本發(fā)明屬于制藥領(lǐng)域，具體涉及一種酰腙席夫堿銅配合物、一種酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物及其在制備前藥中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

根據(jù)GLOBOCAN估計(jì)，2012年全球約有170萬新乳腺癌病例和521,900例乳腺癌死亡，到2030年全球預(yù)計(jì)將增加2140萬新癌癥病例和約1320萬癌癥死亡病例。盡管傳統(tǒng)癌癥化療在改善存活率方面在過去幾十年是相當(dāng)有益的，但它也顯示出許多不利影響，包括有限的效率，無特異性，多藥耐藥性和不良副作用。為了克服這些障礙，已經(jīng)開發(fā)了各種方法，包括前藥策略和納米顆粒藥物遞送策略。

目前，由于金屬配合物具有廣譜的幾何形狀和配位數(shù)以及動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，將金屬化合物開發(fā)為抗癌藥物日益成為藥物化學(xué)家的興趣。在下一代金屬基抗癌化合物中，Cu作為人體的必需元素，具有特定的生物活性和氧化性質(zhì)，因此Cu抗癌化合物具有巨大的潛力。特別地，癌細(xì)胞比正常細(xì)胞攝取更多的Cu。目前設(shè)計(jì)HSA-金屬基前藥的主要方法是通過HSA上特殊的氨基酸與金屬基藥物化學(xué)偶聯(lián)。但是，這種常規(guī)的化學(xué)偶聯(lián)方法有諸多的缺點(diǎn)。例如，過多的化學(xué)鏈接劑會(huì)導(dǎo)致HSA沉淀。而Cys34處在HSA的深溝中不易連接藥物。此外，在體內(nèi)HSA載體運(yùn)載金屬前藥到達(dá)癌細(xì)胞還存在兩個(gè)可能的弊端。第一、金屬前藥連接在HSA表面，導(dǎo)致藥物會(huì)暴露于體內(nèi)的其他蛋白，以至于這些蛋白可能與HSA競爭結(jié)合藥物，導(dǎo)致金屬前藥從HSA載體上逃逸而結(jié)合到其他蛋白可能導(dǎo)致副作用。第二、由于金屬前藥與HSA結(jié)合太弱，金屬前藥可能過早釋放而不能到達(dá)癌細(xì)胞。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，合成了兩種具有離去基團(tuán)的Cu配合物，該類配合物可以不使用任何化學(xué)連接劑共價(jià)結(jié)合在HSA的IIA結(jié)合區(qū)域，避免現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。進(jìn)一步的，形成的酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物可以通過去溶劑法制成人血清白蛋白銅(II)前藥納米顆粒(HSA-Cu(II))，藥物均勻分散在納米球體中，避免前藥突釋。

本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

一種酰腙席夫堿銅配合物，化學(xué)式如下：

[CuBr(BA)(L)]或者[CuBr(DMF)(L)]，其中BA＝喹啉，L為具有三齒酰腙席夫堿結(jié)構(gòu)的化合物，DMF＝N,N-二甲基甲酰胺)，所述配合物中的Br^-，喹啉或DMF作為配體與銅中心配位。

優(yōu)選的，所述L為芳?；晗驂A結(jié)構(gòu)的化合物，更優(yōu)選O,N,O–三齒芳酰基腙席夫堿結(jié)構(gòu)的化合物。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，L具有如下通式結(jié)構(gòu)：

或者

其中

或-CH₃，

R₂＝-H、-F、-Cl、-Br或-CH₃。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案，L為(E)-N'-(5-氯-2-羥基亞芐基)苯甲酰肼。所述酰腙席夫堿銅配合物優(yōu)選如下：

本發(fā)明的另一目的在于提供上述酰腙席夫堿銅配合物與人血清白蛋白的復(fù)合物，上述酰腙席夫堿銅配合物可以不需要化學(xué)連接劑，而直接與人血清白蛋白共價(jià)結(jié)合形成。X-射線單晶結(jié)構(gòu)研究表明HSA IIA結(jié)合區(qū)域的Lys199和His242氨基酸分別取代C1配合物中的喹啉和Br^-配體與銅中心配位；而C2配合物的DMF基團(tuán)保持惰性，HSA IIA結(jié)合區(qū)域的His242氨基酸取代軸向的Br^-配體與銅中心配位。

上述酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合可以不使用化學(xué)連接劑，將酰腙席夫堿銅配合物與人血清白蛋白在室溫下直接孵育24h制備得到，具體步驟如下：

(1)取2g粉末活性炭，5ml超純水和10ml 20％的醫(yī)用人血清白蛋白于50ml燒杯中，將該燒杯置于冰水中，調(diào)節(jié)pH到2.8，攪拌2h，然后調(diào)節(jié)pH到7.5。然后離心和透析去除除活性炭、HSA中的二聚體和多聚體獲得后續(xù)試驗(yàn)所用的單體HAS；

(2)用紫外分光光度法測定透析后獲得的單體HSA的濃度；

(3)以1：3的比例在20mM磷酸鉀(pH 7.5)的緩沖溶液中混合HSA(100mg/mL)和銅配合物，然后常溫孵育24h，過量的銅配合物通過離心洗脫去除。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物納米顆粒，可以將酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物通過去溶劑技術(shù)制成大小均一且藥物均勻的分散在納米顆粒中的前藥納米球。

為了進(jìn)一步提高靶向性和降低副作用，上述酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物納米顆粒可以進(jìn)一步接上葉酸(FA)靶向小分子。

本發(fā)明的另一目的在于提供本發(fā)明所述的酰腙席夫堿銅配合物、酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物、酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物納米顆粒以及連接有葉酸的酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物納米顆粒在制備前藥中的應(yīng)用。

上述前藥為抗腫瘤藥物或治療鐵過量疾病藥物。

優(yōu)選的，所述抗腫瘤藥物可用于治療宮頸癌，肺癌，乳腺癌，肝癌等癌癥。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)：

(1)苯酰肼類席夫堿配體具有良好的抗癌活性，本發(fā)明保持主藥效團(tuán)配體(L)不變，設(shè)計(jì)具有不同配位原子的第二配體(喹啉或DMF)，優(yōu)選Br作為第三配體作為離去基團(tuán)，在不使用化學(xué)連接劑的情況下，HSA的His242或者Lys199氨基酸可以取代本發(fā)明所述酰腙席夫堿銅配合物的離去基團(tuán)而與銅中心配位，緊密結(jié)合到HSA的IIA子域，提高了HSA運(yùn)載銅前藥的效率。

(2)本發(fā)明所述酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物納米顆粒(HSA-C1/C2 NPs)及酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物-葉酸納米顆粒(FA-HSA-C1/C2 NPs)分別具有約162nm的直徑和約220nm直徑，兩者都具有窄的粒度分布，注射后不容易被吞噬，而且具有良好的生物相容性。

(3)本發(fā)明所述酰腙席夫堿銅配合物(C1/C2)相比主藥效團(tuán)配體L具有更高抗腫瘤活性。

(4)本發(fā)明所述酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物納米顆粒(HSA-C1/C2 NPs)以及連接有葉酸的酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物納米顆粒(FA-HSA-C1/C2 NPs)相比與原型藥物C1/C2具有更高抗腫瘤活性。

(5)本發(fā)明所述酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物納米顆粒(HSA-C1/C2 NPs)以及連接有葉酸的酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物納米顆粒(FA-HSA-C1/C2 NPs)相比與原型藥物C1/C2對(duì)正常細(xì)胞具有更低的毒性。

(6)本發(fā)明所述酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物納米顆粒(HSA-C1/C2 NPs)以及連接有葉酸的酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物納米顆粒(FA-HSA-C1/C2 NPs)能明顯降低酰腙席夫堿銅配合物的肝、腎毒性和良好的耐受性，具有很好的臨床應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1.本發(fā)明所述酰腙席夫堿銅配合物[CuBr(BA)(L)](配合物C1)和[CuBr(DMF)(L)](配合物C2)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖2.配合物C1和配合物C2的N-H···Br的作用結(jié)果。(A)為配合物C1的N-H···Br作用形成的聚合鍵(對(duì)稱代碼：(i)x,0.5-y,-0.5+z)；(B)為配合物C2的N-H···Br作用形成的二聚體(對(duì)稱代碼：(i)1-x,1-y,1-z)。

圖3.(A)配合物C1和C2不同濃度下HSA的熒光猝滅光譜，T＝298K，箭頭表示在增加復(fù)合物濃度(0-4μM)時(shí)的熒光猝滅。(B)HSA-C1/C2復(fù)合物的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜圖。

圖4.HSA-C1復(fù)合物(A)和HSA-C2復(fù)合物(B)釋放產(chǎn)物的電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)，黑細(xì)線是觀察到的譜，直方灰線為模擬的m/z信號(hào)峰。

圖5.(A)HSA-C1復(fù)合物和HSA-C2的2F_o-F_c電子密度圖。(B)HSA-C1/C2復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)。(C)銅配合物在HSA IIA結(jié)合區(qū)域的局部結(jié)合環(huán)境圖。

圖6.(A)HSA-C1/C2 NPs和FA-HSA-C1/C2 NPs的掃描電子顯微鏡圖像(B)HSA-C1/C2 NPs和FA-HSA-C1/C2 NPs的粒徑及分布。

圖7.(A)C1/C2(5μM),HSA-C1/C2 NPs(5μM)和FA-HSA-C1/C2 NPs(5μM)作用于紅細(xì)胞1h后的溶血反應(yīng)分析。(B)相顯微鏡觀察C1/C2(5μM),HSA-C1/C2 NPs(5μM)和FA-HSA-C1/C2 NPs(5μM)作用于紅細(xì)胞的h后的凝集情況比較。每個(gè)值表示平均值±SD(n＝3)。

圖8.(A)Bel-7402腫瘤小鼠模型各給藥組的腫瘤體積比較。(B)Bel-7402腫瘤小鼠模型各給藥組的瘤重平均值比較。(C)Bel-7402腫瘤小鼠模型各給藥組的體重比較，(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。

圖9.體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)各治療組的腫瘤及其它器官切片的蘇木精和伊紅染色(H&E)組織學(xué)檢查結(jié)果(放大倍數(shù)×400)。

圖10.C2配合物、HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs各治療組地腫瘤組織和主要器官中銅含量(每個(gè)值表示平均值±SD(n＝3)：*P<0.05；**P<0.01.)。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例說明本發(fā)明的具體步驟，但不受實(shí)施例限制。

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非另有說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。

下面結(jié)合具體實(shí)施例并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，該實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

在以下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。

醫(yī)用人血清白蛋白從美國杰特貝林生物制品有限公司購買。所使用的其它化學(xué)藥品和溶劑均為商業(yè)來源且是高純度。在反應(yīng)中所用的水全為蒸餾水。元素分析(C，N和H)在Perkin-Elmer公司2400分析儀上進(jìn)行。紅外(IR)測定使用Nexus870 FT-IR分光光度計(jì)(4000-400^-1)和KBr壓片。

實(shí)施例1本發(fā)明所述酰腙席夫堿銅配合物[CuBr(BA)(L)](化合物C1)和[CuBr(DMF)(L)](化合物C2)的制備和表征

本發(fā)明所用的酰腙席夫堿配體L以(E)-N'-(5-氯-2-羥基亞芐基)苯甲酰肼席夫堿(可參考文獻(xiàn)：Ali HM,Puvaneswary S,Ng SW.5-Chlorosalicylaldehyde benzoylhydrazone.Acta Crystallogr.,Sect.E:Struct.Rep.Online 2005,61,o2415.制得)為例，制備酰腙席夫堿銅配合物。

[CuBr(BA)(L)](C1)的合成方法如下：L(0.55g，2mmol)和雜環(huán)氮配體喹啉(BQAL；0.26g，2mmol)溶解在15mL甲醇中，在常溫?cái)嚢?h，得到橙黃色液體。然后加入溶于甲醇的CuBr₂(0.44g，2mmol)溶液。上述混合溶液繼續(xù)在室溫下再攪拌1h，得到墨綠色溶液，然后過濾混合溶液，收集濾液。該濾液保持在空氣中緩慢揮發(fā)7天左右，溶液中慢慢析出藍(lán)黑色晶體。將晶體分離，用蒸餾水洗滌三次，并在含有無水氯化鈣的真空干燥器中干燥。產(chǎn)率：C₂₃H₁₇BrClCuN₃O₂(546.30)776mg(71％)。元素分析：C，50.56(50.53)；H，3.13(3.14)和N，7.69(7.70)。IR(KBr,cm^-1)：1616ν(C＝N)；581，549，487，468，443ν(Cu-N/Cu-O)。

可參照上述方法，將DMF代替上述方法中的喹啉，制備[CuBr(DMF)(L)](C2)。產(chǎn)率：C1₇H₁₇BrClCuN₃O₃(490.24)764mg(78％)。元素分析：C，41.65(41.53)；H，3.49(3.52)和N，8.57(8.58)。IR(KBr,cm^-1)：1619ν(C＝N)；548，505，458，436，422ν(Cu-N/Cu-O)。

反應(yīng)式如下：

單晶結(jié)構(gòu)表征：選取形狀規(guī)則無裂痕的單個(gè)晶體，在292-298K測定。用石墨單色器的Mo-Kα(ω-2θ的掃描方式)的輻射射線收集晶體數(shù)據(jù)，然后采用Bruker APEX SMART CCD面探衍射儀記錄衍射數(shù)據(jù)。使用SADABS程序進(jìn)行數(shù)據(jù)校正。結(jié)構(gòu)通過重原子法和直接法解析，并使用SHELXTL5.1的全矩陣最小二乘方法對(duì)F²進(jìn)行精制。所有的非氫原子進(jìn)行各向異性精修。而所有的氫原子被放置在理想的幾何位置并約束在它所屬的原子上。化合物C1和C2的晶體學(xué)數(shù)據(jù)如表1所示。選擇的部分鍵長和鍵角在如表2所示。用于結(jié)構(gòu)分析的晶體學(xué)數(shù)據(jù)已被劍橋晶體學(xué)數(shù)據(jù)中心(Cambridge Crystallographic Data Centre)收集，C1的CCDC號(hào)為1011410，C2的CCDC號(hào)為967408。相應(yīng)的晶體數(shù)據(jù)也可以免費(fèi)從劍橋晶體數(shù)據(jù)中心獲得。

表1.配合物C1和C2的晶體數(shù)據(jù).

表2.配合物C1和C2的部分鍵長和鍵角[°]。

X-射線單晶衍射顯示，配合物C1屬于單斜晶系，空間群為P2₁/c。如圖1所示，在不對(duì)稱單元中含有一個(gè)三齒席夫堿配體，一個(gè)Cu(II)中心，一個(gè)喹啉配體和一個(gè)終端Br原子。Cu(II)中心與席夫堿配體上的一個(gè)氮原子和兩個(gè)氧原子，一個(gè)來自喹啉配體的氮原子以及軸向終端Br配位，形成銅化合物常見的五配位結(jié)構(gòu)。所有的Cu–N/O距離在的范圍里，與已報(bào)道的相似結(jié)構(gòu)鍵長一致。圍繞Cu1中心配位多面體可以描述為一個(gè)略微扭曲的正方形棱錐(τ＝0.004)。在固體狀態(tài)下，C1的單體單元通過配位的溴原子(Br1)和鄰近單體席夫堿配體上的N2ⁱ構(gòu)成N-H···Br弱相互作用(Br1···N1ⁱ-H4ⁱ角度為158.7°；對(duì)稱代碼：(i)x,0.5-y,-0.5+z,如圖2A所示)，形成1D聚合連。

配合物C2的晶體結(jié)構(gòu)如圖1所示。X-射線單晶衍射顯示，配合物C2屬于三斜晶系，空間群為P-1。圍繞銅中心的配位構(gòu)型與C1十分相似，除了在平面上的配位分子DMF不一樣。而在固體狀態(tài)下，C2的單體單元通過配位的溴原子(Br1)和鄰近單體席夫堿配體上的N5ⁱ構(gòu)成N-H···Br弱相互作用(對(duì)稱代碼：(i)1-x,1-y,1-z,如圖2B所示)，形成二聚體結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例2酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物(HSA-C1/C2)的制備和表征

取10ml的20％的醫(yī)用人血清白蛋白、2g粉末活性炭和5ml超純水于50ml燒杯中，將該燒杯置于冰水中，調(diào)節(jié)pH到2.8，攪拌2h，然后調(diào)節(jié)pH到7.5。然后離心和透析去除除活性炭、HSA中的二聚體和多聚體獲得后續(xù)試驗(yàn)所用的單體HSA。

HSA復(fù)合物的單晶衍射：用20mM磷酸鉀(pH 7.5)稀釋脂肪酸(PA)到2.5mM。在試驗(yàn)中，為使C1和C2與HSA結(jié)合成前藥復(fù)合物，先將380μL的PA(2.5mmol)、100μL的HSA(100mg/mL)、和90μL的Cu配合物(5mmol)混合，然后常溫孵育24h，最后將混合物放在濃縮管中加水洗滌過濾濃縮至100mg/ml(微孔自旋過濾(10,000道爾頓截止)。通過在室溫下坐滴蒸氣擴(kuò)散進(jìn)行結(jié)晶，將等體積的HSA的復(fù)合物與貯存在座滴板中的溶液混合，此溶液由28-32％(重量/體積)聚乙二醇3350、50mM磷酸鉀(pH 7.5)、5％甘油和5％的DMSO混合而成。長好的晶體直接從滴液中選擇取出并然后在液氮中冷藏。X射線衍射的數(shù)據(jù)是使用上海同步輻射裝置，在低溫條件下(100K)收集完成的。衍射數(shù)據(jù)用HKL2000處理。HSA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)通過AMORE程序的分子置法(HSA-MYR為模型，PDB代碼1BJ5)構(gòu)建模型。構(gòu)建的初模型首先用CNS程序剛性精修，接著增加精修輪數(shù)精修B-因子，直到獲得原始的F_o-F_c和2F_o-F_c電子密度圖。這些電子密度圖被用來指示脂肪酸和銅化合物的位置，并通過手動(dòng)調(diào)整結(jié)構(gòu)和增加精修輪數(shù)進(jìn)一步精修蛋白結(jié)構(gòu)。PyMOL軟件用于附圖描繪和處理。表3中給出了數(shù)據(jù)收集的細(xì)節(jié)和晶胞參數(shù)。

表3.HSA-C1/C2復(fù)合物的晶體數(shù)據(jù)

^a Values for the outermost resolution shell are given in parentheses.

^bR_merge＝100×Σ_hΣ_j|I_hj-I_h|/Σ_hΣ_j I_hj where I_h is the weighted mean intensity of the symmetry-related refractions I_hj.

^cR_model＝100×Σ_hkl|F_obs-F_calc|/Σ_hklF_obs where F_obs and F_calc are the observed and calculated structure factors,respectively.

^dR_free is the R_model calculated using a randomly selected 5％sample of reflection data omitted from the refinement.。

熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著配合物C1或C2濃度增加，人血清白蛋白在波長約346nm發(fā)生強(qiáng)烈的熒光淬滅，這表明這些銅配合物結(jié)合在HSA的IIA子域且有強(qiáng)烈結(jié)合能力(如圖3A所示)。飛行質(zhì)譜的基質(zhì)輔助激光解吸/電離時(shí)間(MALDI-TOF-MS)顯示HSA和C1或C2作用后，分子量比單獨(dú)的HSA增加約400Da，表明約一個(gè)銅配合物結(jié)合到HSA(如圖3B所示)。此外，在pH 5的條件下，從HSA-C1復(fù)合物中釋放的銅化合物的電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)表明，在源能量為0伏特時(shí)，存在m/z＝335.97，這是[Cu(L)]⁺(fit:335.97)的同位素峰，這意味著Br和BA配體丟失(如圖4A所示)。而在同樣條件下，從HSA-C2復(fù)合物中釋放的銅化合物的電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)峰在m/z＝409.03，這是[(L)Cu(DMF)]⁺(fit:409.03)的同位素峰，表明DMF配體存在于HSA-C2復(fù)合物中(如圖4B所示)。

HSA-C1/C2復(fù)合物的單晶結(jié)構(gòu)解析結(jié)果顯示，在HAS的IIA子域有一個(gè)銅化合物分子(如圖5A所示)。HSA-C1/C2的總體結(jié)構(gòu)仍然是心臟形狀。在IIA子域，銅化合結(jié)合到一個(gè)由Arg222，Arg218，His242，Lys199，Trp214，Leu219，Ala291，Phe223，Leu238，Arg257，Leu260，Ile264，Ser287和Ile290構(gòu)成的疏水空腔中(如圖5B所示)。HSA-C1結(jié)構(gòu)顯示，Lys199和His242分別取代喹啉配體和Br配體，與銅中心配位。而HSA-PA-C2結(jié)構(gòu)顯示，His242取代軸向Br配體，而Lys199沒有取代平面上的DMF配體。

實(shí)施例3酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物-葉酸納米顆粒(FA-HSA-C1/C2)的制備和表征

(1)酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物-葉酸納米顆粒(HSA-C1/C2 NPs)的制備

為了獲得HSA-金屬前藥和恒定載藥比，首先將實(shí)施例1制得的本發(fā)明所述酰腙席夫堿銅配合物與HSA在室溫下孵育(摩爾比1：3)24h，過量的酰腙席夫堿銅配合物離心透析去除。接著，按照文獻(xiàn)中的去溶劑法，在室溫和恒定攪拌的條件下，將4mL上述孵育的酰腙席夫堿銅配合物與HSA混合物(1.5mM)調(diào)節(jié)pH到8，連續(xù)加入15.0mL乙醇溶液(1mL/min)，逐漸形成HSA-C1/C2 NPs。蛋白質(zhì)變性后，加入8％的戊二醛水溶液450微升以實(shí)現(xiàn)納米粒子交聯(lián)。然后將上述混合物以40,000rpm離心10分鐘，分離得到HSA-C1/C2 NPs。[Weber C,Kreuter J,Langer K.Desolvation process and surface characteristics of HSA-nanoparticles.Int J Pharm.2000；196(2):197-200；Sebak S,Mirzaei M,Malhotra M,Kulamarva A,Prakash S.Human serum albumin nanoparticles as an efficient noscapine drug delivery system for potential use in breast cancer:preparation and in vitro analysis.Int J Nanomedicine.2010；5:525-32.]。

(2)酰腙席夫堿銅配合物-人血清白蛋白復(fù)合物-葉酸納米顆粒(FA-HSA-C1/C2 NPs)的制備

2.5mL的氫氧化鈉(0.1N)FA溶液(20mg/mL)，在50mg的N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亞胺(EDC)和20mg的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)催化下避光攪拌30min。隨后，將HSA-C1/C2 NPs混懸液(含量15mg/mL)加入，并繼續(xù)避光攪拌3小時(shí)。未反應(yīng)的FA通過差速離心(40,000rpm，10min)上述混合物去掉。將沉淀在底部的FA-HSA-C1/C2 NPs用水再分散，進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。FA-HSA-C1/C2 NPs中銅化合物的含量通過裂解納米顆粒成溶液狀態(tài)，再用石墨爐原子吸收光譜儀(GF-AAS)測定其中銅元素的含量。

(3)FA-HSA-C1/C2 NPs的表征和溶血性測定

掃描電子顯微鏡圖像顯示，HSA-C1/C2 NPs和FA-HSA-C1/C2 NPs具有球形且光滑的表面(如圖6A所示)。制備的納米粒子的平均直徑和粒度分布通過激光光散射測定。HSA-C1/C2 NPs和FA-HSA-C1/C2 NPs分別具有約162nm的直徑和約220nm直徑，且兩者都具有窄的粒度分布(如圖6B所示)。在這個(gè)粒徑范圍內(nèi)，相比較大納米顆粒，這種粒徑的納米顆粒注射后將不容易吞噬。

用于靜脈給藥的NPs必要條件之一是具有優(yōu)良血液相容性。因此，對(duì)上述納米顆粒的溶血率由溶血測定法進(jìn)行評(píng)估。FA-HSA-C1/C2 NPs的溶血性性能通過分光光度法測定。對(duì)于紅細(xì)胞凝集的研究，每個(gè)樣品(5μM Cu(II)化合物，5μM HSA-C1/C2 NPs和5μM FA-HSA-C1/C2 NPs)與血液作用1h，置于在載玻片上，用相襯顯微鏡進(jìn)行分析。結(jié)果圖7A所示，相對(duì)于單獨(dú)的C1/C2配合物，HSA-C1/C2 NPs和FA-HSA-C1/C2 NPs對(duì)紅細(xì)胞溶血破壞大大降低，即使在5μM的高濃度。此外，單獨(dú)的Cu(II)化合物與紅細(xì)胞作用1小時(shí)，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，而在暴露于HSA-C1/C2 NPs和FA-HSA-C1/C2 NPs中紅細(xì)胞沒有觀察到凝集現(xiàn)象(如圖7B所示)。

實(shí)施例4 C1/C2、HSA-C1/C2 NPs以及FA-HSA-C1/C2 NPs的活性測定

(一)體外活性測定

肝癌細(xì)胞系Bel-7402和正常肺成纖維細(xì)胞WI-38(從the American Type Culture Collection和the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures購買)在DMEM(具有的L-谷氨酰胺)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。該培養(yǎng)基含有10％的胎牛血清(FBS)，50U/mL的青霉素，50mg/mL鏈霉素。然后，將含有培養(yǎng)基的細(xì)胞置于37℃水汽濕度和5％CO₂的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

將密度約為3×10⁴細(xì)胞/mL，接種到96孔板中(每孔180μL)。在溫度37℃和5％CO₂的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后加入具有不同濃度梯度的待測藥品(C1/C2、HSA-C1/C2 NPs和FA-HSA-C1/C2 NPs，藥品濃度以銅計(jì))，再在37℃和5％CO₂的條件下孵育48h。吸光度值用酶標(biāo)儀在570/630nm的雙波長下測。最終的IC₅₀(存活細(xì)胞數(shù)是對(duì)照組一半的時(shí)候，藥物濃度)值由經(jīng)典的Bliss方法得出(n＝5)。所有測試實(shí)驗(yàn)至少3次獨(dú)立的重復(fù)。

結(jié)果如表4所示，結(jié)果表明在體外，F(xiàn)A-HSA-C1/C2 NPs比C1/C2和HSA-C1/C2 NPs對(duì)葉酸受體分泌較多的Bel-7402細(xì)胞表現(xiàn)出更高的細(xì)胞毒活，而對(duì)葉酸受體分泌很少的正常WI-38肺成纖維細(xì)胞中沒有觀察到類似的效果。

表4 C1/C2、HSA-C1/C2 NPs和FA-HSA-C1/C2 NPs對(duì)Bel-7402和WI-38細(xì)胞的IC₅₀^a(μM)值。

^aIC₅₀ values are presented as the mean±SD from three separated experiments。

(二)體內(nèi)活性測定

體外活性研究表明C2系列(C2，HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs)比C1系列(C1，HSA-C1 NPs和FA-HSA-C1 NPs)有更好的抗癌活性。因此，為了進(jìn)一步評(píng)估FA-官能化的HSA納米載體和前藥策略在體內(nèi)是否表現(xiàn)出更好的抗癌性質(zhì)，以活性較好的C2系列為例，采用異種移植Bel-7402鼠肝癌模型進(jìn)行進(jìn)一步研究。

所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均遵守中華人民共和國衛(wèi)生管理?xiàng)l例(文件編號(hào)NO.55,2001)。Kunming(KM)小鼠由中國科學(xué)院(上海)提供。

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3到5次。Student's t-test檢驗(yàn)用于評(píng)估測量值的差異顯著性。測量結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，當(dāng)p<0.05，認(rèn)為具有顯著性差異。

(1)急性毒性研究

C2，HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs在老鼠體內(nèi)的急性毒性實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)中的方法。32只健康的KM小鼠(年齡3～4周,重18～22g,等量的雌性和雄性)，分成4組，對(duì)照組，C2組，HSA-C2 NPs組和FA-HSA-C2 NPs組，每組8只。C2組，HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs組注射等量的藥量(15μmol Cu/kg體重)，對(duì)照組注射等體積的0.9％生理鹽水。作用7天后，分析血液樣本中的天(門)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)，肌酸激酶(creatinine kinase,CK)和血尿氮(blood urea nitrogen,BUN)指標(biāo)。

通過測定加藥7天后，天(門)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)，肌酸激酶(creatinine kinase，CK)和血尿氮(blood urea nitrogen，BUN)水平，評(píng)估對(duì)正常老鼠的心、肝和腎臟的毒性(如表5所示)。所有加藥組CK值水平與對(duì)照組相似，表明C2，HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs幾乎沒有心臟毒性。高的BUN值對(duì)應(yīng)高的腎臟毒性。C2組的BUN值(18.4±2.4mmol/L)明顯高于對(duì)照組(NaCl，7.3±1.1mmol/L)。而HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs組，特別是FA-HSA-C2 NPs組，明顯有較低的腎毒性。C2組的AST和ALT水平明顯高于對(duì)照組，而HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs組的AST和ALT水平與對(duì)照組相當(dāng)，表明HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs有很低的肝毒性。

表5.NaCl,C2,HSA-C2 NPs and FA-HSA-C2 NPs給藥組小鼠的血清學(xué)分析結(jié)果

(2)體內(nèi)抗腫瘤活性研究

將Bel-7402細(xì)胞和高濃度基質(zhì)膠混勻(基質(zhì)膠：PBS＝1：3)。由于基質(zhì)膠在10℃即凝結(jié)，因此，所有過程均應(yīng)在冰上操作。調(diào)整細(xì)胞密度，每只裸鼠/0.2mL，為了保證每只裸鼠接種的細(xì)胞數(shù)均勻，要將0.2mL混勻的細(xì)胞分至預(yù)冷的EP管中，細(xì)胞數(shù)為5×10⁶個(gè)，每只裸鼠接種一管。接種時(shí)所用的1mL注射器也應(yīng)預(yù)冷。接種細(xì)胞后，觀察和記錄腫瘤的形狀和大小。

當(dāng)腫瘤長約100mm³，挑選瘤體均勻、大小相對(duì)一致的32只裸鼠隨機(jī)分為4組，每組8只(對(duì)照組，C2組，HSA-C2 NPs組和FA-HSA-C2 NPs組)。對(duì)照組注射0.9％生理鹽水，C2組，HSA-C2 NPs組和FA-HSA-C2 NPs組以靜脈注射給藥方式注射3.5μmol Cu/kg體重的藥物。每3天給一次藥，給藥前稱裸鼠體重并用游標(biāo)卡尺記錄腫瘤體積(腫瘤體積(mm³)＝1/2×(L×W²)，L為腫瘤的長徑，W為腫瘤的短徑)，共給藥14次。

Bel-7402腫瘤小鼠分別靜脈注射C2，HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs，NaCl注射作為對(duì)照。每3天監(jiān)測一次腫瘤體積和老鼠體重的變化。24天實(shí)驗(yàn)期結(jié)束后，F(xiàn)A-HSA-C2 NPs治療組的腫瘤明顯小于C2和HSA-C2 NPs組(結(jié)果如圖8A所示)。相比對(duì)照組，24天治療后，C2組腫瘤體積為對(duì)照組體積的65.3±5.9％，HSA-C2 NPs是對(duì)照組的47.6±5.1％，F(xiàn)A-HSA-C2 NPs僅為對(duì)照組的29.9±3.1％，表明FA-HSA-C2 NPs比C2和HSA-C2 NPs組有更好抑瘤功效。同時(shí)，治療后的24天，處死小鼠收獲腫瘤、稱重和拍照(如圖8B和C所示)。腫瘤抑制率(TIR)用腫瘤重量來計(jì)算。相比對(duì)照組，F(xiàn)A-HSA-C2 NPs的TIR為78.2％(P<0.001)，明顯高于C2的腫瘤抑制率(34.2％，P<0.01)和HSA-C2 NPs的抑制率(54.4％，P<0.001)。

為了進(jìn)一步評(píng)估抗癌活性，腫瘤組織進(jìn)行切片和蘇木精和伊紅染色(H&E)組織學(xué)檢查。H&E染色顯示，藥物組與對(duì)照組的組織切片的腫瘤組織形態(tài)學(xué)明顯不一樣(如圖9所示)。在NaCl組中，腫瘤細(xì)胞中有一個(gè)紡錘形大核，并在腫瘤組織中沒有可見的細(xì)胞凋亡或壞死，表示腫瘤快速生長。然而，每個(gè)顯微鏡視野中顯示的腫瘤細(xì)胞，在C2，HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs組中平均細(xì)胞數(shù)量下降，出現(xiàn)碎片和核的收縮，特別是FA-HSA-C2 NPs治療的腫瘤更加明顯。

(3)體內(nèi)副作用比較

圖8C顯示了治療過程中，對(duì)照組，C2，HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs組老鼠體重的變化。HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs組老鼠體重相對(duì)于初體重分別下降了11.8％和8.1％，明顯低于對(duì)照組老鼠體重的下降(16.5％)。而C2組老鼠體重的下降達(dá)到18.4％。這些結(jié)果顯示，HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs降低了C2的副作用。此外，H&E染色也用于觀察藥物相關(guān)的副作用和對(duì)主要器官的毒性(如圖9所示)。值得一提，所有組對(duì)心臟幾乎沒有影響。然而，可以清楚地觀察到C2誘導(dǎo)嚴(yán)重的肝臟損害(肝細(xì)胞萎縮和輕度脂肪病變)和腎臟損害(焦點(diǎn)異常和腎小管的透明管型)。與此相反，HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs對(duì)肝臟和腎臟損傷較小-輕微炎癥和細(xì)胞萎縮。體重變化和病理研究結(jié)果表明，HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs可以有效地減少C2誘導(dǎo)的副作用和毒性，特別是葉酸官能化的HSA-C2 NPs。

(4)體內(nèi)靶向性研究

為了確定在體內(nèi)葉酸官能化的HSA NPs載體能否有效的積累到Bel-7402腫瘤組織中，我們測定了C2，HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs治療組中腫瘤組織和主要器官中銅含量。將保存于-80℃冰箱的荷瘤鼠的心、肝、腎臟和腫瘤組織分別勻漿。然后分別取0.5g樣品加入1mL 30％過氧化氫(H₂O₂)和7mL的濃HNO₃，在聚四氟乙烯壓力容器中礦化。礦化后的樣品中的Cu離子含量用電感耦合等離子原子發(fā)射光譜(ICP-AES)測定。

電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)的結(jié)果表明，HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs組腫瘤中銅的含量分別是C2組的1.5和2.1倍(如圖10所示)。這些結(jié)論表明，葉酸受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)屯作用對(duì)葉酸官能化的HSA NPs載體選擇性積累到Bel-7402腫瘤細(xì)胞起到重要的作用。結(jié)果數(shù)據(jù)還顯示，HSA-C2 NPs和FA-HSA-C2 NPs有利于降低C2積累到肝組織和腎臟組織中。