本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種以粗甘油為底物經(jīng)厭氧微生物菌群發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法。

背景技術(shù)：

1,3-丙二醇是一種重要的化工平臺(tái)化合物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及化妝品等多個(gè)行業(yè)，同時(shí)也是合成聚對(duì)苯二甲酸丙二酯(PTT)及聚呋喃二甲酸丙二酯(PTF)的單體。PTT作為新型的聚酯纖維，具有優(yōu)良的柔軟性、回彈性及染色性，在紡織行業(yè)具有良好的發(fā)展前景。PTF是一種100％可再生的新型聚酯，是代替塑料制品的理想原料，在包裝行業(yè)具有巨大的應(yīng)用潛力。因此，1,3-丙二醇具有巨大的市場(chǎng)需求空間。

1,3-丙二醇的主要生產(chǎn)方式有化學(xué)法和生物法。化學(xué)法包括丙烯醛水合加氫法和環(huán)氧乙烷羰基化法，以丙烯或乙烯為起始原料，經(jīng)多步高溫高壓催化反應(yīng)合成1,3-丙二醇；生物法則利用某些天然細(xì)菌或基因工程菌株，以甘油或葡萄糖為底物常溫發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇。相比于化學(xué)法，微生物發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇具有原料可再生、生產(chǎn)過程綠色環(huán)保以及操作簡(jiǎn)易安全等優(yōu)勢(shì)，但由于生產(chǎn)成本較高和研發(fā)時(shí)間較短等因素，致使發(fā)酵法的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用相對(duì)遲緩。生物柴油生產(chǎn)過程中副產(chǎn)的廉價(jià)粗甘油是降低1,3-丙二醇生產(chǎn)成本的理想原料，而粗甘油中含有的復(fù)雜成分(甲醇、鹽、游離脂肪酸等)對(duì)菌體生長(zhǎng)代謝有一定抑制作用，這就需要開發(fā)新的技術(shù)和方法解決此問題。

自然界中能將甘油轉(zhuǎn)化為1,3-丙二醇的高效菌株主要分為兩大類：一類是以肺炎克雷伯氏桿菌(Klesiella penumoniae)為代表的兼性厭氧菌，另一類是以丁酸梭菌(Clostridium butyricum)為代表的嚴(yán)格厭氧菌。其中，肺炎克雷伯氏桿菌與丁酸梭菌以其較高的甘油耐受力和1,3-丙二醇生產(chǎn)能力而受到人們的關(guān)注，已有大量研發(fā)和應(yīng)用報(bào)道。肺炎克雷伯氏桿菌為兼性厭氧菌，生長(zhǎng)迅速，生產(chǎn)強(qiáng)度高，且易于基因改造，但其條件致病菌屬性限制了工業(yè)化應(yīng)用。此外，該菌的代謝產(chǎn)物除了1,3-丙二醇外，還有2,3-丁二醇、乙酸、乳酸、琥珀酸等副產(chǎn)物，其中2,3-丁二醇的沸點(diǎn)與目標(biāo)產(chǎn)物相近，導(dǎo)致后續(xù)產(chǎn)物分離困難。丁酸梭菌是嚴(yán)格厭氧菌，屬于益生的安全菌，并且其代謝副產(chǎn)物主要為乙酸及丁酸，無2,3-丁二醇。相比于肺炎克雷伯氏桿菌，丁酸梭菌發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇最大局限是該菌株生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，導(dǎo)致產(chǎn)物生產(chǎn)強(qiáng)度低。以純甘油為底物時(shí)，典型的丁酸梭菌DSM 5431在間歇發(fā)酵中可耐受底物濃度為110g/L，生產(chǎn)56g/L 1,3-丙二醇，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.93g/(L·h)(Appl Microbiol Biotechnol,1992,36:592-597)。以粗甘油為底物時(shí)，丁酸梭菌VPI 1718在間歇發(fā)酵中可耐受底物濃度為80.1g/L，生產(chǎn)41.9g/L 1,3-丙二醇，發(fā)酵時(shí)間為52h，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.81g/(L·h)；在批式流加發(fā)酵中，該菌株可生產(chǎn)67.9g/L 1,3-丙二醇，生產(chǎn)強(qiáng)度僅為0.78g/(L·h)(Appl Microbiol Biotechnol,2011,91:101-112)。CN 102965323B公開了一種用丁酸梭菌轉(zhuǎn)化粗甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法，1,3-丙二醇最終濃度為78.5g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度僅為1.49g/(L·h)，因此開發(fā)一種生物安全性高、生產(chǎn)強(qiáng)度高、成本較低的1,3-丙二醇發(fā)酵方法對(duì)其工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

近年來，微生物菌群發(fā)酵逐漸引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。例如CN 104774879公開了一種微生物混菌發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法，混菌可耐受初始甘油濃度高達(dá)200g/L(單菌只能耐受100g/L)，1,3-丙二醇產(chǎn)量達(dá)到81.40g/L，副產(chǎn)物不含2,3-丁二醇，但該發(fā)明是以肺炎克雷伯氏桿菌為主的混菌，且用純甘油作底物，工業(yè)應(yīng)用具有較大局限。也有學(xué)者利用從沼氣池污泥中篩選得到的混菌發(fā)酵粗甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇(Bioprocess Biosyst Eng,2014,37:225-233)，1,3-丙二醇最終濃度可達(dá)70g/L，同時(shí)生產(chǎn)強(qiáng)度為2.60g/(L·h)，明顯高于單菌發(fā)酵。但當(dāng)?shù)孜锎指视蜐舛冗_(dá)到70g/L時(shí)菌體生長(zhǎng)代謝會(huì)受到明顯抑制，同時(shí)菌種組成未知，生物安全性有待考證。因此開發(fā)一種菌種穩(wěn)定性強(qiáng)、生物安全性好、耐受粗甘油能力強(qiáng)、1,3-丙二醇生產(chǎn)強(qiáng)度高的微生物混合菌群，高效轉(zhuǎn)化粗甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇成為一條工業(yè)化發(fā)展的新思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述的現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種生物安全性高的可高效轉(zhuǎn)化粗甘油為1,3-丙二醇的微生物菌群以及利用該微生物菌群制備1,3-丙二醇的方法。本發(fā)明的微生物菌群以丁酸梭菌為主的混菌，其穩(wěn)定性高，在厭氧條件下高效轉(zhuǎn)化粗甘油為1,3-丙二醇，克服丁酸梭菌純菌發(fā)酵粗甘油耐受性低、生產(chǎn)強(qiáng)度低等局限。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種用于以甘油為底物發(fā)酵制備1,3-丙二醇的微生物混合菌群，所述的微生物混合菌群以丁酸梭菌為優(yōu)勢(shì)菌，所述丁酸梭菌的有效活菌數(shù)占微生物混合菌群中有效活菌數(shù)的95％以上。

進(jìn)一步地，所述的微生物混合菌群還含有與丁酸梭菌共生的混合共生菌，所述混合共生菌的有效活菌數(shù)占所述的微生物混合菌群中有效活菌數(shù)的5％以下，所述混合共生菌由梭菌屬菌株和乳桿菌屬菌株組成，二者的有效活菌數(shù)比例為1.50～4.99：0.01～0.05，所述梭菌屬菌株不包括丁酸梭菌。

進(jìn)一步地，所述梭菌屬菌株為雙酶梭菌和拜氏梭菌中的一種或兩種；所述乳桿菌屬菌株為乳桿菌Lactobacillus farraginis與乳桿菌Lactobacillus equicursoris中的一種或兩種。

進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，所述的甘油為粗甘油，更優(yōu)選地，所述的粗甘油為甘油含量為75～95％的生物柴油副產(chǎn)物或油脂水解產(chǎn)物。

本發(fā)明還提供一種1,3-丙二醇的發(fā)酵方法，該方法包括將上述的微生物混合菌接入至以甘油為底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵的步驟。

進(jìn)一步地，在上述的技術(shù)方案中，將所述的微生物混合菌接入以甘油為底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。所述發(fā)酵過程可以采用間歇發(fā)酵，也可以采用批式流加發(fā)酵：采用間歇發(fā)酵方式發(fā)酵時(shí)發(fā)酵起始甘油濃度為40～120g/L，優(yōu)選為100g/L；采用批式流加發(fā)酵方式發(fā)酵時(shí)可以采取兩種底物流加策略：連續(xù)補(bǔ)料與間歇補(bǔ)料。兩種流加策略的發(fā)酵起始甘油濃度為40～120g/L，優(yōu)選80g/L，在連續(xù)補(bǔ)料的批式流加發(fā)酵過程中甘油濃度維持在10～35g/L，優(yōu)選維持在10～25g/L，在間歇補(bǔ)料的批式流加發(fā)酵過程中，當(dāng)甘油濃度低于20g/L時(shí)，間歇補(bǔ)料至甘油濃度為40～120g/L，優(yōu)選80g/L。

進(jìn)一步地，在上述的技術(shù)方案中，所述的甘油為純甘油或粗甘油，所述的粗甘油為甘油含量為75～95％的生物柴油副產(chǎn)物或油脂水解產(chǎn)物。

進(jìn)一步地，在上述的技術(shù)方案中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L為劑量單位含有如下組分：粗甘油40～120，KH₂PO₄ 1.36，(NH₄)₂SO₄ 6.61，MgCl₂·6H₂O 0.26，CaCl₂ 0.29，檸檬酸0.42，酵母粉2.0，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中另加入5mL微量元素B溶液，其中微量元素B溶液的組成為：ZnCl₂ 0.68g/L，MnCl₂·4H₂O 0.17g/L，H₃BO₃ 60mg/L，CuCl₂·2H₂O 0.47g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 5mg/L，F(xiàn)eCl₂·4H₂O 3.97g/L，CoCl₂·6H₂O 0.47g/L，飽和鹽酸10mL/L。

本發(fā)明所述的微生物混合菌可利用粗甘油發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇。該混合菌可在初始甘油濃度40～120g/L條件下發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇，最終1,3-丙二醇濃度在20～90g/L，副產(chǎn)物為丁酸和乙酸，生產(chǎn)強(qiáng)度在1.5～4.0g/(L·h)。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明公開了一種用于甘油發(fā)酵制備1,3-丙二醇的微生物混合菌，該混合菌以丁酸梭菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，并含有少量梭菌屬(非丁酸梭菌)與乳桿菌屬菌株，菌群穩(wěn)定性好，生物安全性高。與傳統(tǒng)的丁酸梭菌純種發(fā)酵相比，對(duì)復(fù)雜底物耐受性強(qiáng)，生產(chǎn)強(qiáng)度高。

(2)本發(fā)明微生物混合菌利用廉價(jià)非糧原料粗甘油為底物發(fā)酵制備1,3-丙二醇，降低生產(chǎn)成本。

(3)利用本發(fā)明的微生物混合菌進(jìn)行發(fā)酵，底物流加可采取間歇補(bǔ)料的策略，補(bǔ)料過程操作簡(jiǎn)便，降低1,3-丙二醇生產(chǎn)人工成本。

(4)利用本發(fā)明的微生物混合菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基無需滅菌，進(jìn)一步降低1,3-丙二醇生產(chǎn)成本。

附圖說明：

圖1為微生物菌群C2-2M傳代過程中細(xì)胞生長(zhǎng)情況；

圖2為微生物菌群C2-2M傳代過程中代謝產(chǎn)物的變化情況；

圖3為微生物菌群C2-2M在不同起始粗甘油濃度下的甘油消耗情況；

圖4為微生物菌群C2-2M以底物濃度為100g/L粗甘油的間歇發(fā)酵結(jié)果；

圖5為單菌S1以底物濃度為80g/L粗甘油的間歇發(fā)酵結(jié)果；

圖6為微生物菌群D6以底物濃度為100g/L粗甘油的間歇發(fā)酵結(jié)果；

圖7為微生物菌群C2-2M以純甘油為底物的連續(xù)補(bǔ)料的批式流加發(fā)酵結(jié)果；

圖8為微生物菌群C2-2M以粗甘油為底物的連續(xù)補(bǔ)料的批式流加發(fā)酵結(jié)果；

圖9為微生物菌群C2-2M以粗甘油為底物的間歇補(bǔ)料的批式流加發(fā)酵結(jié)果；

圖10為微生物菌群C2-2M以粗甘油為底物不滅菌條件下的批式流加發(fā)酵結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，所使用的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，所用試劑等均可從化學(xué)或生物試劑公司購(gòu)買。

以下結(jié)合技術(shù)方案詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實(shí)施方式。

1.下述實(shí)施例使用的培養(yǎng)基：

種子培養(yǎng)基(g/L)：甘油22.0，KH₂PO₄ 1.3，K₂HPO₄·7H₂O 4.5，(NH₄)₂SO₄ 2.0，MgSO₄·7H₂O 0.2，CaCO₃ 2.0，CaCl₂ 0.02，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5，酵母粉1.0。此外，每升培養(yǎng)基中加入2.0mL微量元素A溶液(飽和鹽酸0.9mL/L，CuCl₂·2H₂O 20mg/L，ZnCl₂ 70mg/L，MnCl₂·4H₂O 100mg/L，H₃BO₃ 60mg/L，CoCl₂·6H₂O 200mg/L，NiCl₂·6H₂O 25mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 35mg/L)和1.0mL Fe²⁺溶液(飽和鹽酸4mL/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 5g/L)。

固體培養(yǎng)基(1L)：種子培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15g。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油40～120，KH₂PO₄ 1.36，(NH₄)₂SO₄ 6.61，MgCl₂·6H₂O 0.26，CaCl₂ 0.29，檸檬酸0.42，酵母粉2.0，每升培養(yǎng)基中另加入5mL微量元素B溶液(ZnCl₂0.68g/L，MnCl₂·4H₂O 0.17g/L，H₃BO₃ 60mg/L，CuCl₂·2H₂O 0.47g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 5mg/L，F(xiàn)eCl₂·4H₂O 3.97g/L，CoCl₂·6H₂O 0.47g/L，飽和鹽酸10mL/L)。

2.種子培養(yǎng)條件：厭氧培養(yǎng)。采用250mL西林瓶，裝液量為100mL。待裝入培養(yǎng)基后每瓶持續(xù)通3min高純氮?dú)獬?，之后用丁基膠塞封頂。實(shí)驗(yàn)過程中用一次性無菌針管接種及取樣，接種量2-10％(v/v)，培養(yǎng)溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)時(shí)間15～24h。

3.發(fā)酵培養(yǎng)條件：采用5L全自動(dòng)發(fā)酵罐，裝液量2L，接種量10％(v/v)，發(fā)酵罐溫度37℃，轉(zhuǎn)速250r/min，發(fā)酵過程用5M NaOH控制pH為7.0。接種前后1h內(nèi)通入0.15vvm高純氮營(yíng)造罐內(nèi)厭氧環(huán)境。

粗甘油：是油脂水解的產(chǎn)物，組成為(w/w)：78％甘油、15～17％水、0.87％灰分、<0.1％游離脂肪酸，pH 6.91。

實(shí)施例1 從厭氧活性污泥中篩選馴化產(chǎn)1,3-丙二醇的微生物菌群

取2.0g厭氧活性污泥，接入含22g/L粗甘油的種子培養(yǎng)基中在37℃，200r/min條件下厭氧培養(yǎng)，待培養(yǎng)基甘油消耗殆盡后逐漸減小接種量進(jìn)行傳代培養(yǎng)，經(jīng)20次傳代后菌群生物量與代謝基本達(dá)到穩(wěn)定。自然富集馴化過程如圖1和2所示，總體可分為三階段：初期(2代至4代)、波動(dòng)期(5代至12代)及穩(wěn)定期(12代之后)。篩選初期是菌群結(jié)構(gòu)適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境的階段，可富集到能利用甘油、生長(zhǎng)迅速的菌株，淘汰掉不能利用底物、生長(zhǎng)緩慢的菌株。隨著傳代次數(shù)的增加，培養(yǎng)時(shí)間逐漸由96h下降為24h，OD值由1.7增加至3.5，1,3-丙二醇濃度達(dá)到11.5g/L左右。波動(dòng)期是菌群生長(zhǎng)代謝不穩(wěn)定的階段，表現(xiàn)為培養(yǎng)時(shí)間(延長(zhǎng)至36h)、殘余甘油量(0.64～3.87g/L)、1,3-丙二醇產(chǎn)量(7.33～11.96g/L)、副產(chǎn)物(乙酸、乳酸、丁酸)產(chǎn)量等均有波動(dòng)。穩(wěn)定期是菌群生長(zhǎng)代謝趨于穩(wěn)定的階段，培養(yǎng)時(shí)間重新穩(wěn)定至24h，殘余甘油進(jìn)一步降低，OD值穩(wěn)定至3.6上下，1,3-丙二醇產(chǎn)量穩(wěn)定至12g/L以上，副產(chǎn)物乳酸消失，只剩下少量乙酸和丁酸。第20代菌群被命名為C2-2M。經(jīng)不斷傳代C2-2M在種子培養(yǎng)基中可保持穩(wěn)定生長(zhǎng)，發(fā)酵時(shí)間為24h，OD值穩(wěn)定至3.6左右，長(zhǎng)時(shí)間在同一條件下自然富集馴化使微生物菌群組成趨于穩(wěn)定。在產(chǎn)物分布中，C2-2M以1,3-丙二醇為主要代謝產(chǎn)物，濃度達(dá)到12.62g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為0.71mol/mol，已接近理論轉(zhuǎn)化率；副產(chǎn)物種類少，僅為乙酸和丁酸，含量分別為1.15g/L和1.21g/L。

菌群C2-2M 16S rRNA基因經(jīng)測(cè)序及多樣性分析，其組成為如下：丁酸梭菌(Clostridium butyricum)97.34％、梭菌屬(Clostridium)(非丁酸梭菌)2.64％、乳桿菌屬(Lactobacillus)0.02％，其中百分比(％)表示各菌的有效活菌數(shù)占微生物菌群C2-2M中總有效活菌數(shù)的百分比。所述梭菌屬菌株為雙酶梭菌(Clostridium bifermentans)與拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的混合菌，其活菌數(shù)比例為0.81：1.83，乳桿菌屬菌株為乳桿菌Lactobacillus farraginis與乳桿菌Lactobacillus equicursoris的混合菌，其活菌數(shù)比例為0.01:0.01。該混合菌群16S rRNA基因測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)已提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，簡(jiǎn)稱NCBI)的Sequence Read Archive(SRA)數(shù)據(jù)庫(kù)中，登錄號(hào)為SRP071045。

經(jīng)厭氧涂平板從菌群C2-2M中分離得到單菌落S1和S2，經(jīng)染色鏡檢，均為革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌，單菌落S1和S2的16S rDNA相同，序列經(jīng)克隆測(cè)序及比對(duì)后，確定為丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，其16S rDNA序列見序列表。

以菌群C2-2M為原液，在厭氧環(huán)境中用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋(10^-2～10^-7)，在稀釋至10^-6時(shí)得到可消耗甘油的含最少菌種種類的微生物菌群D6。經(jīng)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序及分析，微生物菌群D6由94.92％丁酸梭菌(Clostridium butyricum)及5.08％雙酶梭菌(Clostridium bifermentans)組成。

實(shí)施例2 厭氧微生物菌群C2-2M對(duì)粗甘油的耐受性

將實(shí)施例1中獲得的混合菌群C2-2M經(jīng)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，按10％體積比接種至裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，每批次發(fā)酵的初始甘油濃度由40g/L逐漸提升至140g/L(加入適量粗甘油，配置得到初始甘油濃度為40～140g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基)，如圖3所示。發(fā)酵結(jié)果表明，微生物菌群C2-2M對(duì)粗甘油有較強(qiáng)的耐受能力，可在甘油含量為120g/L的粗甘油中生長(zhǎng)代謝，1,3-丙二醇濃度達(dá)到60.61g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為0.63mol/mol，生產(chǎn)強(qiáng)度為3.79g/(L·h)。相對(duì)而言，初始甘油濃度為100g/L時(shí)間歇發(fā)酵效率較高(如圖4所示)，此時(shí)1,3-丙二醇濃度為51.28g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為0.64mol/mol，生產(chǎn)強(qiáng)度為4.10g/(L·h)。

實(shí)施例3 厭氧菌S1以粗甘油為底物的間歇發(fā)酵

單菌S1以80g/L粗甘油為底物的發(fā)酵結(jié)果如圖5所示，1,3-丙二醇濃度為44.34g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為0.67mol/mol，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.92g/(L·h)。雖然單菌S1發(fā)酵粗甘油得到1,3-丙二醇濃度及摩爾轉(zhuǎn)化率與微生物菌群C2-2M發(fā)酵水平相近，但發(fā)酵時(shí)間分別較微生物菌群發(fā)酵延長(zhǎng)了38h，生產(chǎn)強(qiáng)度僅為微生物菌群發(fā)酵的22.4％。這表明微生物菌群C2-2M較單菌具有優(yōu)良的發(fā)酵性能，能耐受較高的甘油濃度，并且發(fā)酵時(shí)間較短。

實(shí)施例4 微生物菌群D6以粗甘油為底物的間歇發(fā)酵

將實(shí)施例1中所得的厭氧微生物菌群C2-2M在厭氧環(huán)境中梯度稀釋，稀釋至10^-6時(shí)得到含94.92％丁酸梭菌及5.08％雙酶梭菌的微生物菌群D6。經(jīng)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，按10％體積比接入至發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐初始粗甘油濃度為100g/L，發(fā)酵結(jié)果如圖6所示。1,3-丙二醇濃度為49.38g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為0.67mol/mol。該水平雖然與初始菌群C2-2M能力相當(dāng)，但發(fā)酵時(shí)間較初始菌群C2-2M延長(zhǎng)至28h，生產(chǎn)強(qiáng)度降低至1.76g/(L·h)。與原始微生物菌群C2-2M相比，微生物菌群D6發(fā)酵粗甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇效率明顯降低。這表明含有梭菌屬(非丁酸梭菌)及乳桿菌屬的混合菌A可以提高微生物菌群C2-2M對(duì)粗甘油的耐受能力，縮短發(fā)酵時(shí)間，提高1,3-丙二醇生產(chǎn)強(qiáng)度。

實(shí)施例5 厭氧微生物菌群C2-2M以純甘油為底物的批式流加發(fā)酵

將實(shí)施例1中獲得的混合菌群C2-2M經(jīng)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)后，以10％接種量接入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，初始純甘油濃度為80g/L，發(fā)酵過程中不斷補(bǔ)加純甘油維持底物濃度為10～25g/L，發(fā)酵時(shí)間為24h，結(jié)果如圖7所示。最終1,3-丙二醇濃度為83.71g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為0.65mol/mol，生產(chǎn)強(qiáng)度為3.49g/(L·h)。

實(shí)施例6 厭氧微生物菌群C2-2M以粗甘油為底物的連續(xù)補(bǔ)料的批式流加發(fā)酵

將實(shí)施例1中獲得的混合菌群C2-2M的種子培養(yǎng)液以10％接種量接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基初始粗甘油濃度為80g/L，發(fā)酵過程中不斷補(bǔ)加粗甘油維持底物濃度為10～25g/L，發(fā)酵時(shí)間為24h，發(fā)酵結(jié)果如圖8所示。最終1,3-丙二醇濃度為77.39g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為0.65mol/mol，生產(chǎn)強(qiáng)度為3.22g/(L·h)。這表明微生物菌群C2-2M具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化粗甘油為1,3-丙二醇的能力。

實(shí)施例7 厭氧微生物菌群C2-2M以粗甘油為底物的間歇補(bǔ)料的批式流加發(fā)酵

將實(shí)施例1中獲得的混合菌群C2-2M的種子培養(yǎng)液以10％接種量接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基初始粗甘油濃度為80g/L，發(fā)酵過程中當(dāng)甘油濃度低于15g/L時(shí)補(bǔ)充甘油至濃度為80g/L，待甘油濃度再次消耗至20g/L以下時(shí)，補(bǔ)充甘油至濃度為40g/L，發(fā)酵時(shí)間為24h，發(fā)酵結(jié)果如圖9所示。最終1,3-丙二醇濃度為79.78g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為0.65mol/mol，生產(chǎn)強(qiáng)度為3.32g/(L·h)。這表明微生物菌群C2-2M對(duì)粗甘油有良好的適應(yīng)性，其1,3-丙二醇的生產(chǎn)能力不受發(fā)酵過程底物濃度劇烈變化影響。

實(shí)施例8 厭氧微生物菌群C2-2M以粗甘油為底物在培養(yǎng)基不滅菌條件下批式流加發(fā)酵

將實(shí)施例1中獲得的混合菌群C2-2M種子培養(yǎng)液以10％接種量接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐培養(yǎng)基無需滅菌，初始粗甘油濃度為80g/L，發(fā)酵過程中不斷補(bǔ)入粗甘油維持底物濃度為10～25g/L，發(fā)酵時(shí)間為24h，發(fā)酵結(jié)果如圖10所示。最終1,3-丙二醇濃度為76.63g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為0.64mol/mol，生產(chǎn)強(qiáng)度為3.19g/(L·h)。這表明不滅菌條件可達(dá)到與滅菌條件相同的發(fā)酵水平，該過程可節(jié)省生產(chǎn)成本。

SEQUENCE LISTING

<110> 大連理工大學(xué)

<120> 一種發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的微生物混合菌群及發(fā)酵方法

<130> 2011

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1336

<212> DNA

<213> 丁酸梭菌（Clostridium butyricum）

<400> 1

gagtggatta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctcat agaggggaat 60

agcctttcga aaggaagatt aataccgcat atggtagctt tatcgcatgg tagtgctatt 120

aaaggagtaa tccgctatga gatggacccg cgtcgcatta gctagttggt gaggtaacgg 180

ctcaccaagg cgacgatgcg tagccgacct gagagggtga tcggccacat tgggactgag 240

acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggggaaaccc 300

tgatgcagca acgccgcgtg agtgatgacg gccttcgggt tgtaaaactc tgtctttggg 360

gacgataatg acggtaccca aggaggaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt 420

aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tactgggcgt aaagggagcg taggtggata 480

tttaagtggg atgtgaaata ctcgggctta acctgggtgc tgcattccaa actggatatc 540

tagagtgcag gagaggaaag gagaattcct agtgtagcgg tgaaatgcgt agagattagg 600

aagaatacca gtggcgaagg cgcctttctg gactgtaact gacactgagg ctcgaaagcg 660

tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg aatactaggt 720

gtaggggttg tcatgacctc tgtgccgccg ctaacgcatt aagtattccg cctggggagt 780

acggtcgcaa gattaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagca gcggagcatg 840

tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct tacctagact tgacatctcc tgaattactc 900

tgtaatggag gaagccactt cggtggcagg aagacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct 960

cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttattg ttagttgcta 1020

ccatttagtt gagcactcta gcgagactgc ccgggttaac cgggaggaag gtggggatga 1080

cgtcaaatca tcatgcccct tatgtctagg gctacacacg tgctacaatg gtcggtacaa 1140

tgagatgcaa cctcgcgaga gtgagcaaaa ctataaaacc gatctcagtt cggattgtag 1200

gctgaaactc gcctacatga agctggagtt gctagtaatc gcgaatcaga atgtcgcggt 1260

gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgagagttg gcaataccca 1320

aagttcgtga gctaac 1336