本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種啟動子文庫及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

啟動子是調(diào)控基因表達(dá)的重要元件，基因組上多數(shù)基因都在轉(zhuǎn)錄因子、啟動子和RNA聚合酶共同作用下轉(zhuǎn)錄生成mRNA，tRNA，rRNA或非編碼RNA，發(fā)揮生命活動必需的功能。作為重要的遺傳資源，已經(jīng)有很多的組成型或者誘導(dǎo)型啟動子被表征確認(rèn)，通過篩選廣泛應(yīng)用于基因工程上，如大腸桿菌Lac、Trp、Tac和T7啟動子，釀酒酵母TDH3、TEF1和GAL1啟動子，畢赤酵母AOX和GAP啟動子等。基于對生命活動中基因調(diào)控理解的需求，代謝工程中途徑構(gòu)建的需求，和合成生物技術(shù)中對各種標(biāo)準(zhǔn)化啟動子元件的需求，更多不同種類的啟動子需要被表征和篩選，從中挖掘具有研究意義和應(yīng)用潛力的啟動子。對于啟動子常用的表征方法包括基于熒光蛋白報告系統(tǒng)(如GFP、YFP)熒光強(qiáng)度，熒光素酶報告系統(tǒng)熒光強(qiáng)度，β-半乳糖苷酶LacZ酶活，β-葡聚糖苷酶GUS酶活等。

為了滿足對啟動子不同強(qiáng)度、不同功能多樣性的需求，啟動子文庫應(yīng)運(yùn)而生，顧名思義就是很多不同啟動子的集合。構(gòu)建一個人工啟動子文庫方法主要有非保守序列隨機(jī)化、易錯PCR、雜合啟動子工程、理性設(shè)計轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點等，這些人工啟動子的設(shè)計不同程度上來源于對天然啟動子的研究和分析，因此對于天然啟動子表征篩選挖掘是強(qiáng)度功能多樣化啟動子文庫構(gòu)建的基礎(chǔ)。

新型的啟動子也最可能從對天然啟動子的研究中發(fā)現(xiàn)，而傳統(tǒng)上，對于天然啟動子的表征規(guī)模數(shù)量上常局限于單個或幾個啟動子，沒有一套在基因組尺度或染色體尺度進(jìn)行系統(tǒng)表征的方法。當(dāng)前，基因組學(xué)的發(fā)展已為我們提供了海量的基因組信息，作為模式生物釀酒酵母的全基因組序列也早于1996年即公布，隨后長期以來對于基因功能注釋的不斷完善，都為啟動子的批量系統(tǒng)表征和挖掘提供了重要參考。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對天然啟動子多樣化的需求，及個別啟動子鑒定表征的不足，首次提供了一種系統(tǒng)構(gòu)建天然啟動子文庫并對其表征的方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種啟動子文庫的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

截取啟動子區(qū)域；

分析酶切位點，設(shè)計引物；

擴(kuò)增獲得啟動子片段；

取所述啟動子片段與表達(dá)載體構(gòu)建重組載體；

取所述重組載體轉(zhuǎn)化宿主并篩選；

獲得目標(biāo)啟動子。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述截取啟動子區(qū)域具體為：

對于同向相鄰兩蛋白編碼基因間隔區(qū)小于800bp～1200bp的DNA序列，取其間隔序列作為啟動子區(qū)；

對于間隔區(qū)長度不小于1200bp的，取5’上游1200bp作為啟動子區(qū)。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述分析酶切位點為分析是否含有IIs型限制性核酸內(nèi)切酶位點。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述IIs型限制性核酸內(nèi)切酶為BsaI或BsmBI。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述設(shè)計引物具體為：

對于不含BsaI酶切位點的啟動子序列，依據(jù)其序列截取5’和3’各20bp左右，設(shè)計含BsaI酶切位點引物；

對于含有BsaI酶切位點的啟動子序列，不含有BsmBI酶切位點的DNA序列，依據(jù)其序列截取5’和3’各20bp左右，設(shè)計含BsmBI酶切位點引物；

對于既含有BsaI和BsmBI酶切位點的啟動子序列，采用CPEC方式構(gòu)建表征載體，依據(jù)其序列截取5’和3’各20bp左右并引入表達(dá)載體的同源片段作為引物。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述啟動子區(qū)域來源于釀酒酵母S288c V號染色體DNA序列。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，構(gòu)建重組載體具體為：取所述啟動子片段插入表達(dá)載體報告基因的上游，基于IIs型限制性核酸內(nèi)切酶和環(huán)裝聚合酶延伸法組連接組裝，構(gòu)建重組載體。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述引物的序列如SEQ ID No.7～10、SEQ ID No.12～13、SEQ ID No.15～16中任一所示。

本發(fā)明還提供了所述的構(gòu)建方法獲得的啟動子文庫。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述啟動子文庫包括啟動子序列，所述啟動子序列如SEQ ID No.1～6、SEQ ID No.11、SEQ ID No.14、SEQ ID No.19～39所示。

本發(fā)明還提供了所述的啟動子文庫在獲得不同強(qiáng)度類型啟動子中的應(yīng)用。

本方法基于釀酒酵母V號染色體批量獲取天然啟動子，實現(xiàn)全染色體尺度的啟動子定量表征及挖掘，篩選得到不同強(qiáng)度的啟動子，形成的啟動子文庫也可應(yīng)用于響應(yīng)其他條件啟動子的篩選上。本發(fā)明通過高效規(guī)范的流程方法，可以最大限度地篩選挖掘基因組上啟動子，滿足基因調(diào)控研究和工程菌株構(gòu)建上的需要。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示本發(fā)明使用的天然啟動子文庫構(gòu)建及表征過程示意圖；

圖2示本發(fā)明測定的V號染色體啟動子強(qiáng)度譜；

圖3示本發(fā)明挖掘得到的釀酒酵母V號染色體組成型強(qiáng)啟動子。

具體實施方式

本發(fā)明公開了一種啟動子文庫及其構(gòu)建方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明的技術(shù)目的通過下述方案予以實現(xiàn)：

一種系統(tǒng)構(gòu)建啟動子文庫及其表征的方法，按照下述步驟進(jìn)行：

步驟1，啟動子區(qū)域的截取，參考序列為釀酒酵母S288c V號染色體，序列信息參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_001137.3，截取同向相鄰兩個蛋白編碼基因間序列或每個蛋白編碼基因前1200bp作為啟動子區(qū)進(jìn)行表征。

步驟2，對截取的每個啟動子區(qū)進(jìn)行酶切位點分析，確定是否含有IIs型限制性核酸內(nèi)切酶BsaI或BsmBI，針對不同類型的序列進(jìn)行引物設(shè)計。

步驟3，設(shè)計好的引物，交由金唯智公司合成，以釀酒酵母BY4741基因組為模板PCR擴(kuò)增得到對應(yīng)目標(biāo)啟動子片段。

步驟4，將步驟3中含BsaI或BsmBI酶切位點啟動子片段，與表達(dá)載體pRS415K-GFP通過酶切連接方式，得到重組載體；將步驟3中含上下游同源序列片段，與表達(dá)載體pRS415K-GFP通過環(huán)形聚合酶延伸法(CPEC)，構(gòu)建得到重組載體。

步驟5，將步驟4得到的啟動子重組表征載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法見大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞說明書，并涂布卡那霉素抗性固體LB培養(yǎng)基平板篩選。

步驟6，對于平板上長出的單菌落進(jìn)行菌落PCR長度驗證，通用PCR引物序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18。

步驟7，菌落PCR驗證正確的單菌落，于卡那霉素抗性LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，保存并提取質(zhì)粒，質(zhì)粒送北京金唯智公司測序驗證，測序引物序列如SEQ ID No.18。

步驟8，對于測序驗證正確的重組啟動子表征載體，采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化釀酒酵母BY4741感受態(tài)細(xì)胞，并涂布亮氨酸缺陷型的SC培養(yǎng)基(SC-Leu培養(yǎng)基)平板篩選。

步驟9，30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天左右后，挑取3個酵母單克隆，接于1mL SC-Leu液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，25％甘油保存。

步驟10，將步驟9中保存的各5μL重組釀酒酵母種子，接于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔，其中各孔含SC-Leu培養(yǎng)基200μL，密封的細(xì)胞培養(yǎng)板于微孔板振蕩器30℃、900rpm條件下過夜培養(yǎng)。

步驟11，將步驟10中過夜培養(yǎng)的重組菌株轉(zhuǎn)接于200μL的SC-Leu培養(yǎng)基，于微孔板振蕩器30℃、900rpm條件下培養(yǎng)12h。細(xì)胞培養(yǎng)板置于平板離心機(jī)于4000rpm離心2min，吸除上清，每孔菌體用200μL蒸餾水重懸，震蕩混勻后，于Microplate reader測定OD₆₀₀和綠色熒光強(qiáng)度。

本發(fā)明設(shè)計的天然啟動子文庫的系統(tǒng)構(gòu)建及表征方法，示意圖如圖1所示，詳細(xì)的構(gòu)建及表征過程包括：啟動子區(qū)域的截取，酶切位點的分析，系統(tǒng)地設(shè)計不同類型引物，PCR得到啟動子片段，構(gòu)建表征載體及驗證，轉(zhuǎn)化酵母并篩選，熒光表征及挖掘目標(biāo)啟動子。本方法基于釀酒酵母V號染色體批量獲取天然啟動子，實現(xiàn)全染色體尺度的啟動子定量表征及挖掘，篩選得到不同強(qiáng)度的啟動子，形成的啟動子文庫也可應(yīng)用于響應(yīng)其他條件啟動子的篩選上。本發(fā)明通過高效規(guī)范的流程方法，可以最大限度地篩選挖掘基因組上啟動子，滿足基因調(diào)控研究和工程菌株構(gòu)建上的需要。

本發(fā)明以釀酒酵母V號染色體為參考序列，批量設(shè)計引物PCR擴(kuò)增啟動子片段，基于IIS型限制性核酸內(nèi)切酶及環(huán)形聚合酶延伸法進(jìn)行連接組裝，構(gòu)建表征載體，轉(zhuǎn)化釀酒酵母形成基本包含全染色體啟動子的啟動子文庫，培養(yǎng)重組菌株以綠色熒光強(qiáng)度表征啟動子調(diào)控狀態(tài)。本發(fā)明通過聯(lián)合多種組裝策略實現(xiàn)重組表征載體的無痕構(gòu)建，并對染色體尺度上啟動子整體表征，可以快速系統(tǒng)地篩選得到實驗條件下各種不同強(qiáng)度的啟動子，此方法有利于啟動子的研究、挖掘及應(yīng)用。

本發(fā)明提供的啟動子文庫及其構(gòu)建方法中所用原料及試劑均可由市場購得。

下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實施例1系統(tǒng)地設(shè)計三種不同類型引物

優(yōu)選釀酒酵母S288c V號染色體DNA序列,參考序列見http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_001137.3，V號染色體上共注釋有279個蛋白編碼基因，自染色體左臂至右臂按順序依次編號1-279。

對于同向相鄰兩蛋白編碼基因間隔區(qū)小于1200bp的,取其間隔序列作為啟動子區(qū)，以前綴“VP”+編號命名，如1、2和3號啟動子分別命名VP1、VP2和VP3，序列分別見SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。

對于間隔區(qū)長度不小于1200bp的，取5’上游1200bp作為啟動子區(qū)，以前綴“VP”+編號命名，如4、5和6號啟動子分別命名VP4、VP5和VP6，序列分別見SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6.

對于各個啟動子片段,查找是否含BsaI酶切位點(GGTCTC或GAGACC)，若無BsaI酶切位點，依據(jù)其序列截取5’和3’各20bp左右，設(shè)計含BsaI酶切位點引物，并命名為啟動子-F和啟動子-R，如啟動子VP1引物VP1F和VP1R分別見SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；啟動子VP4引物VP4F和VP4R分別見SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。

對于含有BsaI酶切位點的啟動子序列，查找其是否含有BsmBI酶切位點(CGTCTC或GAGACG)，若無BsmBI酶切位點，依據(jù)其序列截取5’和3’各20bp左右，設(shè)計含BsmBI酶切位點引物，并命名為啟動子-F和啟動子-R，如啟動子VP11的引物VP11F和VP11R，VP11、VP11F和VP11R序列分別見SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.13。

對于既含有BsaI和BsmBI酶切位點的啟動子序列，采用CPEC方式構(gòu)建表征載體，依據(jù)其序列截取5’和3’各20bp左右并引入表達(dá)載體的同源片段作為引物，并命名為啟動子-F和啟動子-R，如啟動子VP59的引物VP59F和VP59R，VP59、VP59F和VP59R序列分別見SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16。

實施例2啟動子片段的獲取

100μL釀酒酵母BY4741甘油菌接種于5ml YPD培養(yǎng)基，30℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，10,000rpm離心1min收集菌體(約30～50μl)。加入和細(xì)胞體積相當(dāng)?shù)氖⑸埃瑢⒓?xì)胞重懸于400μl STES溶液中，再加入400μl酚/氯仿/異戊醇。劇烈振蕩40min。加入400μl TE，混合，10,000rpm離心10min。將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，加入1/10體積3.0M NaAc，2倍體積無水乙醇，混勻，置于-20℃大約1h，10,000rpm離心10min，棄上清。加入500μl 75％的乙醇洗滌，10,000rpm離心5min，棄上清。干燥得到釀酒酵母基因組DNA，加入30μl TE或水(含Rnase，終濃度為20μl/ml)，55℃消化30min。電泳檢測，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

釀酒酵母基因組提取中試劑配方如下：

YPD(per L):20g葡萄糖，20g蛋白胨，10g酵母氮源。

50×TAE緩沖液成分(每L):242g Tris堿，57.1ml冰醋酸，100ml 0.5M EDTA(pH 8.0)。

0.5M EDTA：稱取186.1g的Na₂EDTA·2H₂O加入800ml水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，加入NaOH，調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0，約20g。定容至1L，高壓滅菌。

TE緩沖液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，加NaOH調(diào)整到適當(dāng)pH。

STES：0.2M Tris·Cl(pH7.6),0.5M NaCl,0.1％(m/V)SDS,0.01M EDTA(pH8.0)。

3M乙酸鈉：溶解40.8g的三水乙酸鈉于約90ml水中，用冰乙酸調(diào)溶液的pH至5.2，再加水定容到100ml。

以基因組為模板PCR擴(kuò)增啟動子片段,反應(yīng)體系為50μl×3，50μl PCR體系為：基因組1μL、10μM上引物2.5μL、10μM下引物2.5μL、Q5高保真DNA聚合酶0.5μL、超純水32.5μL、5×Q5反應(yīng)緩沖液10μL、10mM dNTP 1μL。

PCR程序為：(1)98℃,30sec；(2)30cycles:98℃,10sec；55℃,30sec；72℃,30sec/kb；(3)72℃,2min；(4)4℃,+∞。

PCR得到的啟動子片段采用天根公司普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，純化步驟詳見其說明書。

實施例3表征載體的構(gòu)建及驗證

質(zhì)粒pRS415K-GFP提取采用天根公司的質(zhì)粒小提試劑盒，步驟詳見其說明書。

對于質(zhì)粒pRS415K-GFP和含BsaI酶切位點啟動子片段，37℃酶切1小時，50μL酶切體系為：1μg質(zhì)?；騿幼悠?，1μl NEB BsaI限制性核酸內(nèi)切酶，5μl 10×緩沖液，超純水補(bǔ)足50μL。

對于含BsmBI酶切位點啟動子片段，55℃酶切1小時，50μl酶切體系為：1μg質(zhì)粒或啟動子片段，1μl NEB BsmBI限制性核酸內(nèi)切酶，5μl 10×緩沖液，超純水補(bǔ)足50μL。酶切后的片段采用天根公司普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。

酶切后載體片段與啟動子片段連接體系:載體片段60ng，啟動子片段與載體片段摩爾比3:1，10×T4DNA連接酶緩沖液2μL,T4DNA連接酶1unit，超純水補(bǔ)齊20μL；連接條件為22℃,45min。連接產(chǎn)物隨后轉(zhuǎn)化全式金DH5α感受態(tài)細(xì)胞，步驟詳見其說明書。

CPEC體系：線性載體片段約200ng，啟動子片段與載體片段等摩爾，10mM dNTP 0.5μL，Q5高保真DNA聚合酶0.3μL、5×Q5反應(yīng)緩沖液4μL，超純水補(bǔ)齊20μL。

CPEC程序:(1)98℃,3min；(2)15cycles:98℃,30sec；55℃,30sec；72℃,4min；(3)72℃,5min；(4)4℃,+∞。

CPEC連接產(chǎn)物隨后轉(zhuǎn)化全式金DH5α感受態(tài)細(xì)胞，步驟詳見其說明書。

轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布卡那霉素抗性LB平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗證。

菌落PCR體系:菌液3μL,TransFast taq DNA聚合酶0.2μL,10μM通用上引物0.5μL,10μM通用下引物0.5μL，10mM dNTP 0.5μL，10×TransFast Taq緩沖液2μL，超純水13.3μL。菌落PCR程序：(1)94℃,3min；(2)30cycles:94℃,5sec；55℃,15sec；72℃,10sec/kb；(3)72℃,10min；(4)4℃,+∞。

通用引物序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示。

對于與設(shè)計插入片段大小比對正確的構(gòu)建菌株，接菌于3mL卡那霉素抗性LB培養(yǎng)基，37℃、220rpm過夜培養(yǎng)，15％甘油保存，提質(zhì)粒詳見天根質(zhì)粒小提試劑盒說明書，質(zhì)粒送金唯智公司測序驗證。

實施例4表征載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母并篩選

挑釀酒酵母BY4741單菌落，30℃250rpm過夜培養(yǎng)。接種過夜培養(yǎng)液到50ml YPD中，置30℃、250rpm培養(yǎng)，至OD600達(dá)到0.5。5000rpm離心2min，收集細(xì)胞。用25ml無菌水重懸并清洗細(xì)胞，5000rpm離心2min，收集細(xì)胞。用10ml 0.1M LiOAc重懸細(xì)胞，5000rpm離心2min，收集細(xì)胞。將上清倒出，用0.1M LiOAc重懸細(xì)胞，并分裝100μL/管轉(zhuǎn)移到1.5ml滅菌EP管內(nèi)，置于冰上。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化體系：50％PEG3350480μL，1M LiOAc 72μL，ssDNA 40μl，質(zhì)粒DNA 28μl。將轉(zhuǎn)化體系依次加入100μl感受態(tài)細(xì)胞中，渦旋混勻。30℃培養(yǎng)箱中孵育30min。42℃水浴熱激20min。3600rpm離心30sec，吸出上清，200ul無菌水重懸后涂于Sc-Leu平板。平板置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2天左右后，挑取3個酵母單克隆，接于1mL SC-Leu液體培養(yǎng)基30℃、250rpm過夜培養(yǎng)，25％甘油保存。

酵母轉(zhuǎn)化中個試劑配方如下：

1M LiOAC：51g無水醋酸鋰溶于400ml蒸餾水中，調(diào)pH至7.5，定容至500ml，高壓滅菌。

0.1M LiOAC：由1M LiOAC稀釋得到。

50％PEG：250g PEG溶于400ml蒸餾水中(PEG難溶，可在50℃水浴中溶解)，定容至500mL，過濾除菌，常溫保存。

10mg/ml ssDNA：稱取100mg ssDNA置于小燒杯中，加入10ml無菌水，冰上攪拌至完全溶解(清澈粘稠狀液體，ssDNA難溶，可用干凈剪刀剪碎后溶解)。1ml/支分裝至無菌EP管中，-20℃凍存。

Sc-Leu培養(yǎng)基成分(每L)：20g葡萄糖，6.7g酵母氮源，2.0g氨基酸粉末(除去四種營養(yǎng)素組氨酸、尿嘧啶、色氨酸和賴氨酸)，另外三種100×母液(尿嘧啶、色氨酸和組氨酸均為2g/L)各10mL，定容后調(diào)節(jié)pH(液體為6；固體為6.5)用NaOH溶液調(diào)節(jié)，固體培養(yǎng)基添加2％的瓊脂糖。

實施例5熒光表征及挖掘目標(biāo)啟動子

取保存的各5μL重組釀酒酵母種子，接于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔，其中各孔含SC-Leu培養(yǎng)基200μL，密封的細(xì)胞培養(yǎng)板于微孔板振蕩器30℃、900rpm條件下過夜培養(yǎng)。

過夜培養(yǎng)的重組菌株轉(zhuǎn)接于200μL的SC-Leu培養(yǎng)基，于微孔板振蕩器30℃、900rpm條件下培養(yǎng)12h。細(xì)胞培養(yǎng)板置于平板離心機(jī)于4000rpm離心2min，吸除上清，每孔菌體用200μL蒸餾水重懸，震蕩混勻后，于Microplate reader測定OD₆₀₀和綠色熒光強(qiáng)度，收集數(shù)據(jù)，繪制測定的V號染色體啟動子強(qiáng)度譜如圖2所示。挖掘得到的釀酒酵母V號染色體組成型強(qiáng)啟動子及相關(guān)信息如圖3所示。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津大學(xué)

<120> 啟動子文庫及其構(gòu)建方法

<130> MP1619561

<160> 39

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agacgcttga cggactcact tcagattacg tgttttattt tgtcactgtg ctaaggcaaa 60

tgcaaatatg tgcgcttggt aacagtt 87

<210> 2

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaaggattac gatacccttt ctctttttta cctcaacaga ggatactata atgagttgag 60

tttccgtgtc ctggaacgtt gtcacgaaat agcgagtgct aggccgaacg acagctctac 120

gatgcgtact ttcactgact ttgtttccgg cgcacctatt gtaaggagtc ttcagaaaag 180

caccataagg aaatatgggt acaatttggc agcctacacg tagatgagct 230

<210> 3

<211> 230

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaaggattac gatacccttt ctctttttta cctcaacaga ggatactata atgagttgag 60

tttccgtgtc ctggaacgtt gtcacgaaat agcgagtgct aggccgaacg acagctctac 120

gatgcgtact ttcactgact ttgtttccgg cgcacctatt gtaaggagtc ttcagaaaag 180

caccataagg aaatatgggt acaatttggc agcctacacg tagatgagct 230

<210> 4

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctttatggtc gtactcggag taagaatatt ttgtgagtga gctggtaaga tgaggatatt 60

gtagaatagc atttgcactt atgtgtattc ctggtatgat atataacatt tgtgcagctt 120

catagaggta cggtggtgct aagatcatgc atgacctctg ggtaattacc acttctcccg 180

cttgttttga gattctgtat ataaatattg caaacaaaag gatagagcac ggatgggagg 240

ccttatagta aaattattcg ttttaatcat gcgtcagtgt gagattctat gacaatggta 300

tgcgaagata gggtgaagta aaagtatttg tatgactata gagtgcattt atattacaat 360

atattgaata gagtatagag gtatgacgat attaaggaac ttttaagtta atgacgccat 420

ggtagtattc atacttcaag tcaaagtgtt tatttcgtga agttgaaagg tagaatattt 480

ttatgtttag gtgattttga tggtgatttt tctgtagtat tgacataagt gtatacaagt 540

gaaggtgagc atggtgtgtg ggtgtgggtg tgggtgaagt aacttgatac gtcgttggtg 600

aatgggtctg ctttcttatt cggcggggta atacattttg ggagaagttt gtctttctga 660

cgcgccatat gtaggtacgc caaaaagggc tcctttactt cgaagcgcga ggtcgtatac 720

ctaataagga aatgtaattt ataacttttt attatattgg tcttttcgag agcggaacgt 780

aggtccatgt ttaaagtatc caacagaata tccacgaagc ggctgagcaa cgaacagaat 840

cctggttctc ctcgactaag cagatagtta agatactgtg caccatggaa attgaaaacg 900

aacgtacgta ccgactactt tatttttgca ggccggaaat caagcgatga atgagacatc 960

cttctgtttt ctatgttgtg cttgaagggg acagacagtc gcttatctta gtgagatttt 1020

gtttgctttt gctgcacctg catagcgcag attctgcatc ttctcaatag cttaattatt 1080

acattcttag atgatgataa gacggaaact ggacaatctt ttgtttatat tgatggattt 1140

cttgtcaaaa agcataacaa tcaacatact attgttaatt tcgaaactta caaaaataaa 1200

<210> 5

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cacatatatt gagggaaatc aggccattat agtgtggcct atggtgagtt agacattatt 60

taaaaattgt tagtgcttgt gctcactgtg agcattgccc tgaaacgttt atagcagact 120

gtgacttgtt atgcaatgga tgctggtggc ttttttaaaa tggttgcgtt tggtaggcta 180

gttgcttcac ttccatcccg aataagcatt ttttagccat atcaaaatta aacttgaaga 240

gatatttgct gtatacttta tgtcacatta tttggtttag gagtagatat ttctcgtact 300

tataactatt attaattttt tccagtgtat tgcatcgcgc cagttataaa ctattaatgg 360

aaaggatgca ttaatttaag tagagaatct tgaattattt tctttttaac tcttcctgcc 420

gtaaatttaa ggaatacact acgaacaata tttctctaat ttccttccat atataaatga 480

gaggtttttg aaacaattct catgctttct tatacagtta aaaagatact tattgttcag 540

acatgttaat acataaatga tatcagtaga gcttttaaag tcatattact cagtggtatc 600

tgaaagaggt acatgaaaga caagaaggat cttctataaa aaaataattt tggtgtctgg 660

ttcttactaa gttacacgga tgtatagaat agatagatat ataattcgaa tggtcaatcc 720

agtgtatata ttatgcatcc ttcgatcaat attgacactg tattataaaa tataaattga 780

tttttcattc ttctagcctc catatggcat tttacatgac tggggtttac agtacgaagg 840

caacaggaga ataagagaaa aaaaactcca taatgaagag tcggtggctt tgctatcaaa 900

aattttatgc aacatattta caacttcctg taaatttcgt gacagtataa atactatcct 960

aacggcttcc aacccaagtc attatttttc acgccgcata tgattatacc cctcgaaatc 1020

aataatcatc ttcctcgcta cagtaatatt aatgaacgac ttaaaatgca taatctccta 1080

aacggtcgag catgtgaaat ttacaagggc tgatttttat tccaaagcgt ataaatggta 1140

gcgagatggt gcttctgtaa agttatctat taacgaaata acagatcatc tactaacacg 1200

<210> 6

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ataatatact gacctccgaa gctaggtgag agaaagcaaa ggttttgagg gctattttca 60

ccattggaac taagatcgta cacactaatt aactctctgc cggaggcgcg cgatatatgg 120

gctggagcgg tcctgactaa agtcctgctg gaatattggt gaagtgtctc aaaaaactag 180

taaggtcaat atcagggaag gaactattat tggccgaggc ggcagctagg ttaaagaatc 240

tagccgtcaa tgcaacgaag gttatcaagt acattcagtt ggatacatta aaaaagttga 300

atacaatatc aattctagaa gattgtagca agtttggtga gatagtttac gcctataata 360

tataagtgct aactcaatgt tcagttagta gaatcacagc ctgaatattc tgtgcatcgt 420

ttactcaggg acagatgcga tctcaatgca gggacgaaaa acagtcttat atgcgcacgc 480

cagcaaaatc tttttttgcg gcacctaaga tctctcgcat gataaaagca taatatcttt 540

gccccacaaa gtcaaggcgt attggaaaag ctactttagt taataatgaa atgatcgccc 600

atccgggtaa aaatggttac aattccagtg ttgattattg ttcgtttttc agagagaata 660

atttagatgc tcctattgaa gaatatcttg ttagcgcata gggcaatcat ctacgacttt 720

aaccgcaact gcgtctgtta ccgacattgg aggattgtat gctcaaatga cccctgtggt 780

gaagatgaac acttcttgca cactatggtt gaatcttgac ggtaccctca ctcagagttt 840

tatagtatca cacgacgcta ctctcccgct tgtacattca ttctggctag tttataataa 900

cgttaaggaa atgacaccca tacctctcag aaatccaatt ggaaataata tttgtaaaag 960

cacgtgatat tgcctttttc ttttatctgg ttaccaatat gggatcaata actttacttt 1020

tgaagatctt gtttttcctt cagataagaa atcaaaaaaa gaatatatgc acaaaacagt 1080

atggatataa tacaccttac tcttggtcgt gattgaaaac gtaaggttct acataaatta 1140

ttgagaaaga cttatttgaa gatatcgaga gtctatcatg ccctttgcac aacaaaacta 1200

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggtctcccgt tagacgcttg acggactcac tt 32

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggtctccaca taactgttac caagcgcaca t 31

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggtctcccgt tctttatggt cgtactcgga gta 33

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggtctccaca ttttattttt gtaagtttcg aa 32

<210> 11

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

agcgagtgct gggagtacga cgaagtcgcg tacgcctgga aagtgtaacg gatattacca 60

tctaatccgt aagcataggc aatgaggaaa agtgagaaga ataatgcgac acggtagatc 120

gggcggttgt acatttctgc gtaaatctcg atgttatgca cacctggatc tatcaattca 180

atgtaagaag gtgctggaga agatgtggtt agcgttggct tgacatcgac cttggctcct 240

acttcctttt ccagcatctc gggaacgaca acctcttcaa attcctcggg gagggtatga 300

ttagcaatac cagggtccat tatggaaaaa ttttcgtact gggtctttaa cagttctttt 360

acaaagcact acgatgttct agcctcatcg gtgatggacg gtgtccattg cttatatagt 420

atctgcaaat catcgcatca caaaagtaaa ttaaaggatc acggatgagc actactaatt 480

atggcaaaag acgaaccaga ttgcaccctc aaatgtgttc tttacggcac attgtaaacg 540

atgaacttcg gggtcttccc agcagataag tttcttaaaa tgcacctgga ttaagctgca 600

agtcattctg tgcctgcgcc gtacggcgct tgcgattaaa tcggagaaca aactatgaaa 660

agccaataag aaactatttc actgggaaaa agtgggaaaa aagcttcgca agtgagccta 720

tagaagctag agttatctct atacacagta gtctacatta cacagcggtt tcagtatccg 780

tttctcttgt aaagaacctt atctgtcttg taagccactt tggtgtacag caactgtgcg 840

cggtgattgt aatggtctgt aacccagtac actgcaggcg taccgagctc atcggcacgg 900

ctgtatacaa attctatgag ctttctacct acgcctttga ctcttgcgcg ttcagtgaca 960

tataagtcat tcatgtagac aacttcttcg acatgccacg acgtcaaatg gttcaggtag 1020

tgtgcaaagc caattgcatc gccggtctcg gtgtcaaagg ctagagcacc ccatagtttg 1080

accgtagggt ctataaacct tgcgaaggta gtggtggcta cttccggagg cataaccgtt 1140

ttttggaaac cctgatactc cttccacagt ttgttccagg cttcctcatc ttttggctcg 1200

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgtctcccgt tagcgagtgc tgggagtacg ac 32

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgtctccaca tcgagccaaa agatgaggaa gcc 33

<210> 14

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcgaagtgtt gggtagcggt cgtggtcata ttgatggatg gttgtgacgg tttgaatgta 60

gagagtatat tcttcttatc acataaaagt aaccaatgcc ttttttttcc tttatatata 120

atgtggttat ataccaacct tttgtaaatt tccaactttt ttctttagtt agctttgctt 180

gaacttcggg ccgaagggct cggataagag aaacaataat tttgttttca taaaacatcg 240

atggcttgac tacttctttt atcctgttcc tgagattctt tcatcttggc gatcttacac 300

cttagttcca taatagggtc tcttacaaaa tccctcattg aaacgacttg agaacacgct 360

gcttgcgggc aatctcttgt cgtgtatcct tgtaaatagt tttgaatgcc gtctctatcg 420

aagacgtgat tacattttct tgatatcaat ggtgcttcgt aaggtttgca ggtgatagga 480

caagtcaatt caattttacc accttctatt tgtagatcgt cttcgtctgc ggggttttgc 540

agatccggta ttacacaagt tggatcattc catatgtacg gcaacacttt tagtatcttg 600

agtgtatctg tgttattaac catggttgca ggctctggtg tgggcatatt tagatataat 660

tcagataatt tgggagcggt gagttctccg gtacgatatt tatcccaggt agaaaggtcg 720

atttgcggac aggcatctga ggattgtttg aaattttttt ttaaatcttt aatatgttcg 780

tcaaatgagt tggattccga ttcgtatgtc gagaggagtt tgtaggtgct agtaatatct 840

gcgacctgct cttcaatgcc gatggtggaa ggagatgtag aatccactaa ttgatttatg 900

gtctcatcaa tttgtttgta gcattgttga tatatatttg ataagtctcg ggcatgtaaa 960

ttatggaagt acttacctga ttttgggtgt agaggaactg acttgggtat aggattatcg 1020

ttcaaggcca tttttaaagt tattcttttt ttatatagtc ttgccttggt ttctttaact 1080

gacacgatta ttttagcaag tttttttcta cacaggaaaa gaggaagaaa ataaccagag 1140

aagcactggt aaaaagatac ttctgcgtgc cggagtaacc agaatcaaag gaacgcatag 1200

<210> 15

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agtttaataa ctcgaaaatt ctgcgttcgt tgcgaagtgt tgggtagcgg tc 52

<210> 16

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

caccagtgaa taattcttca cctttagaca tctatgcgtt cctttgattc tg 52

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tcgctcctct tttaatgcc 19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gcatcacctt caccttcacc 20

<210> 19

<211> 1153

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gagcaaaaaa gggccgcatg tataaatgta tatagtcaca atattccata gacccaggca 60

cttccctaca ccacagcata caaaaccgtt atggtgtgtg cgtatcatta tataataatg 120

gggtttcctt gtacagagta taagcatcca ttagctcctc gggaacctca atatcttcat 180

cgtcctccaa cttttctgta atcagtgata tctgatcatt gtaccacttc aattcgggta 240

ctttctctac tgttgcttga gatattaagc gtgggagttc cgtttcagca gaaccagtat 300

ctgcatcatc aatactgttc agtaccgtta tcacgctcga tacttttctc aataatgtag 360

tgtattccct ttttagagtc ccatcctgtt tgataagctc atcatttctt gctgatatct 420

tccgtatttc tttgtctata acgctctctg gatctttact aggcattttt ttcttgtttt 480

ataatcagtc aagtattggt ttcccacagc cattcaactc aggttcatca tctttttcgc 540

ttccaaaaat gcagttgatt tcacacaatt tttcatgaac cagggtcccg cactccgggt 600

aaaggaccat cacgccacat cacgtgcaca ttactagtaa aagccacagg aaatatttca 660

cgtgacttac aaacagagtc gtacgtcagg accggagtca ggtgaaaaaa tgtgggccgg 720

taaagggaaa aaaccagaaa cgggactact atcgaactcg tttagtcgcg aacgtgcaaa 780

aggccaatat ttttcgctag agtcatcgca gtcatggcag ctctttcgct ctatctcccg 840

gtcgcaaaac tgtggtagtc atagctcgtt ctgctcaatt gagaactgtg aatgtgaata 900

tggaacaaat gcgatagatg cactaattta agggaagcta gctagttttc ccaactgcga 960

aagaaaaaaa ggaaagaaaa aaaaattcta tataagtgat agatatttcc atctttacta 1020

gcattagttt ctcttttacg tattcaatat ttttgttaaa ctcttccttt atcataaaaa 1080

agcaagcatc taagagcatt gacaacactc taagaaacaa aataccaata taatttcaaa 1140

gtacatatca aaa 1153

<210> 20

<211> 621

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cgatttccca catcctgcgt ttccgtagtc aagggttcat aatggatgat gagcctgtaa 60

acagctttgt atttacctct tttacttcaa gaatgctctt gcgtcgtttg cagtgtcgaa 120

gaagatccag tagagctata caaaatggag aaatgaaaca gttgaaccag agcgccgcat 180

ttggcaggta gtttcgctaa atttcctcat gcgcgtttgt aattatgcta gttaaccata 240

tgataaggtt gcctaacttg cagtcaccgg aaggttattt ccggaatggt gcagaataat 300

ttttaaaata gtagcatata tttcgttcca attcccaaat agggaattat aattatgaca 360

gataaattcc cgattaggaa gaagcgcgaa aattcttgaa aaactttttt caacctcgaa 420

gaaaatcgtc gtccttcgaa gatttagtgg gaatcttcaa ggtggatagt ttccaaatta 480

aaactgcaga agaggctttt aaaacatgcc tgaggtataa aaagaacaac attcctggtg 540

attatggttt ctgttggacc ctgttccctt tgtaaaactt ctatttattg tcctgcaaat 600

aagctaatta tataattaat a 621

<210> 21

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

agatgctaag agatagtgat gatatttcat aaataatgta attctatata tgttaattac 60

cttttttgcg aggcatattt atggtgaagg ataagttttg accatcaaag aaggttaatg 120

tggctgtggt ttcagggtcc ataaagcttt tcaattcatc tttttttttt ttgttctttt 180

ttttgattcc ggtttctttg aaattttttt gattcggtaa tctccgagca gaaggaagaa 240

cgaaggaagg agcacagact tagattggta tatatacgca tatgtggtgt tgaagaaaca 300

tgaaattgcc cagtattctt aacccaactg cacagaacaa aaacctgcag gaaacgaaga 360

taaatc 366

<210> 22

<211> 1201

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gaacttagta aacgcagagg tggacgagtc gttatctgtg ctaaaatcca acaaattgaa 60

gttcgttttg gcgtttgaat ttgcattcct gctggaaagc ggctttgtcg cgcttgtttc 120

atcgcctgat tgcggtttct catcatcatc ctccttgatg tacgctttct ccagatcgga 180

atcatttgtg gcggtgtcac aggatccaga cccagacccg tttccagatc cggatccgta 240

ttcgttccgt tcatcctttg actggtccac tgtcatcgac tcataaaagg accttagttc 300

cgggtagtcg tctttaaaat ccacaggttt ctcaagatga ttcaagtgcg attcgaggta 360

atcgatcata tcactcttct tggcataatt ggggaagccg tcaatttcca gcttgttggc 420

caggtcaatt aggtccgcct tcttccagcg actaaaagtt gacttggtcg gcatattgta 480

ttataatgat ctgtgatggg ctgtaatgca ctttcacttt tgttttctcc ccttgtatat 540

agatattttc gcacgttgtt tacgtattgt gtagttcttt ttgttatgag tgacgaatgc 600

acgcaagtag cgcgcaggaa attatcatca tatacgtata tcatcatata cgatttacca 660

cttttagcac attaacagct cgggaaagag tttcggaact cggaaaaagc acgacaaacg 720

agggcgagcc actaaattac cgcaatccta cgaccacagc agcccgggcc ctctccaaaa 780

ccgcgctcta gcccgctctg cttactccct gtgcagcgcc gcccgcggta gcactggcca 840

acaccctgac gcaactcgtc accacgctgt tgagctgttt tcgaaatccg tccgcagccc 900

tccctagctt ttgcatcaaa aaaaacctct cgctattttt ccggcgcgga tacttaattt 960

ccttaacgaa ttacagaact tttttctctc tttctcttcc acaccttttg gtttaaataa 1020

acagtgaaaa aaactaaaat tccgtaatca caactcaatt tcctttcctt cctcttggtt 1080

aatataaaat caattcttct tcccttccag ttttttctct ttcgtccttc cttcttcctt 1140

tctctttttc tccatcgtat acatacaaaa caataaatag tacaataaca attatacaaa 1200

g 1201

<210> 23

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gtcaacaagg cgttgatccg cttgttttcg tccgagatca actgcctcgc tgatttgtgt 60

cttcttgtcg gtttcttgta atgcgccgac ttgaatctag agggaaagcc aatttcattg 120

cgttcgccca cgcttcttag aaacagcaat ctctcgtcgc ccccgtcatt attattgtta 180

ttattactat tattactgac gctactattg ctgctattgc ccctactacc gctcattgtt 240

tcgactttct cacgctgatg atgatgacaa ttttaacctt cccctaggtc acaacttttt 300

ttccctcgtt cgcttcttta cacttccatt cctcaccgtc tcagcgcgga agaaaaaaag 360

cacgctaagt aaacccaaag taagctaagc ttaactaagc cgaacctggc ctagaattct 420

ctctaactca ttctttcttt catctactca ctcgccgaag aacaggcaca gactaataaa 480

ctatgcaacc agaaggtagt cgtcgtcatc gatattcatc gaatatgtgc ggcgacaggg 540

ccttccttcg cacagagagc cacacggcac gccggggtag ctgtttccta ttttttttac 600

acacggcccc aaattgttat tactattctt tttttcttca acgcaaccaa tacttcttgt 660

tgtatatgtg ctgacaaatc atgccagcgg caggcctgtg cagcacgtga cccacgcttg 720

gcccgctatg aaatgtcacg cgaaacggac ccttgccttt ttggcgacgg cacttcccct 780

atctggaaaa agccgagcat gcacccgtac cccacaaagc ttcgcttccg gtttccgggc 840

agcagcgccg tttctttttt cccgctgctt cgccctttgt attactcatt gcgcactttt 900

tcacttgcca tattcgttca ccggtttttc tttttatttc ttcgtctttt ttcgtctttt 960

tcttcactgg atatacgctt tttgcatttg caatagcaca tatgtgtata tatataagca 1020

agtgttgagc ttgcctgtca aatcctccat gtgtccttct cgtctatctt gttctgtctg 1080

gtatagagta atacttacat acatatacgt acattgtttc cgctggctag ttcgtaacca 1140

cctcctttcc taggcttaca ctcactttta ctcccgcaca caaacgcaaa cataaacaca 1200

<210> 24

<211> 834

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

aattgtaatt ccaatatcgt aagcgtgggt tacgcacaaa ctgtattttc aagatgctca 60

caaataattt agtttcatat atacgcatat atagaaagta tccatctata ggtaatcatg 120

aacaataaaa atattcacgt ttcaggagct attgtttgta ctcattacgt ttttggatat 180

caagttgaaa atcagcccct ttcactagat atcaagcgct ataaaaaaat tttaatttcg 240

atgaggcatc tttcttttct cttgtggcta tgtaagccta agaagccgtt tacacatcaa 300

tgataaataa gtatacaaaa agggttccat tttttttttt ggccgctacc ggactagcaa 360

gggcctaatg gtacgctgag cgtagtacaa ccaagcgctt gttagccgta gagttaagct 420

cttgactact attacggtaa aagccgggaa cgtgcgtaac aatttttttt tgcattaggt 480

taaagaggct cgctcgcgga gcctttagaa taccgcttaa ggcgccaaaa gatggaagct 540

attctctttc tttttttttt cacaaactga gaggggttgt gtatcgttaa aaatgttgga 600

agacttctga ctcatcacta cgcagattgt tagagttttt cgatgagaat ggcttcaaag 660

aacagaacaa aacacgatta tataagcccc atgtaaaaag aacgtcttaa tttattttga 720

atttaggact tcttgacatt tttagcatat ataacaatac gataagtgtc tcatcaaacg 780

tggttaagac agaaaacttc ttcacaacat taacaaaaag ccaaagaaga agaa 834

<210> 25

<211> 504

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

atatgattat agagcttata gctacatctt tttagataaa agcgaagatg tttctgcgat 60

ttttccatta tagctctcca tgatactaaa tatcaaggtc tacatgtaag tatttgtata 120

tatgggttgg aatgtatata cgtatatacg tacgtacgta cgtatatgca cataattgtt 180

acgggatgta tatataaatt agtagcatta tagaagatat ccctaacatc aatccccact 240

ccttctcaat gtgtgcagac ttctgtgcca gacactgaat atatatcagt aattggtcaa 300

aatcactttg aacgttcaca cggcaccctc acgcctttga gctttcacat ggacccatct 360

aaagatgaag atccgtattt tataggaaac attataaata aggaaagaga gatacaccta 420

tttttttcat tttgtgggtg attgtcattt ttagttgtct atttgattca atcaaaaaac 480

aaaaataaaa ctatatatta aaaa 504

<210> 26

<211> 446

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

aaattacata tactctatat agcacagtag tgtgataaat aaaaaatttt gccaagactt 60

ttttaaactg cacccgacag atcaggtctg tgcctactat gcacttatgc ccggggtccc 120

gggaggagaa aaaacgaggg ctgggaaatg tccgtggact ttaaacgctc cgggttagca 180

gagtagcagg gctttcggct ttggaaattt aggtgacttg ttgaaaaagc aaaatttggg 240

ctcagtaatg ccactgcagt ggcttatcac gccaggactg cgggagtggc gggggcaaac 300

acacccgcga taaagagcgc gatgaatata aaagggggcc aatgttacgt cccgttatat 360

tggagttctt cccatacaaa cttaagagtc caattagctt catcgccaat aaaaaaacaa 420

actaaaccta attctaacaa gcaaag 446

<210> 27

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

taaccttaaa tctattggcc tataatattc gcggcaaaat gagcatttga aaatcagtaa 60

tagaatgcta tcaaacttcg ttcatgacct ttttagcatc ataagtgttg aatcgaatct 120

atcagttcag taattaaaaa tactattttt ctgtcagcac agaacgtaac gacttttcct 180

tatatccact attgatttct ctttaaagtg ctatgtaaag tacctaaaaa acttgttata 240

gaagtctcat tcgaaagcat gtgggctcaa aaattgtgaa taagatacat agaaggagcc 300

gctgatcgac acataatagt agagttgaac ctagttggtt caaccattat catagttata 360

cgaataaagc cacaatataa atggccaacc gctgttgtca aacaagacta taggttcatt 420

ttaacctggc gtgcagtacg ctggtcttgc taacgcctct acaatacgta cagtgcaggt 480

tttgacgaat gaaagtggtt agaagattaa tgtgatagaa acaagaattt tctcgcaaag 540

atctgtatga aaggaaacgt ttggtaagaa ctctgcgatc caaattctac tgaatgaata 600

gaaggcttct acagaacaag ttgtatcgaa atgattgttg gcgactacta tatttctata 660

ggcatgaaag ttactcataa acaggaaaga cgcattttag tagcttgacc tggtcagatt 720

aatcagcttc caacgttact tccctttcgc aagaatctac ccaaaatgtc tcgagcatct 780

tgataattac agtatcgttc gtcccgactt ggcatttgtt taaatttcta agatgcttcc 840

tataggaaca taattgtcaa gaaagcacaa caaattgtct gcaatgtcaa caggagtggc 900

gcattttatg ttttttcatt tttttttttt tgtgcgtgat cattaagcgg gatattgtcc 960

acagtcatct aaaagaatga ccatttcgac gacttagttc ggaaaatatt tccagcggat 1020

gacaccactt gccacagttg gtgaccgcca aatctaagtc acgcgcggaa actgaaaggt 1080

tgtgagtata taagtgatca ctcgcttata taactgacga ggcagaacag ggtgccaaaa 1140

tgctcctcaa tattttattc atttgagatt caaggcttaa agacagcata tataagaatt 1200

<210> 28

<211> 235

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tcgcgcggta cgacagttac tgcgtgaaaa gattatcagc gccccttttt ttcttctttg 60

ttcttaacgt ttctttttct tgcggcttat gcccgtactt ataaaacaac ggcctcccgt 120

gccctattac cttcctgata gaccggacaa taacgtcact acatacaaag ttatacacta 180

acagaaactc aaacacaaac gtttttataa tagtcaaaat taaatatctc tcata 235

<210> 29

<211> 196

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gttaacgggc acagcgtcaa aaaatccgcc accacagttg atcgcgccga aaacgaggga 60

gttgcgatga gtaaaatgaa gggcatatat aaacaagagt agacagagac acatttttca 120

atatcatata tatagattta attggaaaga cagttatatt ctaacgtcaa aaacttaaca 180

agtaaatcaa gttgca 196

<210> 30

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

aggcaaccag aaggaaggag atgaagaatg gacataaaaa gcaaaatgac ttgctagatc 60

ttggcctgag ttactctcat gattgggacc gaactccgat aaataactct aaaacatgct 120

agaatatttc aagtaaatat acataaatca caaataagca aataaacaga taaatatctc 180

acaagaaatc gggagccgat cttcgatgtg tgtgggcgta tatacaaatg tgcattcggc 240

acgtaaaaga ctggtaaagg ctaccgtcct tcagtgagca ttttttacat tcattcaacg 300

ctatacagct cttactgtgc gacggaaacg cgacaaaatg tgaagagaaa actaggggtt 360

gctatgacac gaccacggaa ggcctaaaaa gttaagtgac agaaatcgtc attggtaaaa 420

aaaaccccga acatgccgat aaagacttgc ttattcacct acgatgactt cagaagtgcg 480

cctatatttc tttacttttg aacacccttc caccgcccat ttagagagag ctatttttgt 540

gccttcactt ccggcagagg ttatattttt tttttttttt tttttttgca tactactcct 600

acttctttct acagtctcat cccgacgctt cagtttgaaa tgtaagggac tgcggcattt 660

gactgaaaga agggagaatg gatggtttac tttacttttt acgtaatgaa aaaaaaaatg 720

attgctgtat taggacatcc ctgttctttt atgtggtagc ctatatccga taactgttca 780

gctataagac gtgaagagag attttttggt accccttatg cattcaatta aatagagaat 840

tagatatttc taccgatgtg cattttgtat ataaagaagt aggaatccct tctacaacga 900

cagaggtaga catactgctt ggaaacattc ttttcgtcct tttacagaat tctacataga 960

aataataaaa acaaacaata gctttactac acagtacaca ctaca 1005

<210> 31

<211> 730

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

agtaactcag gcccgagttg actgctcatt gaaggtatgt atgataaaca ttatagaata 60

atgaaaaatg cctcgtgaca tacagataaa atctaacaag gatatattca aaaaaaaaaa 120

aacaaaacaa aaaaataata acgtgataaa cattaatgaa caatgtattt acattcttaa 180

gcataggtga gaaattacct tctttacttt tttttttttt tttggtgata ttgtatattg 240

aaatatatag taatcaaatt cgtttcattg atcaaattgc tcactagttc tgtttttcaa 300

aatttcatct ttataggtag atacaagtgc cagagagata tataaacaga aaactctatc 360

gatgtgataa tgtatgccaa tatcgggact gtacacccac acatttacaa gcccacacat 420

cctacaactt tcttttcatt tcttgcgctt cttccactgt cataaaatat gattgtccga 480

tgccgcagcc tacgcctcgg cgagtattca tcacctaagc gtcctgtagg cggggccacg 540

cagtcactaa cggaatactc cagaaggctg cttcctttgg aaggaagttt cactcggttg 600

tccacccagc gctttaactt tgtctcagcg aagaagaatt gaataactat agtgaatttc 660

aagagctaga ggatggttag gtattagttc aaaacaaaga tttcaagaaa ccaacataga 720

ttaagcagaa 730

<210> 32

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

acattgctgc tatgctttgt agtattatcc atagagttta gggaggggga atggtcggag 60

agtgggtaat ttgcattgtc taatggagca gaatcagcgt tacttttctg gaaataaaac 120

tggtccgata acgaagtagt agaatcagag gtgagattgg agttggaagt ggtgttgagt 180

ttgtaaaact tttcggtttg atcatgcgat accttgtatt tgtcatcctt gtcattcttc 240

ttttttttgt tcttcttttt gttcttaggg tctaccatat tgctagtctt cggggtagga 300

gactttgttc cattattgtg atcatattgt tttcgaacca tggaattcaa taaattaagt 360

gaatatttcg gaatcccatc tcttttgaca ttaatcccct gaataccatc cttcgtggca 420

atcatggagg cacctgatgt gatggagcaa cctgagttcg ttctcgttat cctatcttca 480

ccagaggcaa tattggaagg gctcattgat ctctgatcta agtccaggtt agtagacctg 540

ttattagtgt aaatggactg atcatagaga gagatggcag atgcaacatc ttttgagctt 600

attgaatgtg atgaatcagg cattattaac tattcgcttc cttttcttat ctcagcagtt 660

tgtgtttttt attcttattg ttattatccc ttttaactat atatgcataa gctaagttaa 720

atattaaaat atttatatat aaacgttaca gggcgtgtga acacatttga aaaaatgctg 780

gaaggtaatg gtagatataa gaattggaat aacaggttga tagagaatcg ccaagctaga 840

gagttctgac aagcggcaag ggggaaggat gagacgcaga tacgaaagcc gcaccattaa 900

accgtaaaga gagaaaaata aagaatgact tatttctcgg aaaggccaaa tgcaattatg 960

caacacgcac acattcacac tcacactcac acataaactt tgactgaaac caaaactgtt 1020

gtgagtaata gcctttcttg ttcataaaat agtacaagat acagtaaata tatatcaact 1080

cacctggtat agggatcact tactgcactg caaaagtgga tcgtttgcgc aagaaactcc 1140

accaattcta aagaatataa tagaaaaagc taataggaaa agtggtcatt ttctgttgat 1200

<210> 33

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ttctgatgta agggcaagca tatcctgtaa aaaaaattat atagagatga tttatttata 60

taatgcctat agcaaccttt atccaaacct tccgtacatt atttaacagc aattgtttat 120

cattcatgat tatttctcaa aaagctgcca atttggcttc atttctgtaa gtatccctac 180

ctctctcctc taacgcagat atttctgtgc acgtgatctc gttggctttt ttttcggccg 240

aaattttcac aggctaaggc cgaaaaagaa agaaaatttt cagaggaaaa agaaaattaa 300

acgacctcga agccgtattt tagattttcc aatctcttat ttagtaacgt ggtttattaa 360

ctccatgatt ccattcctat ttgtttttct ttctttctga aaatcctctt ctcctcgaaa 420

taacccaact gacaaaaaga acaattccca 450

<210> 34

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

tggctgcacc atactctttg ggtgcttctt tggtttcctc ctgaaagtcg tcatctgata 60

tttgcaacac ttgttgctct tcagcgtcta agtctatggc atctgcagtt aaatcaacag 120

tttgttcctt actatttgtt ccaggtttcg ttgtcggcgg tgctgcgtca agcatcgggg 180

aagcactcgg agtgtttgct gtttgtgaaa gaacgtccat tgtgtgcaat tcttcaacat 240

tattcgttaa tgtgatattg ttaccagaac ttgcttctgg ctcttcggta tgcattgttt 300

ccctgtcatg attcccagaa tcgttgttac tggtgttatg gtcgctacct ggatcttctt 360

caagtgctct aaagagagat aaatcatcat caccatcttc ctcagaagta ttctcaagag 420

ctcgctctcc aatgatttcg actacggcct ctgggctgtc atggcggtta tctgtgacga 480

tattttgtgt tctcgatact tcattttctt cctcctcatc gttctgcctg accgactcta 540

gtcttaccct tttgattcgt agattttcac cttctggatt ttggttatca ggtcttcttg 600

ccatacaagg tgtaattaat ttactcgttt gttacttggc cgccccttta tattgactca 660

gtaggggaaa aagtactgtt gatcgaagaa agaaagttgt tcctactaat cttccgcatg 720

ctctaatatc tgacatatta tcccttctct tctgtaattt cctaaaatac aaatagatgt 780

agaaaacagt tctttctttc cctgttgtat acatccgtac acttttgtga acccaaacat 840

tttttgttta atttgaaaga tttttttcta ttaggagccg tctccttcaa ttctcggcaa 900

agcgagggtt cctctcatgc ttactgttct cttccccacc ggcagctgct gggaaccctc 960

caacatgctg tgcacggggg agggacagta gctaactacc tttcacttgg gcgggaaact 1020

gaaactaata cggtgctgtc ccggcttgcg cctctgagac ttactggaag gaagcccacg 1080

gtttcttttc agttggatgg agagttataa tcaagaagta tatagatttt gaatattgat 1140

taagcgagta atattgctat ttcgaaataa tcgagaaatc acgataataa tacagcaaaa 1200

<210> 35

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

aaaacagcac ccaattgggc catgtgtgat taacgccggg cggctatgca cgtttgaaca 60

agtatatccg catggagcaa caactgctat aagaaattcc gtcagagaaa tggcttgact 120

tgctgcaagc acagaggtgt ttatggataa tatgtataca ataacctcat aggtgtttgg 180

cagtgtgaat tcactgttcc ctgcgttccc ggaatggaga aaggggtatg acaggcgcca 240

aaaaaaaaaa acactgaaaa acaagagaaa agagtaaagg agatggcttg aatataatat 300

ttattccttg ctaagtttaa tagcgtattt tcttatatta attccgtgga cgatcagatg 360

cgggaataca atgttggcag ttatctgttt catcgctccc tccttgcgta aatatcgaac 420

cttctatcat tcgataatca agaattaaaa ctgacagccg cgccttttcg gcatcttctg 480

gggttgatca aaattataat aagaggactg ctgcatattt acctccgtac accttctaca 540

cccaacctta ttatggggcc tactaaattt tcttttgaga agaattgcgt tcttttcatc 600

gtgttgtgtt tttttgagat ctttcgcgcg atggcatctc acattcgcag tttgcatgaa 660

atttcagata gtattgacag cattcgatcg tgcaccggga aataacgcta ggcgtctatc 720

gtaacataac agagtgtttt attatctata tagtgatatt taccttaaat tcttgctctt 780

aagcgtgtct caatttactt tcaaaaagaa agataaatac acataatcaa acaggaaaag 840

tatgttataa gagcgaataa tgtgataaag gagcaaagtg gaaggaaaga attataaaga 900

atgacgttgc cgtaaagcca atttttcaac caacaaaatt gcaatagttt caagcaaatt 960

atggtgtgtc cgggattggc ggtagtaaat tgtaaaacaa tagctggtca atagttgata 1020

ttcataccga cactataatc cacaaaagat gggtgacatt gatggctgaa atggtagagg 1080

caagaaaatt ttttaaagca ataaggcata gacgtttcta ttaatccttt gttttattca 1140

gtattttcga tatttcctct ttactaactt caatttactg aatttgtatg taatttttag 1200

<210> 36

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ttctcatcat ttcatgtctt ctaacgccgt atataataat atcccagcaa aatataactg 60

ttagttagtg aatcataacc gactgttact cctgcaatat ccatgggaga aatcaccatc 120

ggaaggtaaa ctaacacgta ggtattgatt ctaccggaaa tgaacaaatg tcgtactgcc 180

caaatgagcc aaatgccatc atatacgcct tcataactat atttgaaaaa tacctttgcc 240

taaaagacga gtggtattgg aaacttcaat tagtgttcaa aaatgtccag tgagaggatg 300

aagttgtcgt ggttgaaaca gcataaacca cctaaaatag tatcaactga caacaactgt 360

ggaacacatg cggttacttt tataattaac cgcaaaatac ctgaaatgag ctaagaaata 420

gtaattataa acatgccact acaagtaaca gattaagtga tatgttggcg gacctcaata 480

taagcgacat ggagagatag agatagaaga atttgttatt gtgttaataa ataaagttaa 540

catccagttc tttcaagttg gctaagcgcc gtggcgcagt ggaagcgcgc agggctcata 600

accctgatgt cctcggatcg aaaccgagcg gcgctaattt ttcatttctt tttgcccgca 660

acaataacac agatcgcaat catttaagct atagactata agctttaact tctgcgttat 720

tattaataat tgttattgtt ttagttaggt atttctatca acttatttta tatattctat 780

attacagttt tcttttttta caaattcacc cagcaattat ttattattaa ttgtacatct 840

tctttaataa tgaatttatt attgcacaat attcaactta ggaaagatag aggaactgaa 900

ttctttatca gcaatgaaat aggccgtcta cggccgtcta cggcctattc cattgctaaa 960

aatttgaatc gtataaaggg atattacccg gaaaagaaac gcattaaaaa aaaaaaaaaa 1020

aaaaaaacag aaaaagtggt taagtgattg actgaccctt gatagttttg tacaattata 1080

cactcgttct gattaaaaac ttgtttataa aaatcttttt aaaagaaaga gaagatcgtg 1140

tttattgctt ttctcaaaaa gactaatcaa ttagaataac aaaagaaaca tatacatata 1200

<210> 37

<211> 886

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

agataataag ataatatttt attacactac atgtacaatt ttacttttac tttgtgttgt 60

ctctatctgc tttcttattt ttaatattta ccattccatt tataatttgt aaaacaatta 120

acataaaagt tttttaaact ctagaccagc aacatatctt caaatatcag ttgataaggt 180

aaagtatgtt gatagcattc taccgtcaca cttatctagc agatctttgt taggtagatc 240

tgctaatata ttttacgtaa gattcgttgt atgtgcggga aaatttgtat ctgttgtggt 300

agtcactcac cctttctatg tattaaaaac tgataccttc catactagaa aagacattca 360

gttgaatcct tctccaaatc aaggatacta ttgtcacttc tccattgaga ttcgaaaaac 420

ccctcgggtc ttgttagaac taaattacgt tcataggggt gggatttata ttgtaattcc 480

gcgaggttta cacgaaagat atctcaactc tagccgcaca tccattccgg tatgtactct 540

cccaccattg ggtattatag aatgtaatag gtttcaaagc ggatatcttt tgcccggtga 600

gttgttactt tttcattcga gcaatgaagt acattctaga agttcctaga accttatgga 660

agcaccaaga aaaaaggaag ttaaacaaaa cactgattca ataagcaagg ggggaagctc 720

cttagtttga cgacagtaac aaaatgttcg tataaattga acgaaactca agccaataaa 780

ggacttttca gaggcctatc tcttctttct ccacaacttt cgaataaaaa ccactaataa 840

aaagtaaata acaaaaacaa gaaaaaaaat aaacaaaaca ataatc 886

<210> 38

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

aaccgctgtg taatgtagac tactgtgtat agagataact ctagcttcta taggctcact 60

tgcgaagctt ttttcccact ttttcccagt gaaatagttt cttattggct tttcatagtt 120

tgttctccga tttaatcgca agcgccgtac ggcgcaggca cagaatgact tgcagcttaa 180

tccaggtgca ttttaagaaa cttatctgct gggaagaccc cgaagttcat cgtttacaat 240

gtgccgtaaa gaacacattt gagggtgcaa tctggttcgt cttttgccat aattagtagt 300

gctcatccgt gatcctttaa tttacttttg tgatgcgatg atttgcagat actatataag 360

caatggacac cgtccatcac cgatgaggct agaacatcgt agtgctttgt aaaagaactg 420

ttaaagaccc agtacgaaaa tttttccata 450

<210> 39

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

gaagtaatga ttagggcgat catttccccg tgcacatttc acgtcatgta tcatagatgc 60

aatttcatgt aaactattta gacatctcat ttaataaaaa tagctacaaa ctgtatttta 120

caatattagt aacatatcaa agataatctc tatggtatat acaaaacttc aaaaatgcca 180

agacaatttg cacggctgcg acctaattga gactttgtgg cctgcatatc agtcttacaa 240

taaaagccaa aaagaaaaaa aaaaagtaag aatgcacagg tgactagtgg ttatgtgact 300

atgtgaacgt aaagagaacg agatgtaacc cggcaacccg gctagagagg ttgtttagca 360

tgcgaggtat tagactcctt gtcaaaaaat taattaaaat atttattagt taatttatta 420

gttgcaaagt cattgataac agcgtgactc ttcccggaaa ttctttcatt tcggcatttc 480

gaagcgagac cgcaaaacac gtgtacgcac gtagccaacg attgaaaaaa aaagcttcca 540

agtgagtcac ctctaccgtt ggaacttata aaatattttt gcagaatata ctcgcctgaa 600

agtccattta tacgcagtga actgcaagta tttaccgtct aaactttggc attttactcc 660

tattaacggt ttgaatcttt gaaaatagaa aagaaaggat aggtttctaa aaaattcaat 720

agaaaa 726