅₀為1.42 mg/ml，ABTS·清除能力EC₅₀為2.56 mg/ml，還原力（A_700nm=0.5）為375.48 μg/ml。

本發(fā)明由于采用定向酶解技術(shù)、凝膠層析及高效液相色譜生物技術(shù)，所制備的活性肽來源于天然植物蛋白，純度高且分子量小，同時(shí)具備較強(qiáng)的ACE抑制及抗氧化活性，擁有穩(wěn)定、安全、人體易吸收等優(yōu)勢，可作為藥物或功能性食品進(jìn)行開發(fā)；本發(fā)明的工藝簡單，僅采用Superdex-Peptide、RP-HPLC兩步分離法實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的高效純化，能進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；本發(fā)明所采用的原料為大曲酒、小曲酒、麩曲酒等白酒丟糟，能促進(jìn)我國釀酒行業(yè)副產(chǎn)物資源的開發(fā)與利用，由原料優(yōu)勢轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品優(yōu)勢，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢，加快白酒丟糟高值化利用的進(jìn)程。

附圖說明

圖1是本發(fā)明制備工藝示意圖；

圖2是活性肽的高效液相色譜分離純化圖；

圖3活性肽的純度分析圖。

具體實(shí)施方式

下面給出的實(shí)施例擬對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不能理解為是對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容對本發(fā)明作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：

1）原料預(yù)處理：取丟糟加8倍體積水充分?jǐn)嚢? min，用紗布濾去上層懸浮的稻殼，剩余混合物每隔2 min超聲破碎（20 KHz）5次，共10 min，并組織勻漿20 min。

2）丟糟蛋白酶解：將步驟（1）勻漿液，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH值至5.5，50 ℃預(yù)熱5 min， 加入6%（w/w）木瓜蛋白酶，50 ℃恒溫酶解4 h，于80 ℃滅酶10 min終止反應(yīng)，將最終的酶解產(chǎn)物進(jìn)行3 kDa膜超濾，收集膜外液冷凍干燥后得活性肽，測定分子量分布比例及生物活性；活性肽收率11-12%；

3）活性肽的提純：將上述活性肽溶于去離子水，上樣于Superdex-Peptide凝膠柱，流速為0.3 ml/min，以去離子水為洗脫液，在檢測波長220 nm下收集各組分，冷凍干燥測定ACE抑制率及DPPH·清除率。將活性較高的凍干組分用純水溶解后，上樣于高效液相色譜C₁₈柱，色譜條件為：流速1 ml/min，柱溫25 ℃，檢測波長220 nm，流動(dòng)相分別為含0.04%(V/V)三氟乙酸的乙腈溶液、含0.04%(V/V)三氟乙酸的純水溶液；流動(dòng)相的洗脫過程歷時(shí)35 min，前5 min用100%純水進(jìn)行等度洗脫，后30 min用0～15%乙腈進(jìn)行線性洗脫。根據(jù)峰形和保留時(shí)間，在流動(dòng)相出口處收集各組分，測定其ACE抑制率和DPPH清除率，將活性最高的組分冷凍干燥，即得高純度的活性肽，純度達(dá)92.1%。

實(shí)施例2：

1）原料預(yù)處理：取丟糟加8倍體積水充分?jǐn)嚢? min，用紗布濾去上層懸浮的稻殼，剩余混合物每隔2 min超聲破碎（25 KHz）10次，共20 min，并組織勻漿25 min。

2）丟糟蛋白酶解：將勻漿液用1 mol/L鹽酸調(diào)pH值至6.0，50 ℃預(yù)熱5 min， 加入6%（w/w）木瓜蛋白酶，60 ℃恒溫酶解4 h，于80 ℃滅酶15 min終止反應(yīng)，將最終的酶解產(chǎn)物進(jìn)行3 kDa膜超濾，收集膜外液冷凍干燥后得活性肽，測定分子量分布比例及生物活性；活性肽收率11-12%；

3）活性肽的提純：將上述活性肽溶于去離子水，上樣于Superdex-Peptide凝膠柱，流速為0.5 ml/min，以去離子水為洗脫液，在檢測波長220 nm下收集各組分，冷凍干燥測定ACE抑制率及DPPH·清除率。將活性較高的凍干組分用純水溶解后，上樣于高效液相色譜C₁₈柱，色譜條件為：流速1 ml/min，柱溫25 ℃，檢測波長220 nm，流動(dòng)相分別為含0.04%三氟乙酸的乙腈、含0.04%三氟乙酸的純水；流動(dòng)相的洗脫過程歷時(shí)35 min，前5 min用100%純水進(jìn)行等度洗脫，后30 min用0～15%乙腈進(jìn)行線性洗脫。根據(jù)峰形和保留時(shí)間，在流動(dòng)相出口處收集各組分，測定其ACE抑制率和DPPH清除率，將活性最高的組分冷凍干燥，即得純度為92.1%的活性肽。

本發(fā)明技術(shù)方案有益效果數(shù)據(jù)分析

1、由圖2可知，高效液相色譜C18柱能對組分進(jìn)行有效分離，共收集獲得10個(gè)主峰（peak-1～10），測得peak-6的ACE抑制活性最高且具有較強(qiáng)的DPPH清除能力，A220檢測信號最強(qiáng)，說明該組分得率較高。

2、圖3中出現(xiàn)的單峰peak-6即為純化獲得的活性肽，純度達(dá)92.1%。