本發(fā)明涉及一種海洋活性多肽，特別涉及一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽的制備方法。

背景技術(shù)：

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率、死亡率逐年上升，已成為腫瘤相關(guān)死亡的首要病因。肺癌約80％是非小細(xì)胞肺癌，在晚期肺癌中的比例達(dá)到總數(shù)的40％～50％。目前對于非小細(xì)胞肺癌的治療早期是手術(shù)切除，晚期主要是化療，但化療的毒副作用及產(chǎn)生的耐藥性，影響治療的有效性，因此尋找精準(zhǔn)治療是熱門話題。海洋是一個巨大的藥物寶庫，從海洋中尋找活性物質(zhì)已成為熱點(diǎn)，并從中分離獲得多種活性物質(zhì)，如肽類、多糖、生物堿、萜類、大環(huán)內(nèi)脂等，有望開發(fā)成新型的抗腫瘤藥物，如從海兔獲得的dolastatin 10已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。沙蠶(Nereis)屬于環(huán)節(jié)動物門(Annelida)多毛綱(Polychaeta)沙蠶科(Nereididae)，又稱為海蟲、海蜈蚣、海螞蟥等，其生物資源豐富，廣泛分布在我國沿海地區(qū)，近年來人工養(yǎng)殖用于鉤魚的誘餌。沙蠶是一種傳統(tǒng)的海洋中藥，有清熱解毒，消腫止痛，斂瘡生肌，主治癰瘡腫毒等功效。學(xué)者們從沙蠶體內(nèi)獲得了具有良好藥理活性的物質(zhì)。吉林大學(xué)從日本刺沙蠶體內(nèi)分離出一種沙蠶絲氨酸蛋白酶，該蛋白酶抑制血小板聚集，改變血液流變學(xué)特性，可作為降纖和溶栓藥物，預(yù)防和治療心、腦梗塞，腦動脈、肺動脈血栓形成等疾病。然沙蠶酶解多肽的研究較少，而對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的抑制活性目前尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽的制備方法，安全性好，反應(yīng)條件溫和，過程控制容易，所得雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽純度高，對肺癌細(xì)胞A549和H1299有明顯的增殖抑制作用，具有較好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽的制備方法，步驟如下：

(1)樣品預(yù)處理：將雙齒圍沙蠶解凍后，清洗干凈，勻漿，得到勻漿液；

(2)酶解：按照每克勻漿液加1mL純凈水的配比，將勻漿液與純凈水混勻，調(diào)節(jié)pH至11，加入堿性蛋白酶，酶解后得酶解液；

(3)超濾：酶解液滅活，離心，取上清液，經(jīng)超濾獲得分子量1ku以下、1ku<分子量≤3ku、3ku<分子量≤5ku、5ku<分子量≤8ku以及8ku<分子量≤30ku的五種組分的活性組分，MTT法篩選對肺癌細(xì)胞A549增殖抑制率最高的活性組分；

(4)陰離子交換層析：收集步驟(3)獲得的對肺癌細(xì)胞A549增殖抑制率最高的活性組分，冷凍干燥，經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析，梯度洗脫，在280nm進(jìn)行檢測，分別收集各洗脫峰并冷凍干燥，MTT法篩選對肺癌細(xì)胞A549增殖抑制率最高的陰離子交換層析產(chǎn)物；

(5)Sephadex G25凝膠層析：將步驟(4)獲得的對肺癌細(xì)胞A549增殖抑制率最高的陰離子交換層析產(chǎn)物采用Sephadex G-25凝膠層析分離純化，蒸餾水洗脫，在280nm進(jìn)行檢測，分別收集各洗脫峰并冷凍干燥，MTT法篩選對肺癌細(xì)胞A549增殖抑制率最高的Sephadex G25凝膠層析產(chǎn)物；

(6)高效液相色譜分離純化：對步驟(5)獲得的對肺癌細(xì)胞A549增殖抑制率最高的Sephadex G25凝膠層析產(chǎn)物經(jīng)濾膜過濾后用采用反相高效液相色譜法分離純化，收集主峰，冷凍干燥后獲得雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽。

本發(fā)明首次通過酶解的方法從沙蠶體內(nèi)提取獲得具有抗肺癌作用的多肽，對肺癌細(xì)胞A549和H1299有明顯的增殖抑制作用，具有較好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

作為優(yōu)選，步驟(2)按照每克勻漿液加300U的加酶量加入堿性蛋白酶，50℃酶解6小時得酶解液。

作為優(yōu)選，步驟(4)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析的分離條件為：pH 7.2、0.2mM的Tris-HCl緩沖溶液平衡柱子后，將樣品配成250mg/mL，每次上樣量為2mL，每次上樣前過0.22μm的膜。

作為優(yōu)選，步驟(5)蒸餾水洗脫的洗脫流速為1.1mL/min。

作為優(yōu)選，步驟(6)反相高效液相色譜法分離純化的色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-C18分析型色譜柱；檢測波長：280nm；流速：0.5mL/min；流動相A為含0.05％三氟乙酸的乙腈，流動相B為含0.05％三氟乙酸的超純水，采用梯度洗脫方式：20％～100％A洗脫5～20min；平衡時：流動相A與流動相B的流動相體積比為20：80；柱溫：25℃；自動進(jìn)樣，進(jìn)樣量：10μL。

本發(fā)明的有益效果是：安全性好，反應(yīng)條件溫和，過程控制容易，所得雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽純度高，對肺癌細(xì)胞A549和H1299有明顯的增殖抑制作用，具有較好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1五種蛋白酶酶解物對A549細(xì)胞的抑制率。

圖2不同分子量的沙蠶多肽對A549細(xì)胞增殖的影響。

圖3陰離子DEAE Sepharose Fast Flow洗脫峰。

圖4葡聚糖凝膠柱洗脫峰。

圖5反相高效液相色譜柱洗脫峰。

圖6 PAP對A549細(xì)胞活性的影響。

圖7 PAP對H1299細(xì)胞活性的影響。

圖8倒置顯微鏡下的A549細(xì)胞(×200)。

圖9倒置顯微鏡下的H1299細(xì)胞(×200)。

圖10 A549細(xì)胞形態(tài),AO/EB染色(×200)。

圖11 H1299細(xì)胞形態(tài),AO/EB染色(×200)。

圖12 PAP對A549細(xì)胞形態(tài)變化的影響，24h Hoechst 33258染色(×200)。

圖13 PAP對H1299細(xì)胞形態(tài)變化的影響，24h Hoechst 33258染色(×200)。

圖14 A549細(xì)胞Annexin V-FITC/PI雙染24h。

圖15 H1299細(xì)胞Annexin V-FITC/PI雙染24h。

圖16 A549細(xì)胞線粒體膜電位的變化24h。

圖17 H1299細(xì)胞線粒體膜電位的變化24h。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。

本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

實(shí)施例：

1材料與方法

1.1原料

1.1.1樣品與試劑

沙蠶購于舟山市水產(chǎn)養(yǎng)殖場，經(jīng)浙江海洋大學(xué)趙盛龍教授鑒定為雙齒圍沙蠶(Perinereies aibuhitensis)，鮮活購買后待用。Folin試劑，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；酪氨酸，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶，北京亞太恒信生物科技有限公司；酪蛋白，北京亞太恒信生物科技有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程有限公司；1640粉末培養(yǎng)基，Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，美國sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)，美國sigma公司；美國sigma公司；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒，南京凱基生物發(fā)展有限公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，北京貝博生物科技有限公司；其它試劑均為分析純。

1.1.2細(xì)胞

人肺癌A549和H1299細(xì)胞株均購自中科院上海細(xì)胞庫，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.2主要儀器與設(shè)備

DS-1組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)準(zhǔn)模型廠；SSW-420-2S恒溫水浴鍋，上海民儀電子有限公司；GF16RXII日立高速低溫離心機(jī)，日本HITACHI公司；ALPHA 1-4/LDplus型冷凍干燥機(jī)，德國CHRIST公司；BSA124S型電子天平，德國SatoriusAG公司；ZHJH-C1209C型超凈工作臺，上海智證分析儀器制造公司；Forma3111型CO₂培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；BX2-FLB3熒光顯微鏡和CCD-NC6051顯微攝像，日本OLYMPUS公司；WRO-70型超純水儀和easy Cyte6 HT-2L流式細(xì)胞儀，美國Millipore公司。

1.3方法

1.3.1沙蠶酶解液的制備工藝過程

采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶五種蛋白酶對原料進(jìn)行酶解。利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)酶解實(shí)驗(yàn)，以氨基氮含量和抗肺癌A549細(xì)胞增殖活性為指標(biāo)的影響，考慮到A(溫度)、B(pH)、C(料液比)、D(酶解時間)和E(加酶量)這五個因素對指標(biāo)的影響，每個因素設(shè)定四個水平進(jìn)行L₁₆(4⁵)的正交實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較五種酶在不同水解條件下的水解度和抗腫瘤活性，從而確定原料的最佳酶種及最佳的酶解條件。酶解工藝如下：首先將保存在-80℃的沙蠶解凍后進(jìn)行勻漿，用0.1mol/L的HCL和0.5mol/L的NaOH溶液將勻漿液調(diào)到蛋白酶最適pH值，再加入適量蛋白酶，在水浴鍋中進(jìn)行酶解。酶解完成后，在100℃中滅活10min，使蛋白酶失去活性。將酶解液12000r/min離心15min，取上清液測定氨基氮(ANN)含量，將其余酶解液冷凍干燥后測定酶解物的抗腫瘤活性。

1.3.1.1最佳蛋白酶種類的選擇

通過上述正交試驗(yàn)結(jié)果可知，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶五種蛋白酶酶解沙蠶的最佳酶解條件，在上述最佳酶解條件下，分別對沙蠶進(jìn)行酶解，12000r/min條件下離心得上清液，冷凍干燥后測定各種蛋白酶酶解物的IR值選擇最佳蛋白酶。

1.3.1.2沙蠶多肽的制備

將沙蠶全體洗干凈后進(jìn)行勻漿，按照最佳蛋白酶的最佳酶解條件對沙蠶進(jìn)行酶解。酶解結(jié)束后在100℃下在水浴中滅活10min。冷卻后在12000r/min在冷凍高速離心機(jī)中離心15min后收集上清液，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.3酶解多肽的初步分離

酶解獲得的上清液用超濾系統(tǒng)進(jìn)行超濾分離，獲得了分子量1ku以下、1ku<分子量≤3ku、3ku<分子量≤5ku、5ku<分子量≤8ku以及8ku<分子量≤30ku的五種組分的活性組分，并命名為PAP-1、PAP-2、PAP-3、PAP-4、PAP-5。將以上組分收集冷凍干燥后，經(jīng)抗肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖抑制活性篩選后，大量收集抗肺癌活性較高的組分，濃縮冷凍干燥，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.4沙蠶多肽經(jīng)過陰離子交換柱DEAE Sepharose Fast Flow層析分離

將1.3.1.3步中得到的抑制肺癌細(xì)胞A549增殖活性最強(qiáng)的組分用陰離子柱DEAE Sepharose Fast Flow進(jìn)一步分離。分離條件：0.2mM的Tris-HCl(pH 7.2)緩沖溶液平衡柱子后，將樣品配成250mg/mL，每次上樣量為2mL，每次上樣前過0.22μm的膜。分別用Tris-HCl(pH 7.2)與NaCl溶液(0～1mol/L)進(jìn)行梯度洗脫，每個濃度洗脫一個柱體積，洗脫速度為5mL/min，在280nm進(jìn)行檢測，分別收集各洗脫峰，并冷凍干燥，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將干燥后得到的各個峰組分采用MTT法進(jìn)行A549細(xì)胞增殖抑制率測定，確定目標(biāo)肽所在的洗脫峰，并對該峰大量收集，冷凍干燥，作為進(jìn)一步分離純化所用樣品。

1.3.1.5沙蠶多肽經(jīng)過葡聚糖凝膠Sephadex G-25層析分離

將上步中收集到的增殖活性最強(qiáng)的組分進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。將冷凍干燥的樣品配置成200mg/mL溶液，上樣量2mL。離心取上清液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，將溶液過Sephadex G-25柱進(jìn)行層析分離，以蒸餾水為洗脫液將柱平衡和洗脫；調(diào)節(jié)洗脫流速為1.1mL/min，每管收集3.5min，在280nm處檢測吸光度，收集各峰分的洗脫液，將其進(jìn)行濃縮冷凍干燥。將干燥后得到的各個峰組分采用MTT法進(jìn)行A549細(xì)胞增殖抑制率測定，確定目標(biāo)肽所在的洗脫峰，并對該峰大量收集，濃縮冷凍干燥，-20℃冰箱中冷凍備用。

1.3.1.6高效液相分離純化

將上步抑制A549細(xì)胞增殖最強(qiáng)的收集的峰分進(jìn)一步的分離純化，反相高效液相純化色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-C18分析型色譜柱(填料粒徑5μm 4.6×150mm)；檢測波長：280nm；流速：0.5mL/min；流動相A為乙腈(含0.05％三氟乙酸)，流動相B為超純水(含0.05％三氟乙酸)，采用梯度洗脫方式(20％～100％A洗脫5～20min)，平衡時：流動相A與流動相B的流動相體積比為20：80；柱溫：25℃；自動進(jìn)樣，進(jìn)樣量：10μL。

1.3.1.7目標(biāo)肽的N端測序

使用氨基酸測序儀采用N端氨基酸測序法對純化的多肽的氨基酸序列進(jìn)行測定，最終以PAP命名該活性多肽。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)

將肺癌細(xì)胞A549和H1299在含有雙抗溶液(青霉素100IU/mL、鏈霉素100IU/mL)以及10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。置于37℃、含有5％CO₂的培養(yǎng)箱中孵育，待長滿80％以上時用含0.25％的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3抗肺癌細(xì)胞活性檢測

1.3.3.1 MTT法測定細(xì)胞抑制活性

配制實(shí)驗(yàn)所需要的PBS緩沖液(PH值為7.2)、MTT、適量濃度的沙蠶酶解液。將人肺癌細(xì)胞每孔1×10⁵個/mL細(xì)胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔培養(yǎng)液200μL。常規(guī)條件下培養(yǎng)24小時后，分別設(shè)置正常對照組、空白對照組和用藥組，每組設(shè)定3～4個復(fù)孔，置常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)一段時間，加入含有10％MTT的200μL的PBS緩沖溶液，在常規(guī)培養(yǎng)條件下孵育4小時。實(shí)驗(yàn)畢，棄去96孔板中的液體，每孔加入150μL的DMSO，充分震蕩10min。置于酶標(biāo)儀中，490nm處測定吸光值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(IR)，計(jì)算公式如下：

式中：A₁為正常對照組的吸光度；A₂為用藥組的吸光度；A₀為空白對照組的吸光度。

1.3.3.2倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

將濃度約為1×10⁵/mL的肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞接種于六孔板的載玻片上，在常規(guī)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞長到80％左右。棄去培養(yǎng)液，按250mg/L、500mg/L、1000mg/L的藥物濃度加入到六孔板中，并設(shè)立空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。1.3.3.3 AO/EB熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞接種與實(shí)驗(yàn)分組同上。24h后，取蓋玻片，用95％乙醇固定30min。取AO和EB各1mg分別溶解于10mL pH 7.2的PBS緩沖液中，搖勻混合，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存。觀察前于載玻片上滴加50μL PBS和6μL AO/EB混合液，有細(xì)胞的一面朝下，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3.4 Hoechst 33258染色

通過Hoechst 33258熒光染色法觀察細(xì)胞的凋亡過程中細(xì)胞的形態(tài)變化，實(shí)驗(yàn)操作步驟如下所述，選取對數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞株A549和H1299細(xì)胞制成約為1×10⁵/mL個單細(xì)胞懸液，均勻接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔約2mL，放置于37℃、5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)條件下24h，分別給予不同濃度的250mg/L、500mg/L和1000mg/L作用細(xì)胞，另外設(shè)置實(shí)驗(yàn)空白對照組，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。24h后終止對各組細(xì)胞的培養(yǎng)，每孔中給予4％多聚甲醛固定20min，然后再用PBS沖洗，用Hoechst 33258熒光染液(終濃度為0.5～10mg/L)常溫染色15min，再次用PBS沖洗，最后置于倒置熒光顯微鏡下觀察PAP作用后的A549和H1299細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化并拍照。1.3.3.5流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率

A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞約為1×10⁵/mL接種于25mL的培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)24h后分別加入含250mg/L、500mg/L和1000mg/L的PAP的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，設(shè)立空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，參照凋亡試劑盒中的操作方法進(jìn)行。胰蛋白酶消化，預(yù)冷的PBS懸浮細(xì)胞，1000r/min離心5min。去上清，加入1×Annexin V結(jié)合液400μL吹打混勻。加入5μL Annexin V-FITC染液，混勻后避光孵育15min后，再加入10μL的PI染液，室溫下暗室靜置5min后過200目篩子，再用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3.3.6細(xì)胞線粒體膜電位的檢測

A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞約為1×10⁵/mL接種在25mL的培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)24h后加入分別含250mg/L、500mg/L和1000mg/L的PAP的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，設(shè)立空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，細(xì)胞膜電位檢測參照試劑盒中的操作方法進(jìn)行。培養(yǎng)結(jié)束，胰酶消化細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中，再用3mL PBS洗滌細(xì)胞兩次，1000r/min離心5min，收集細(xì)胞；取500μL 1×Incubation Buffer，加1μL的JC-1；吸取500μL的JC-1工作液將細(xì)胞懸浮，放置于37℃、5％CO₂條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20min；1500r/min離心5min并收集細(xì)胞，用1×Incubation Buffer懸浮細(xì)胞，重復(fù)兩次；最后將用1×Incubation Buffer懸浮均勻的細(xì)胞過200目篩子，置于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.3.4數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以x±s表示。

2結(jié)果與分析

2.1最佳蛋白酶種類的選擇

Trypsin(胰蛋白酶)、Papain(木瓜蛋白酶)、Alcalase(堿性蛋白酶)、Dispase(中性蛋白酶)和Pepsin(胃蛋白酶)五種蛋白酶在最佳酶解條件下，分別對沙蠶進(jìn)行酶解，12000r/min條件下離心15min得上清液，冷凍干燥后測定各種蛋白酶酶解物的IR值，結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，Trypsin(胰蛋白酶)、Papain(木瓜蛋白酶)、Alcalase(堿性蛋白酶)、Dispase(中性蛋白酶)和Pepsin(胃蛋白酶)五種蛋白酶酶解物對H1299細(xì)胞增殖的抑制率分別為56.67％、46.29％、62.07％、47.78％、60.51％，其活性大小順序?yàn)椋篈lcalase＞Pepsin＞Trypsin＞Dispase＞Papain。由此可見，在最佳酶解條件下，堿性蛋白酶酶解物的抗肺癌的活性最強(qiáng)。

胰蛋白酶的最佳酶解條件為溫度為45℃、pH值為9、料液比為1:3、酶解時間為4h、加酶量為300U/g。木瓜蛋白酶的最佳酶解條件為：溫度為55℃、pH值為7、料液比為1:2、酶解時間為4h、加酶量為300U/g。中性蛋白酶的最佳酶解條件為：溫度為45℃、pH值為8、料液比為1:1、酶解時間為6h、加酶量為900U/g。胃蛋白酶的最佳酶解條件為：溫度為35℃、pH值為1、料液比為1:1、酶解時間為8h、加酶量為300U/g。

2.1.1堿性蛋白酶正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以溫度、pH值、料液比、時間和加酶量為因素，以ANN和IR值為測量指標(biāo)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，考查了堿性蛋白酶酶解物在不同酶解條件下的水解程度和抗腫瘤活性，其結(jié)果如表3。

表1堿性蛋白酶正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果L₁₆(4⁵)

利用極差法對表1進(jìn)行分析，比較極差R的大小可以看出，影響ANN值的的各因素的主次關(guān)系為：A＞B＞C＞E＞D。對于ANN值影響最大的因素是A(溫度)；此時的最佳酶解條件為A₂B₂C₂D₃E₃，即為：溫度為40℃、pH值為9、料液比為1:2、酶解時間為6h、加酶量為900U/g。

影響IR值的的各因素的主次關(guān)系為：C＞E＞A＞B＞D。對于IR值影響最大的因素是C(料液比)；此時的最佳酶解條件為A₄B₄C₁D₃E₁，即為：溫度為50℃、pH值為11、料液比為1:1、酶解時間為6h、加酶量為300U/g。

2.2沙蠶多肽的分離純化

2.2.1沙蠶多肽的超濾截留

將堿性蛋白酶酶解獲得的沙蠶多肽經(jīng)超濾得到五個組分PAP-1、PAP-2、PAP-3、PAP-4、PAP-5。采用MTT法得到對A549細(xì)胞的IR值，結(jié)果如圖2所示，PAP-2對A549細(xì)胞的增殖抑制率最高。故選定PAP-2進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。

2.2.2 DEAE Sepharose Fast Flow分離結(jié)果

將上述步驟得到的PAP-2經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow分離得到PAP-2-1、PAP-2-2、PAP-2-3、PAP-2-4四個洗脫峰如下圖3所示，以2000mg/L的濃度作用于A549細(xì)胞24h后的IR為14.1±2.7％、24.3±3％、41.9±1.5％、46.7±5.0％；4000mg/L對A549細(xì)胞的IR值則為28.0±3.0％、49.6±2.2％、79.3±4.1％、77.3±1.8％。故選定PAP-2-3進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。

2.2.3 Sephadex G-25分離結(jié)果

將上述步驟得到的PAP-2-3經(jīng)Sephadex G-25分離得到PAP-2-3-1、PAP-2-3-2兩個洗脫峰如圖4所示，采用MTT法檢測對A549細(xì)胞的抑制活性。結(jié)果顯示當(dāng)兩個峰的濃度為1000mg/L時，兩個峰的IR值分別是48.2±3.3％，74.4±2.4％；2000mg/L時，IR值分別為75.9±2.1％，95.1±1.8％。峰ⅡPAP-2-3-2的活性最高，故用高效液相色譜儀將峰PAP-2-3-2進(jìn)一步的分離純化。

2.2.4活性肽的純化及其N端氨基酸檢測結(jié)果

PAP-2-3-2經(jīng)反相高效液相色譜洗脫純化，當(dāng)洗脫時間分別為：4.296min、4.584min、4.968min、5.602min、6.075min時，出現(xiàn)如圖5所示的峰Ⅰ、峰Ⅱ、峰Ⅲ、峰Ⅳ、峰V四個洗脫峰，收集峰V(PAP)，冷凍干燥備用。經(jīng)檢測，該目標(biāo)肽的氮端氨基酸序列是Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe(SEQ ID No.1)。

2.3抗肺癌細(xì)胞活性研究

2.3.1PAP對A549細(xì)胞活性的影響

不同濃度PAP作用后對A549和H1299細(xì)胞活性的影響如圖6，圖7所示，當(dāng)PAP濃度為250mg/L作用細(xì)胞24h時，A549和H1299細(xì)胞活性的抑制率分別為17.02％和13.08％，當(dāng)PAP濃度增加至1000mg/L時，抑制率分別達(dá)到83.44％和85.3％，半數(shù)抑制濃度率(IC₅₀)分別為662mg/L、665mg/L；隨著作用時間的延長，作用48h時，IC₅₀分別為571mg/L、561mg/L；作用72h時，IC₅₀分別為487mg/L、486mg/L。隨著PAP濃度的增加和作用時間的延長，抑制指數(shù)明顯上升，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3.2倒置顯微鏡下觀察結(jié)果

結(jié)果如圖8、9所示，正常組的A549和H1299細(xì)胞生長良好，細(xì)胞間排列緊密，形態(tài)飽滿。PAP作用24h后，如250mg/L組A549和H1299細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞間隙增大，輪廓模糊，形態(tài)不規(guī)則；高濃度1000mg/L組細(xì)胞變圓變亮，形態(tài)和正常細(xì)胞有明顯的區(qū)別，同時可見在培養(yǎng)液中懸浮著較多的死細(xì)胞。

2.3.3 AO/EB熒光觀察結(jié)果觀察細(xì)胞形態(tài)

PAP作用于A549和H1299細(xì)胞24h后，細(xì)胞經(jīng)AO/EB染色，出現(xiàn)了明顯的早期凋亡的形態(tài)學(xué)特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10、11所示，正常對照組無明顯凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，細(xì)胞大小均勻，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，胞核及胞漿均呈現(xiàn)綠色熒光；250mg/L組細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡的現(xiàn)象，胞質(zhì)及胞核發(fā)生了變化，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，并呈現(xiàn)強(qiáng)黃綠色熒光。隨著用藥濃度的增加，1000mg/L組早期凋亡的細(xì)胞和晚期凋亡的細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞核呈固縮狀，呈現(xiàn)橘紅色熒光。

2.3.4 Hoechst 33258染色檢測結(jié)果

Hoechst 33258染色可以用來觀察沙蠶多肽對肺癌細(xì)胞A549和細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。如圖12、13所示，當(dāng)不同濃度的沙蠶多肽作用于A549和H1299細(xì)胞24h后，可以看到空白對照組呈現(xiàn)均勻的藍(lán)色熒光，沙蠶多肽作用后，可以看見細(xì)胞的染色質(zhì)聚集及邊集化明顯，而且藍(lán)色的熒光變亮，細(xì)胞核斷裂皺縮呈現(xiàn)出塊狀或點(diǎn)狀的藍(lán)色熒光，視野中細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化隨著藥物濃度的增加也顯得越明顯。

2.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用Annexin V-FITC/PI雙染的方法檢測細(xì)胞早期凋亡率。以FITC和PI熒光作雙參數(shù)點(diǎn)圖，細(xì)胞分成4個區(qū)：左下象限(LL)代表正常細(xì)胞；左上象限(UL)代表機(jī)械損傷細(xì)胞；右下象限(LR)為早期凋亡細(xì)胞；右上象限(UR)為凋亡晚期或壞死細(xì)胞。如圖14所示，對照組A549細(xì)胞基本分布在LL區(qū)域，早期凋亡率為7.52％，但以不同濃度的PAP作用后，早期凋亡細(xì)胞明顯增多，當(dāng)PAP濃度達(dá)到1000mg/L時，早期凋亡率達(dá)到33.44％。從圖15中可見，加以不同濃度的PAP作用于H1299細(xì)胞24h后，LR早區(qū)域的早期凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，隨用藥濃度的增加，H1299細(xì)胞的早期凋亡率也隨之增加。當(dāng)PH濃度達(dá)到1000mg/L時，細(xì)胞早期凋亡率達(dá)到44.42％。

2.3.6細(xì)胞中線粒體膜電位的變化結(jié)果

細(xì)胞內(nèi)線粒體對JC-1染料的攝取依賴于線粒體的膜電位，正常情況下A549細(xì)胞線粒體的膜電位比較高，呈現(xiàn)出紅色熒光。當(dāng)細(xì)胞受到損傷后，線粒體的膜電位就會下降，出現(xiàn)由紅色熒光向綠色熒光的轉(zhuǎn)變。當(dāng)PAP作用A549細(xì)胞24h后，如圖16所示，右上象限表示為正常線粒體膜電位所占細(xì)胞的百分率，右下象限則為線粒體膜電位降低的細(xì)胞百分率。如實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，250mg/L組可使4.91％的細(xì)胞呈綠色熒光(即膜電位降低)，500mg/L、1000mg/L組分別可使12.91％、26.69％的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。當(dāng)PAP作用H1299細(xì)胞24h后，如圖17所示，250mg/L組可使8.58％的細(xì)胞呈綠色熒光(即膜電位降低)，500mg/L、1000mg/L組分別可使11.51％、22.69％的細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。

3討論

本發(fā)明使用了胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶五種酶，以細(xì)胞增殖抑制率IR為指標(biāo)，確定沙蠶多肽的最佳蛋白酶是堿性蛋白酶。為確定堿性蛋白酶的適宜酶解條件范圍，試驗(yàn)以酶解物ANN含量為指標(biāo)，對每個因素分別進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。通過L₁₆(4⁵)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝，得到沙蠶多肽的關(guān)鍵技術(shù)是溫度為50℃、pH值為11、料液比為1:1、酶解時間為6h、氨基酸序列為Ile-Glu-Pro-Gly-Thr-Val-Gly-Met-Met-Phe。

本發(fā)明采用MTT法對PAP對A549和H1299細(xì)胞的增殖抑制活性進(jìn)行了檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沙蠶多肽對于A549和H1299細(xì)胞的抑制活性具有時間和劑量依賴關(guān)系，即隨著PAP濃度的增加和時間的延長，細(xì)胞的抑制率明顯上升。當(dāng)濃度為1000mg/L的PAP作用于A549細(xì)胞72h后，IR值達(dá)到95.08％，IC₅₀為487mg/L；作用于H1299細(xì)胞72h后，IR值達(dá)到91.36％，IC₅₀為486mg/L。

細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上的特征性改變是證明其發(fā)生凋亡的有力證據(jù)。通過倒置顯微鏡、熒光染色實(shí)驗(yàn)的變化可以很直觀地看到細(xì)胞早期凋亡的形態(tài)學(xué)上變化。在本發(fā)明中，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)，觀察到PAP作用后，A549和H1299細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞間隙變大、形態(tài)不規(guī)則、體積變小、部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡及凋亡小體等，隨濃度增加效果更加顯著。

細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的高度保守的細(xì)胞主動死亡過程，在多細(xì)胞有機(jī)體的生長發(fā)育、維持組織同源性等過程中起重要作用。線粒體膜電位下降是凋亡的早期表現(xiàn)，一旦線粒體膜電位損耗,細(xì)胞就會進(jìn)入不可逆的凋亡過程。通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞的早期凋亡率和細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位進(jìn)行檢查發(fā)現(xiàn)，250mg/L的PAP作用于肺癌細(xì)胞A549 24h后，早期凋亡率7.52％，線粒體膜電位出現(xiàn)小幅下降，而1000mg/L的PAP作用后凋亡率達(dá)到33.44％，下降率達(dá)到26.69％。250mg/L的PAP作用于肺癌細(xì)胞H1299 24h后，早期凋亡率4.18％，線粒體膜電位出現(xiàn)小幅下降，而1000mg/L的PAP作用后凋亡率達(dá)到39.95％，下降率達(dá)到22.91％。細(xì)胞的早期凋亡率和，線粒體膜電位下降所占百分率都隨藥物作用濃度增加明顯增加，由此推測肺癌細(xì)胞A549和H1299的凋亡與線粒體凋亡信號通路有關(guān)。

總之，經(jīng)堿性蛋白酶提取的沙蠶多肽PAP在體外可以有效抑制A549和H1299細(xì)胞的增殖，并具有劑量和時間依賴性，作用24h后A549和H1299細(xì)胞即表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞凋亡特征。

以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋大學(xué)

<120> 一種雙齒圍沙蠶抗肺癌多肽的制備方法

<130> 2016.11

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 雙齒圍沙蠶

<400> 1

Ile Glu Pro Gly Thr Val Gly Met Met Phe

1 5 10