本發(fā)明涉及一種利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的方法，屬于生物工程發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

蝦青素(3，3′-二羥基-4，4′-二酮基-β，β′-胡蘿卜素，又稱蝦紅素)，化學(xué)分子式為C₄₀H₅₂O₄，為萜烯類不飽和化合物，是一種在自然界中廣泛存在的天然類胡蘿卜素，許多甲殼動(dòng)物如蝦、龍蝦、螃蟹等體內(nèi)都含有蝦青素，蝦青素本身為紅色，當(dāng)它和蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)可以呈現(xiàn)出深藍(lán)或綠色，而在加工過(guò)程中由于加熱破壞了蝦青素與蛋白質(zhì)的結(jié)合而恢復(fù)了蝦青素本來(lái)的顏色。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，蝦青素具有超強(qiáng)的抗氧化活性，在增強(qiáng)免疫力、抑制腫瘤、抑制糖尿病腎病、清除自由基和活性氧等方面具有非常積極的作用。其不僅可以用作珍貴水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖的餌料添加劑和人類的食品添加劑，在藥品、化妝品和高級(jí)營(yíng)養(yǎng)保健品等領(lǐng)域也具有極大的應(yīng)用潛力。

目前，蝦青素的生產(chǎn)工藝主要有從水產(chǎn)品加工廢棄物中提取蝦青素、利用藻類如雨生紅球藻等生產(chǎn)蝦青素、利用紅法夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素和化學(xué)合成法等等。化學(xué)合成的蝦青素同天然蝦青素在結(jié)構(gòu)、功能、應(yīng)用及安全性等方面有著顯著差異，美國(guó)食品與藥物管理局已禁止化學(xué)合成的蝦青素進(jìn)入保健食品市場(chǎng)。目前，蝦青素的生產(chǎn)一般傾向于開(kāi)發(fā)天然蝦青素的生物來(lái)源。

天然蝦青素的主要來(lái)源有水產(chǎn)品廢棄物、紅發(fā)夫酵母和微藻，由于水產(chǎn)廢棄物和微藻中蝦青素含量較低，且提取費(fèi)用較高，不適于進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明首先提供了一種可用于產(chǎn)天然蝦青素的酵母菌(Yarrowia lipolytica)As，于2016年11月17日，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2016644，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)。

本發(fā)明還提供了應(yīng)用所述微生物發(fā)酵產(chǎn)蝦青素的方法，包括以下步驟：

(1)制備種子培養(yǎng)液：將保存的菌株，接種于液體種子培養(yǎng)基中，在28～30℃，180～200rpm/min條件下，培養(yǎng)20～24h，得到種子培養(yǎng)液；

(2)發(fā)酵產(chǎn)蝦青素：按1～10％的比例將種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，罐溫28～30℃，通風(fēng)量：1.0-5.0VVM，pH：氫氧化鈉或氨水控制pH在4.0～6.0，培養(yǎng)時(shí)間：55～75小時(shí)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵發(fā)酵20-30h后開(kāi)始采取Do-stat方式補(bǔ)料，控制溶氧不低于10～30％。補(bǔ)料培養(yǎng)基配方為：甘油500g/L、KH₂PO₄5g/L、MgSO₄3g/L。發(fā)酵55-75h結(jié)束，取樣測(cè)定發(fā)酵液中蝦青素含量為400mg/L，純度為82.6％。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：稱取甘油120g、酵母浸膏10.5g、KH₂PO₄6.75g、MgSO₄2.1g、(NH₄)₂SO₄22.8g、肌醇0.15g，加入1500mL去離子水，121℃、20mins滅菌，加入混合維生素溶液10mL/L，混合金屬離子溶液10mL/L?；旌暇S生素溶液組成為：泛酸:5.4g/L、吡哆醇:1.4g/L、煙酸:6.1g/L、葉酸:0.04g/L、生物素:0.06g/L，過(guò)濾除菌?；旌辖饘匐x子溶液組成為：Fe₃Cl₃.6H₂O:2.7g/L、ZnSO₄.7H₂O:1.4g/L、CaCl₂.2H₂O:2.0g/L、Na₂MoO₄.2H2O:2.0g/L、CuSO₄.2H₂O:1.9g/L、H₃Bo₃:0.5g/L、MnSO₄.H₂O:2.0g/L，121℃、20mins滅菌。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，種子培養(yǎng)基配方為：稱取甘油2g、酵母浸膏0.3g、KH₂PO₄0.45g、MgSO₄0.2g、(NH₄)₂SO₄2.4g、肌醇0.01g，加入100mL去離子水，121℃、20mins滅菌，加入混合維生素溶液10mL/L，混合金屬離子溶液10mL/L。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵時(shí)接種量為10％。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵溫度為30℃。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵時(shí)控制pH為4.0。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，3L發(fā)酵罐初始溫度28℃，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)200rpm，通風(fēng)比1L/min條件下培養(yǎng)；發(fā)酵20-26h后進(jìn)入補(bǔ)料時(shí)期，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)提高至1200rpm，通風(fēng)為1-5L/min，用NaOH控制pH4.0，開(kāi)始補(bǔ)料。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵初期用NaOH控制pH4.0，進(jìn)入補(bǔ)料時(shí)期，改用NH₃H₂O控制pH4.0。

本發(fā)明是利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素，與現(xiàn)有技術(shù)相比優(yōu)勢(shì)在于，蝦青素的產(chǎn)量得到了有效地提高，為450mg/L，所利用的原料比較廉價(jià)，生產(chǎn)成本大大降低，為快速高效生產(chǎn)天然蝦青素提供有效的方法。

生物材料保藏

一種可用于產(chǎn)天然蝦青素的酵母菌(Yarrowia lipolytica)As，于2016年11月17日，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2016644，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)。

附圖說(shuō)明

圖1是蝦青素的HPLC圖譜。

圖2是不同接種量條件下蝦青素的產(chǎn)量。

圖3是不同pH條件下蝦青素的產(chǎn)量。

圖4是分階段控制pH條件下蝦青素的產(chǎn)量

圖5是不同傳代數(shù)條件下蝦青素的產(chǎn)量。

具體實(shí)施方式

分析方法：采用高效液相色譜法分析發(fā)酵液中的蝦青素。其中，測(cè)定采用島津SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，Phenomenex luna 5u C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μ)；流動(dòng)相85％乙腈：15％異丙醇；流速1.5ml/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量10μL。甘油的測(cè)定采用示差檢測(cè)器；Phenomenex luna 5u NH2色譜柱(250mm×4.6mm，5μ)，柱溫30℃；RID溫度35℃；流動(dòng)相85％乙腈，流速1.0ml/min；進(jìn)樣量10μL。

實(shí)施例1種子液的培養(yǎng)

⑴發(fā)酵菌種的準(zhǔn)備：取保存在-80℃的Yarrowia菌種于固體培養(yǎng)基中，劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28℃～30℃，培養(yǎng)24～48h。

固體培養(yǎng)基的配制方法：成分為酵母浸膏1g、蛋白胨2g、葡萄糖2g、瓊脂粉1.5g，然后用去離子水定容到100ml，在溫度121℃、高壓蒸汽滅菌15～20min，冷卻制得固體平板。

⑵種子液培養(yǎng)：將甘油管保藏菌接種于種子液中，在溫度30℃、轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)20～26h，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。

種子培養(yǎng)基的配制方法：成分為甘油2g、酵母浸膏0.3g、KH₂PO₄0.45g、MgSO₄0.2g、(NH₄)₂SO₄2.4g、肌醇0.01g然后用去離子水定容至100ml，在溫度121℃、高壓蒸汽滅菌20min，冷卻后加入混合維生素溶液1mL，混合金屬離子溶液1mL，制得種子培養(yǎng)基。

實(shí)施例2搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

取實(shí)施例1中Yarrowia種子液按接種量10％(V/V)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度28℃～30℃、轉(zhuǎn)速200r/min培20～30h。

發(fā)酵培養(yǎng)基制備：成分為甘油120g、酵母浸膏10.5g、KH₂PO₄6.75g、MgSO₄2.1g、(NH₄)₂SO₄22.8g、肌醇0.15g，然后用去離子水定容到1.5L，在溫度121℃、高壓蒸汽滅菌20min，冷卻后加入混合維生素溶液15mL，混合金屬離子溶液15mL，制得發(fā)酵液。

實(shí)施例3 3L發(fā)酵罐生產(chǎn)蝦青素

⑴取甘油管保存菌株，接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30℃，200rpm搖床培養(yǎng)20～30h。種子培養(yǎng)基配方和實(shí)施例1相同。

⑵將培養(yǎng)好的種子液按10％接種量接種于3L發(fā)酵罐，開(kāi)始發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基配方和實(shí)施例2相同，3L發(fā)酵罐初始裝液量1.5L，121℃滅菌20min，其中維生素混合液以過(guò)濾除菌方式加入。

⑶3L發(fā)酵罐初始溫度28℃，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)200rpm，通風(fēng)比1L/min條件下培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)提高至1200rpm，通風(fēng)為1-5L/min，用NaOH控制pH4.0，發(fā)酵20-30h后開(kāi)始采取Do-stat方式補(bǔ)料，補(bǔ)料培養(yǎng)基配方為：甘油500g/L、KH₂PO₄5g/L、MgSO₄3g/L。發(fā)酵55-75h結(jié)束，取樣測(cè)定發(fā)酵液中蝦青素含量為400mg/L，純度為82.6％。

實(shí)施例4 3L發(fā)酵罐不同接種量條件下生產(chǎn)蝦青素

⑴取甘油管保存菌株，接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30℃，200rpm搖床培養(yǎng)20～30h。種子培養(yǎng)基配方和實(shí)施例1相同。

⑵將培養(yǎng)好的種子液接種于3L發(fā)酵罐，開(kāi)始發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基配方和實(shí)施例2相同，3L發(fā)酵罐初始裝液量1.5L，121℃滅菌20min，其中維生素混合液以過(guò)濾除菌方式加入。

⑶3L發(fā)酵罐初始溫度28℃，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)200rpm，通風(fēng)比1L/min條件下培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)提高至1200rpm，通風(fēng)為1-5L/min，用NaOH控制pH4.0，發(fā)酵20-26h后開(kāi)始采取Do-stat方式補(bǔ)料。發(fā)酵55-75h結(jié)束。

接種量1％，發(fā)酵至56h，取樣測(cè)定發(fā)酵液中蝦青素含量達(dá)到最高為252mg/L，純度為62.7％。

接種量5％，發(fā)酵至56h，取樣測(cè)定發(fā)酵液中蝦青素含量達(dá)到最高為317mg/L，純度為52.2％。

接種量10％，發(fā)酵至56h，取樣測(cè)定發(fā)酵液中蝦青素含量達(dá)到最高為335mg/L，純度為62.7％。

實(shí)施例5 3L發(fā)酵罐不同pH條件下生產(chǎn)蝦青素

⑴取甘油管保存菌株，接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30℃，200rpm搖床培養(yǎng)20～30h。種子培養(yǎng)基配方和實(shí)施例1相同。

⑵將培養(yǎng)好的種子液按10％接種量接種于3L發(fā)酵罐，開(kāi)始發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基配方和實(shí)施例2相同，3L發(fā)酵罐初始裝液量1.5L，121℃滅菌20min，其中維生素混合液以過(guò)濾除菌方式加入。

⑶3L發(fā)酵罐初始溫度28℃，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)200rpm，通風(fēng)比1L/min條件下培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)提高至1200rpm，通風(fēng)為1-5L/min，發(fā)酵20-26h后開(kāi)始采取Do-stat方式補(bǔ)料。發(fā)酵65-75h結(jié)束。

發(fā)酵過(guò)程用NaOH控制pH4.0，發(fā)酵至65h，取樣測(cè)定發(fā)酵液中蝦青素含量達(dá)到183.3mg/L，純度為83.7％。

發(fā)酵過(guò)程用NaOH控制pH5.0，發(fā)酵至65h，取樣測(cè)定發(fā)酵液中蝦青素含量達(dá)到最高為164.8mg/L，純度為83.3％。

發(fā)酵過(guò)程用NaOH控制pH6.0，發(fā)酵至65h，取樣測(cè)定發(fā)酵液中蝦青素含量達(dá)到最高為89.9mg/L，純度為73.4％。

實(shí)施例6 3L發(fā)酵罐分階段控制pH生產(chǎn)蝦青素

⑴取甘油管保存菌株，接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30℃，200rpm搖床培養(yǎng)20～30h。種子培養(yǎng)基配方和實(shí)施例1相同。

⑵將培養(yǎng)好的種子液接種于3L發(fā)酵罐，開(kāi)始發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基配方和實(shí)施例2相同，3L發(fā)酵罐初始裝液量1.5L，121℃滅菌20min，其中維生素混合液以過(guò)濾除菌方式加入。

⑶3L發(fā)酵罐初始溫度28℃，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)200rpm，通風(fēng)比1L/min條件下培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)提高至1200rpm，通風(fēng)為1-5L/min，發(fā)酵20-26h后開(kāi)始采取Do-stat方式補(bǔ)料。發(fā)酵75-80h結(jié)束。

⑷發(fā)酵初期用NaOH控制pH4.0，進(jìn)入補(bǔ)料時(shí)期，改用NH₃H₂O控制pH4.0。發(fā)酵結(jié)束后，取樣測(cè)定發(fā)酵液中蝦青素含量為450mg/L，純度為78％。

實(shí)施例73L發(fā)酵罐不同傳代數(shù)條件下生產(chǎn)蝦青素

⑴取甘油管保存菌株，接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30℃，200rpm搖床培養(yǎng)20～30h。種子培養(yǎng)基配方和實(shí)施例1相同。

⑵將培養(yǎng)好的種子液接種于3L發(fā)酵罐，開(kāi)始發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基配方和實(shí)施例2相同，3L發(fā)酵罐初始裝液量1.5L，121℃滅菌20min，其中維生素混合液以過(guò)濾除菌方式加入。

⑶3L發(fā)酵罐初始溫度28℃，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)200rpm，通風(fēng)比1L/min條件下培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)提高至1200rpm，通風(fēng)為1-5L/min，用NaOH控制pH4.0，發(fā)酵20-26h后開(kāi)始采取Do-stat方式補(bǔ)料。發(fā)酵75-80h結(jié)束。

⑷一代種子，發(fā)酵結(jié)束后，取樣測(cè)定發(fā)酵液中蝦青素含量為330mg/L，純度為85.3％。

⑸五代種子，發(fā)酵結(jié)束后，取樣測(cè)定發(fā)酵液中蝦青素含量為320mg/L，純度為82.6％。

實(shí)施例8發(fā)酵液中蝦青素的提取和HPLC檢測(cè)

取發(fā)酵液20μL-200μL，12000r/min，離心5min去除上清，加入0.5mL甲醇和0.5mL氯仿，漩渦震蕩10mins，離心10mins，取上清，有機(jī)濾膜過(guò)濾，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。