本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地涉及一種含硒化合物及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

癌癥是全世界罹患疾病和導(dǎo)致死亡的首要原因，并且由于現(xiàn)代技術(shù)延長了預(yù)期壽命，因此預(yù)計癌癥仍會增加。在細(xì)胞的生命期中，偶爾會發(fā)生被稱為“突變”的DNA微小變化。在這些突變中，某些突變（稱為“沉默突變”）不導(dǎo)致細(xì)胞功能的任何本質(zhì)變化，而另一些突變可改變細(xì)胞的作用方式。多種機(jī)制均可以阻止已發(fā)生突變的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞周期，并且如果遺傳錯誤得不到糾正，這些細(xì)胞將通過被稱為“細(xì)胞凋亡”的過程而“自殺”。然而，如果突變發(fā)生在參與細(xì)胞周期調(diào)控的蛋白質(zhì)中，這可導(dǎo)致失控的細(xì)胞增殖（稱為腫瘤形成），其可進(jìn)一步發(fā)展成癌癥。

癌細(xì)胞通常對機(jī)體具有不利影響。癌癥可通過惡性腫瘤細(xì)胞侵入鄰近組織來擴(kuò)散，也可通過已知為“轉(zhuǎn)移”的過程來擴(kuò)散，在“轉(zhuǎn)移”過程中惡性細(xì)胞從腫瘤塊脫離并擴(kuò)散至較遠(yuǎn)的部位。在許多不同類型的組織中，癌癥表現(xiàn)為多種形式，并可以其侵入和侵襲程度來表征。癌癥作為活宿主生物中的異常組織塊而發(fā)生，它從宿主中接收營養(yǎng)而不依賴于宿主地過度增殖，并且破壞宿主機(jī)體。人體器官由大量細(xì)胞構(gòu)成。當(dāng)人體的正常細(xì)胞變成異常細(xì)胞并且該異常細(xì)胞不加檢查地分裂和增殖時，就發(fā)生癌癥。盡管遺傳因素與癌癥的發(fā)病密切相關(guān)，但環(huán)境因素也對個體是否發(fā)生癌癥產(chǎn)生重要影響。癌癥在發(fā)達(dá)國家尤其普遍。有報道稱，導(dǎo)致癌癥的原因是對農(nóng)藥、殺蟲劑等的使用增加（因此這類物質(zhì)在食品中的殘留量增加），對包含添加劑（如食品防腐劑和著色劑）的加工食品的消費(fèi)增加，對水、土壤和空氣的污染的增加，現(xiàn)代生活的壓力，活動的減少，油膩的飲食習(xí)慣所引起的肥胖，等等。近年來，還有人指出，當(dāng)正常細(xì)胞的細(xì)胞信號系統(tǒng)發(fā)生故障，當(dāng)癌癥基因被激活，或當(dāng)抑癌基因發(fā)生故障時，就引發(fā)癌癥。

目前存在多種癌癥治療方法，如手術(shù)治療，化學(xué)療法和放射療法。手術(shù)治療方法在早期階段有效地去除癌癥，但是，缺點(diǎn)是有時不得不摘除器官，這會導(dǎo)致副作用，并且具有癌癥擴(kuò)散至其他器官的不確定性。放射治療有利于有效地治療在一個特定器官發(fā)生的癌癥，但是有以下缺點(diǎn)：因?yàn)檩椛涠够颊弑┞队谄渌┌Y風(fēng)險，無法防止癌細(xì)胞擴(kuò)散到其他器官，并且在治療過程中患者要承受很大的痛苦?；瘜W(xué)療法通常使用抗癌藥物進(jìn)行，但是已知抗癌藥物的毒性不僅作用于癌細(xì)胞，也作用于患者的正常細(xì)胞，造成副作用。因此，要開發(fā)有更高的癌細(xì)胞選擇性和盡可能小的毒性的新抗癌藥物。

硒是機(jī)體生命活動不可缺少的一種微量元素。近年來，人們對硒化合物特別是有機(jī)硒化合物進(jìn)行了研究，試圖從中發(fā)現(xiàn)有抗癌或抗腫瘤活性的化合物。例如，EI-Bayoumy 等［K El-Bayoumy，Drugs Future, 1997，22(5) : 539～545］研究發(fā)現(xiàn)，芐基硒氰化物在DMBA誘導(dǎo)的乳腺癌小鼠模型中表現(xiàn)出抗腫瘤作用。與亞硒酸鈉相比，芐基硒氰化物的抗癌活性更高，但其本身具有強(qiáng)烈的異味，且存在導(dǎo)致患者體重顯著下降的副作用。

依布硒啉(ebselen，2-苯基-1,2-苯并異硒唑-3(2H)-酮)和乙烷硒啉(1,2-[二(1,2-苯并異硒唑-3(2H)-酮)])乙烷是兩個已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的有機(jī)硒化合物。研究表明，依布硒啉的作用機(jī)制主要是通過抑制靶酶-硫氧環(huán)蛋白還原酶的活性，調(diào)節(jié)其下游信號傳導(dǎo)通路及其抗腫瘤凋亡通路，實(shí)現(xiàn)藥物的抗腫瘤作用，生物活性和低毒性則可能與其環(huán)狀硒酰胺結(jié)構(gòu)或苯并異硒唑酮含硒雜環(huán)有關(guān)（H J Reich，等 J．Am．Chem．Soc．，1987，109 (18): 5549-5551）；乙烷硒啉是硫氧環(huán)蛋白還原酶抑制劑，乙烷硒啉分子中含有2個苯并異硒唑酮結(jié)構(gòu)，收到了協(xié)同增效的效果，活性優(yōu)于依布硒啉。

盡管發(fā)現(xiàn)了上述有機(jī)硒化合物，但現(xiàn)有的有機(jī)硒化合物仍存在抗癌效力有待進(jìn)一步提高、抗癌譜有限，以及化合物結(jié)構(gòu)類型有限等問題，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人類對于癌癥預(yù)防和治療的日益增長的需求。因此，開發(fā)出更好效果的抗癌藥物，特別是有機(jī)硒化合物已成為迫切的需要。

因此，現(xiàn)有技術(shù)仍迫切需要新的有良好效果的癌癥預(yù)防劑或治療劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)研究，意外發(fā)現(xiàn)了一種含硒有機(jī)化合物，具有出乎意料的預(yù)防和治療癌癥的生物活性。所述化合物可有效用于多種癌癥的治療和/或預(yù)防。

本發(fā)明提供了下式 Ⅰ 的化合物：

在另一方面，本發(fā)明還提供了式 Ⅰ 化合物的制備方法，所述方法包括以下步驟：

（?。┦苟轿押蚇-溴代苯并丁二酰亞胺得到化合物 II；和

（ii）使式II化合物與式III化合物反應(yīng)得到式I化合物。

在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用以下方法制備式I化合物：先使二苯硒二硒醚與N-溴代苯并丁二酰亞胺反應(yīng)得到式 II 化合物，即N-苯硒苯并丁二酰亞胺，再使式II化合物與式 III 化合物反應(yīng)得到式I化合物；其中二苯硒二硒醚與N-溴代苯并丁二酰亞胺的摩爾比為1:1 ～1:4，反應(yīng)溫度為0 ～50^oC，反應(yīng)時間為24小時；N-苯硒苯并丁二酰亞胺與式 III 化合物的摩爾比1:1 ～ 1:2，反應(yīng)溫度為0 ～40 ^oC，反應(yīng)時間為10 ～ 20 小時。

反應(yīng)式如下：

本發(fā)明的制備方法簡單、產(chǎn)率較高，而且能容易地制備式I化合物。

在本發(fā)明的另一個方面，提供了包含本發(fā)明式I化合物或其可藥用鹽和任選的可藥用賦形劑和/或載體的藥物組合物。在本發(fā)明的藥物組合物中，除了本發(fā)明的式I化合物或其可藥用鹽外，還可以另外包含其他藥物活性成分。本發(fā)明的藥物組合物可以通過常規(guī)技術(shù)制備，例如在Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版，1995中所描述的方法，其通過引用并入本文。所述組合物可以以常規(guī)形式出現(xiàn)，例如膠囊、片劑、氣霧劑、溶液劑、混懸劑或局部施用形式。

典型的組合物包含本發(fā)明化合物和可藥用賦形劑或載體。例如，活性化合物通常與載體混合，或者被載體稀釋，或者被密封在可以為安瓿、膠囊、小藥囊（sachet）、紙或其它容器形式的載體內(nèi)。當(dāng)將活性化合物與載體混合時，或者當(dāng)載體充當(dāng)稀釋劑時，所述載體可以為充當(dāng)活性化合物的載體、賦形劑或介質(zhì)的固體、半固體或液體材料。所述活性化合物可以吸附在顆粒狀固體載體上（例如容納在小藥囊中）。合適的載體的一些實(shí)例為水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、聚羥基乙氧基化蓖麻油、花生油、橄欖油、明膠、乳糖、白土、蔗糖、糊精、碳酸鎂、糖、環(huán)糊精、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、硬脂酸或纖維素的低級烷基醚、硅酸、脂肪酸、脂肪酸胺、脂肪酸甘油單酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、聚氧乙烯、羥甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮。類似地，所述載體或稀釋劑可以包括任何本領(lǐng)域已知的持續(xù)釋放材料，例如單獨(dú)的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯或者其與蠟的混合物。

所述制劑可以與不與所述活性化合物發(fā)生有害反應(yīng)的輔助劑混合。這些添加劑可以包括潤濕劑、乳化劑和助懸劑、影響滲透壓的鹽、緩沖劑和/或著色物質(zhì)、防腐劑、甜味劑或調(diào)味劑。如果需要，還可以對所述組合物進(jìn)行滅菌。

施用途徑可以是將本發(fā)明活性化合物有效地轉(zhuǎn)運(yùn)到適當(dāng)?shù)幕蚱谕淖饔貌课坏娜魏瓮緩?，例如口服、?jīng)鼻、肺部、口含、皮下、皮內(nèi)、透皮或腸胃外途徑，例如直腸、貯庫（depot）、皮下、靜脈內(nèi)、尿道內(nèi)、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、眼用溶液或軟膏劑的途徑，口服途徑是優(yōu)選的。

如果使用固體載體用于口服施用，則該制劑可以是壓片的，以粉劑或小丸形式置于硬明膠膠囊中，或者其可以是糖錠（troche）或錠劑的形式。如果使用液體載體，則所述制劑可以是糖漿劑、乳劑、軟明膠膠囊或無菌可注射液體的形式，例如水性或非水性液體混懸劑或溶液劑。

可注射的劑型通常包括水性混懸劑或油性混懸劑，其可以使用合適的分散劑或潤濕劑和助懸劑來制備。可注射的形式可以是在溶液相中或者是用溶劑或稀釋劑制備的混懸劑的形式?？山邮艿娜軇┗蜉d體包括無菌水、林格溶液或等滲鹽水溶液?；蛘?，可以應(yīng)用無菌油作為溶劑或助懸劑。優(yōu)選地，所述油或脂肪酸是不揮發(fā)性的，包括天然油或合成油、脂肪酸、甘油單酯、甘油二酯或甘油三酯。對于注射而言，所述制劑還可以是適于用上述的合適溶液重構(gòu)的粉末。這些的實(shí)例包括但不限于冷凍干燥的、旋轉(zhuǎn)干燥的或噴霧干燥的粉末，無定形粉末、顆粒、沉淀物或微粒。對于注射劑而言，所述制劑可以任選地包含穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、生物利用度調(diào)節(jié)劑和這些試劑的組合?？梢詫⑺龌衔锱渲茷橛糜谕ㄟ^注射進(jìn)行胃腸外施用，例如通過推注或連續(xù)輸注。用于注射的單位劑型可以在安瓿中或多劑量容器中。

可以將本發(fā)明的制劑設(shè)計成在通過本領(lǐng)域熟知的方法施用至患者后能提供活性成分的快速、持續(xù)或延遲釋放。因此，還可以將所述制劑配制成用于控釋釋放或緩慢釋放。

本發(fā)明的化合物在寬的劑量范圍都是有效的。例如，在成年人的治療中，可以使用每天約0.02至約1250 mg、優(yōu)選約0.1至約1000 mg、更優(yōu)選約0.1至約500 mg的劑量。典型的劑量為每天約100 μg至約500 mg。在選擇患者治療方案時，其可常常須從較高的劑量開始，并且當(dāng)病癥得到控制時減少劑量。精確的劑量將取決于化合物的活性、施用方式、期望的治療、施用的形式、待治療的對象和待治療對象的體重、及主管醫(yī)師或獸醫(yī)的偏好和經(jīng)驗(yàn)。

通常，將本發(fā)明化合物分配在單位劑型中，其每單位劑量包含約0.05 mg至約1000 mg活性成分和可藥用載體。

通常，適于口服、經(jīng)鼻、肺部或透皮施用的劑型包括約20 μg至約1250 mg、優(yōu)選約50 μg至約500 mg、更優(yōu)選約100μg到約250 mg的與可藥用載體或稀釋劑混合的所述化合物。

劑型可以是每日一次、或每日一次以上例如每日兩次或每日三次施用。或者，劑型可以少于每日一次的頻率施用，例如每隔一天或每周，如果開處方的醫(yī)師認(rèn)為合適的話。

藥物組合物可以片劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、錠劑、液體或膠狀物形式。供口服的片劑和膠囊可以適于單位劑量用藥的形式，并且可以含常規(guī)的賦形劑，這些例子有：結(jié)合劑如糖漿、阿拉伯樹膠、凝膠、山梨醇、黃著膠、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；填料如乳糖、糖類、玉米粉、磷酸鈣、山梨醇或甘氨酸；片劑潤滑劑如硬脂酸鎂、二氧化硅、滑石、聚乙二醇或二氧化硅；崩解劑如馬鈴薯淀粉；可接受的潤滑劑如月桂基硫酸鈉。片劑可按照已知的常規(guī)制藥實(shí)踐中的方法進(jìn)行包衣?？诜后w制劑可以使水狀或油狀懸浮液、溶液、乳劑、糖漿或酊劑，也可制成一種干物質(zhì)，在使用之前再用水或其它合適的載體重新調(diào)制。這些液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，例如懸浮劑（如：山梨醇、糖漿、甲基纖維素、葡萄糖漿、明膠、經(jīng)氫化的食用油脂）。乳化劑（如孵磷脂，山梨醇單油酸鹽或阿拉伯樹膠），非水相載體（包括食用油如杏仁油、精餾的椰子油、油脂如甘油、丙二醇或乙醇）,防腐劑（如甲基或丙基對羥基苯甲酸或山梨酸），如果需要也可含有常規(guī)的風(fēng)味劑或著色劑。

劑量可隨用藥方法和劑型，以及年齡、體重，病人的狀態(tài)和敏感性不同而變化。單劑量單位可含有式I化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽的量為0.02mg至1250mg，可方便地用來符合日劑量的需要。使用的劑量和劑量單位可超出上述范圍。

本發(fā)明藥物組合物中活性物質(zhì)的百分比是可變的，因?yàn)楸仨毷顾幬镎{(diào)劑制成一定合適比例的劑量，以獲得理想的療效?？傊?，本發(fā)明的藥物制劑經(jīng)口服或注射給藥應(yīng)按每70kg體重每天0.02mg至1250mg活性物質(zhì)。

在另一方面，本發(fā)明還提供了式I化合物或其可藥用鹽在制備用于治療或預(yù)防癌癥的藥物中的用途。在一個優(yōu)選的方面，其中所述癌癥選自食管癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌、肝癌、肺癌和結(jié)腸癌；更優(yōu)選地，所述癌癥選自胃癌、肝癌、肺癌和結(jié)腸癌；最優(yōu)選地，所述癌癥為肝癌。

以下的實(shí)施例是為了說明本發(fā)明某些方面的目的，在任何方面都不應(yīng)被認(rèn)為是限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

制備實(shí)施例

實(shí)施例1：N-苯硒苯并丁二酰亞胺（式II化合物）的合成

在三口燒瓶中加入N-溴代苯并丁二酰亞胺(147 mg, 1 mmol)，二苯硒二硒醚(312mg, 1 mmol)和無水乙腈10 ml，加熱至50 ℃，通入氬氣保護(hù)，攪拌24小時后，減壓蒸餾得粗產(chǎn)物，柱層析（流動相：乙酸乙酯：石油醚 = 2:1（V:V））得黃色粉末狀固體（式II化合物） 260 mg，產(chǎn)率 86%。

核磁共振 ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 7.94-7.92 (2H, dd, J₁ = 5.5 Hz, J₂ = 3.0 Hz), 7.85-7.78(2H, dd, J₁ = 5.5 Hz, J₂ = 3.0 Hz), 7.64-7.60 (2H, m), 7.52-7.46(1H, m), 7.32-7.30(2H, m). ¹³C NMR: 176.2，170.3, 140.4, 136.6, 134.5, 129.4, 124.3 123.7.

ESI-MS: m/z=325.2 (M + Na)⁺.

實(shí)施例2：式I化合物的合成

在三口燒瓶中加入式III化合物（85 mg， 0.66 mmol）、式II化合物N-苯硒取代苯并丁二酰亞胺（200 mg，0.66 mmol）和無水DMF（10ml）中，在氬氣保護(hù)下攪拌過夜，減壓蒸餾出去溶劑，柱層析（流動相：甲醇：二氯甲烷=1:10）得白色粉末固體（式I化合物）210 mg，產(chǎn)率73 %.

核磁共振 ¹H NMR (DMSO) δ: 9.02 (1H, s), 7.84 (2H, s), 7.46-7.35 (2H, m), 7.28-7.13 (3H, m), 7.22 (1H, s), 2.88 (6H, s). ¹³C NMR: 175.7, 158.3, 144.2, 130.2, 127.3, 124.9, 37.6.

ESI-MS: m/z=307.3 (M + Na)⁺.

體外藥理學(xué)

實(shí)驗(yàn)例1：醌還原酶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)：

小鼠肝癌細(xì)胞 Hepa 1c1c7 解凍處理后培養(yǎng)在 37 ^oC，5% CO₂的恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)液為含 10%胎牛血清和 1% 抗生素（100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 鏈霉素）的 α-MEM培養(yǎng)液。每 2-3 天更換一次新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁率達(dá)到 85%之上時，用 0.25%胰蛋白酶消化計數(shù)備用。

醌還原酶誘導(dǎo)活性測定：

現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)知道，二相代謝酶對于預(yù)防腫瘤的發(fā)生具有重要意義，作為二相代謝酶之一的醌還原酶是一類具有解毒、清除自由基作用的細(xì)胞保護(hù)酶，對醌還原酶具有誘導(dǎo)活性的成分被認(rèn)為在腫瘤起始階段具有癌癥預(yù)防作用，醌還原酶水平的上調(diào)被認(rèn)為是預(yù)防癌癥發(fā)生的重要機(jī)制（Su BN，Gu JQ，Kang YH，Park EJj Pezzuto JM，Kinghorn AD.Induction of the phase II enzyme, Quinone Reductase,by withanolides and norwithanolides from solanaceous species. Mini-Rev Org Chem2004;1:115-123；Rosana I.Misicoj Lynda L.Song,Adriana S.Veleiroj et. al. Induction of Quinone Reductase by Withanolides. J. Nat. Prod. 2002; 65:677-680)。

本發(fā)明采用Prochaska方法（Prochaska et al. 1992）測定樣品的醌還原酶誘導(dǎo)活性。將上述消化好的Hepa 1c1c7細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度為5000個/孔，空白組不接種細(xì)胞。于37^oC，5% CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，依次加入含有不同濃度樣品的新鮮培養(yǎng)液 150 μL/孔（DMSO≤0.2%），陰性對照組只加等量的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。測定前，棄去培養(yǎng)液，加入50μL的0.08%（w/v）洋地黃皂苷和EDTA（2 mM）溶液（pH 7.8），在37^oC振搖20min使細(xì)胞充分裂解。然后加入200μL預(yù)先配制好的完全反應(yīng)溶液。完全反應(yīng)溶液配制方法：100 mg牛血清蛋白，3.5 mg NADP，1 mL 150 mM 葡萄糖6-磷酸，1 mL 0.75 mM FAD，1 mL 1.5%（w/v）吐溫20，3.75 mL 1M Tris-HCl（pH 7.4），45 mg MTT，300 U 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，用去離子水定容至140 mL。最后加入0.2μL的50 mM甲萘醌溶液，在酶標(biāo)儀中490 nm波長下測定10 min內(nèi)的吸光值。

細(xì)胞存活率測定：

采用結(jié)晶紫染色法測定細(xì)胞存活率。取上述消化好的Hepa 1c1c7細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞密度為5000個/孔，空白組不接種細(xì)胞。在37^oC，5% CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，添加含有不同濃度樣品的新鮮培養(yǎng)液150 μL，陰性對照組只加等量的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。然后棄去培養(yǎng)液，加入100 μL 的0.2%（w/v）結(jié)晶紫溶液，常溫下放置10 min，棄掉結(jié)晶紫溶液，用水清洗培養(yǎng)板并將水吸干，接著加入150 μL的0.5%（w/v）十二烷基磺酸鈉溶液，密封培養(yǎng)板，于37^oC 搖床中振搖1 h，在酶標(biāo)儀中測定610 nm 波長下的吸光值。

結(jié)果計算：

CD 值是使相對醌還原酶誘導(dǎo)活性值為2時所對應(yīng)的樣品濃度，是衡量樣品醌還原酶誘導(dǎo)活性的指示值。在測試濃度范圍內(nèi)，當(dāng)存在CD值時認(rèn)為樣品具有醌還原酶誘導(dǎo)活性，且CD值越小表明樣品醌還原酶誘導(dǎo)活性越強(qiáng)。具體結(jié)果如表1所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)施例2制備的化合物I的CD值小于陽性對照藥4′-溴黃酮，表明化合物I具有良好的醌還原酶誘導(dǎo)活性，在腫瘤起始階段具有較好的癌癥預(yù)防作用。

實(shí)驗(yàn)例 2：細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)期的細(xì)胞每孔3×10⁴接種于96孔板上，每孔加入200μL 的DMEM培養(yǎng)基，12h后，棄上清液，然后在復(fù)孔中加入實(shí)施例2制備的化合物I, 按空白組和加藥組（濃度分別為0, 2.5, 5, 10, 20, 30和50μM），培養(yǎng)24h后，棄上清液。加入含有MTT的溶液50μL培養(yǎng)4h，MTT的溶液由MTT( 噻唑藍(lán), 碧云天試劑公司) 溶解在磷酸緩沖液（PBS，pH=7.3）中制成，MTT濃度為0.5mg/mL，再向各孔分別加入100μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩1h，于酶標(biāo)儀上570nm處測OD（光密度）值。將各株腫瘤細(xì)胞系的梯度加藥劑量與其對應(yīng)的增殖抑制率進(jìn)行擬合計算，得到非線性回歸方程，IC₅₀值指腫瘤細(xì)胞系增殖抑制率為50%時的加藥劑量。其中，增殖抑制率% =（空白組OD值- 給藥組OD值）/空白組OD值。結(jié)果顯示，加藥后，腫瘤細(xì)胞活性明顯下降。本實(shí)驗(yàn)分別對人肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B、 LM3進(jìn)行細(xì)胞毒活性的檢測，上述細(xì)胞株均購置于ATCC，具體的結(jié)果如表2所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)施例2制備的化合物I對不同的腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性，尤其對HepG2細(xì)胞株具有良好的細(xì)胞毒活性，能夠起到較好的癌癥預(yù)防和治療作用。