本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種斑重唇魚線粒體基因組全序列擴增方法。
背景技術(shù)：
斑重唇魚Diptychus maculates Steindachner，又名斑黃瓜魚，隸屬于鯉科Cyprinidae，裂腹魚亞科Schizothoracinae，重唇魚屬Diptychus，為冷水雜食性魚類，常棲息于有沙礫的河流及山間支流中。斑重唇魚具有懷卵量少、生殖力較低、生長速度緩慢、性成熟晚等繁殖生物學(xué)特性，一旦過度捕撈，資源將難以恢復(fù)。近年來由于受到環(huán)境變化和人類活動影響，斑重唇魚分布區(qū)域正在逐漸縮小，種群數(shù)量急劇下降，已被列為新疆維吾爾自治區(qū)II級水生野生保護動物。關(guān)于斑重唇魚的研究，多集中于繁殖生物學(xué)和資源生物學(xué)領(lǐng)域，而采用分子生物學(xué)技術(shù)對斑重唇魚的研究不多，且多集中在線粒體部分序列的比較研究，關(guān)于其線粒體基因組全序列擴增的方法未見報道?？紤]到目前斑重唇魚遺傳學(xué)尤其是線粒體基因組方面的信息量有限，開展其線粒體基因組全序列的研究就顯得十分必要。
目前擴增線粒體基因組全序列的方法大多采用引物步移法，即參考同源序列在保守區(qū)設(shè)計引物擴增序列并測序，在測出的序列兩端繼續(xù)設(shè)計引物并擴增測序，如此循環(huán)重復(fù)，最后將獲得的序列片段進行拼接，獲得線粒體全序列。為保證準(zhǔn)確性和可讀性，常規(guī)PCR每次擴增序列長度在500-600bp左右，而脊椎動物線粒體基因組多在15kb以上，因此至少需要設(shè)計20-30多對引物進行擴增，這種方法不僅費時費力，而且在后期凌亂的序列拼接過程中也容易出現(xiàn)錯誤。而本專利涉及的LA-PCR方法，具有擴增片段長、高保真性等特點，采用該方法對斑重唇線粒體基因組進行擴增國內(nèi)尚屬首次。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種斑重唇魚線粒體基因組全序列擴增方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
本發(fā)明提供的斑重唇魚線粒體基因組全序列擴增方法包括以下步驟：
(1)斑重唇魚線粒體Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因片段的擴增.
(2)斑重唇魚線粒體基因組的LA-PCR擴增。
所述的斑重唇魚線粒體基因組Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因片段的擴增方法，包括以下幾個步驟：
(1)用于擴增Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因片段引物的篩選，選取了擴增Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因的引物分別為：
Cyt b：上游引物為5’-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3’，下游引物為5’-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3’；
COI：上游引物為5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’下游引物為5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’；
ND4：上游引物為5’-GCKTTTTCTGCKTGTGARGC-3’下游引物為5’–CAAGAGTTTTTGGTTCCTAA-3’；
16S rRNA：上游引物為5’-CGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT-3’，下游引物為5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’。
(2)四個基因片段擴增的PCR反應(yīng)：反應(yīng)總體系為50μL，其中10×buffer 5.0μL，Mg2+終濃度為2.0mM，dNTP(2.5mM)4μL，Taq聚合酶2units，引物(10μM)各2μL，斑重唇魚基因組DNA 2μL(1μg)，加滅菌水至終體積50μL。
PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，然后是35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性45s，57℃(Cyt b和16S rRNA)、54℃(COI)、56℃(ND4)退火45s，72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min。
(3)瓊脂糖凝膠電泳檢測：稱量0.7g瓊脂糖加入70mL 1×TAE緩沖液的錐形瓶中，微波爐加熱至瓊脂粉完全溶解且無泡沫，冷卻至50-60℃左右加入7μL核酸染料Gelview，輕輕搖勻避免產(chǎn)生氣泡。待冷卻至不燙手時將膠緩緩倒入膠槽內(nèi)，待瓊脂糖凝膠完全凝固后豎直拔掉梳子，將2μL斑重唇魚DNA樣本與0.5μL 6×DNA loading buffer混合后依次上樣，最后點上6μL DL2000Marker后開始電泳。電泳電壓設(shè)定為120V，電流400mA，時間30min。電泳完畢在凝膠成像系統(tǒng)照相，通過調(diào)節(jié)光圈和曝光時間，選擇合適的濾光片，得到成像清晰、背景較低的照片。
所述的斑重唇魚線粒體基因組的LA-PCR擴增。包括以下幾個步驟：
(1)斑重唇魚線粒體基因組的LA-PCR擴增引物的設(shè)計：以獲得的Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因序列片段為模板，在其兩端分別設(shè)計4對LA-PCR引物，用于擴增斑重唇魚線粒體基因組剩余部分序列；
以16S rRNA基因片段為起點、COI基因片段為終點的環(huán)形區(qū)域設(shè)計第一對引物P1，上游引物為5’-GCAACAAGACCAAGTAGAACCCAC-3’，下游引物為5’-CAGGATTGATGATACACCCGCTAG-3’；
以COI基因片段為起點、ND4基因片段為終點的環(huán)形區(qū)域設(shè)計第二對引物P2，上游引物為5’-ATTGGAGCCCCAGACATAGCATTC-3’，下游引物為5’-AGCACAAGGAAGCCTCGGACTTTA-3’；
以ND4基因片段為起點、Cyt b基因片段為終點的環(huán)形區(qū)域設(shè)計第三對引物P3，上游引物為5’-CGCTGCGGTATGGTGATTCGT-3’，下游引物為5’-ATGATGCTCCGTTGGCGTGTA-3’；
以Cyt b基因片段為起點、16S rRNA基因片段為終點的環(huán)形區(qū)域設(shè)計第四對引物P4，上游引物為5’-TGACCTACCAGCACCATCCAACAT-3’，下游引物為5’-GACAGTTAAGCCCTCGTTTAGCCA-3’。
(2)根據(jù)設(shè)計的4對LA-PCR引物擴增斑重唇魚線粒體基因組全序列，使用寶生物工程(大連)有限公司的LA Taq聚合酶；
LA-PCR反應(yīng)：反應(yīng)總體系為50μL，其中10×LA PCR buffer II 5.0μL，Mg2+終濃度為2.0mM，dNTP(2.5mM)8μL，LA Taq聚合酶2units，引物(20μM)各1μL，斑重唇魚基因組DNA2.5ng(50ng/μL)，加滅菌水至終體積50μL。
LA-PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min，然后是30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30s，57℃(P1)、60℃(P2)、58℃(P3)、59℃(P4)退火30s，72℃延伸4(P1)、6(P2)、3(P3)、5(P4)min，最后72℃再延伸10min。
4對LA-PCR引物擴增分別獲得目的序列片段長度分別為4kb、6kb、3.1kb和4.5kb。
(3)采用引物步移法，分別以擴增的4個大片段序列為模板，每隔大約500bp左右，設(shè)計一條測序引物對其進行分段擴增，28條測序引物序列信息如下：
以16S rRNA基因片段為起點、COI基因片段為終點的環(huán)形區(qū)域6條測序引物為：
5’-TCAACGAACCAAGTTACCCT-3’
5’-TACGGGCTTCTACAACCTAT-3’
5’-GCCCCTTCGCACTATTTTTC-3’
5’-GGAACCACTTTGACTTTTGC-3’
5’-CCACCTTACACTGCTTGCCC-3’
5’-GTGAAAATCTTCTAGCCCCT-3’
以COI基因片段為起點、ND4基因片段為終點的環(huán)形區(qū)域10條測序引物為：
5’-CGGCAAAAAAGAACCATTCG-3’
5’-GCCTATGCCCTATGAAACAC-3’
5’-GTGAACTATTTTACCAGCCG-3’
5’-AAAGATTGGTGCCTCCCGAC-3’
5’-CCGTGATTATTGGAATGCGA-3’
5’-CGTGACATTATCCGAGAAGG-3’
5’-CCACTTTACATCTGACCACC-3’
5’-AGGGAGTTAGTCCAAAGCAA-3’
5’-CACCCCTCTTTTAGTGCTCT-3’
5’-TAGCAGCGGTCCTACTAAAG-3’
以ND4基因片段為起點、Cyt b基因片段為終點的環(huán)形區(qū)域5條測序引物為：
5’-CACCTCCCTCCTCGTAGTTT-3’
5’-TCGGGTAGGGGACATTGGAT-3’
5’-GTAAGATGGGAGGCTTGTTT-3’
5’-GGCTTCTTTCCCTCAACTAT-3’
5’-GCAAAGACTACCAACATTCC-3’
以Cyt b基因片段為起點、16S rRNA基因片段為終點的環(huán)形區(qū)域7條測序引物為：
5’-TTGGATTGAACTCGGACGCA-3’
5’-AAGCATCGGTCTTGTAATCC-3’
5’-CCAAAGCCAGGATTCTGAAC-3’
5’-GGCTCAAATACTGACTAAGG-3’
5’-GCTCTAACCCGACTTACACA-3’
5’-CCCGTCTAACCTCACCACTT-3’
5’-GTATGGGAGACAGAAAAGGT-3’。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明擴增了斑重唇魚線粒體Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因片段，根據(jù)獲得序列設(shè)計了4對LA-PCR引物進行大片段序列擴增，然后通過引物步移的方法，用28條測序引物對斑重唇魚線粒體基因組其余部分進行PCR擴增從而獲得斑重唇魚長度為16895bp的線粒體全基因組序列。從分子水平研究斑重唇魚的遺傳與進化，特別是以mtDNA作為分子標(biāo)記，為斑重唇魚物種鑒定、群體遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)演化研究提供了基礎(chǔ)資料和技術(shù)支持。
具體實施方式
下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1
本實施例提供的斑重唇魚線粒體基因組全序列擴增方法包括以下步驟：
(1)斑重唇魚線粒體Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因片段的擴增。
(2)斑重唇魚線粒體基因組的LA-PCR擴增。
所述的斑重唇魚線粒體基因組Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因片段的擴增方法，包括以下幾個步驟：
(1)用于擴增Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因片段引物的篩選，選取了擴增Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因的引物分別為：
Cyt b：上游引物為5’-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3’，下游引物為5’-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3’；
COI：上游引物為5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’下游引物為5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’；
ND4：上游引物為5’-GCKTTTTCTGCKTGTGARGC-3’下游引物為5’–CAAGAGTTTTTGGTTCCTAA-3’；
16S rRNA：上游引物為5’-CGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT-3’，下游引物為5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’。
(2)四個基因片段擴增的PCR反應(yīng)：反應(yīng)總體系為50μL，其中10×buffer 5.0μL，Mg2+終濃度為2.0mM，dNTP(2.5mM)4μL，Taq聚合酶2units，引物(10μM)各2μL，斑重唇魚基因組DNA 2μL(1μg)，加滅菌水至終體積50μL。
PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，然后是35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性45s，57℃(Cyt b和16S rRNA)、54℃(COI)、56℃(ND4)退火45s，72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min。
(3)瓊脂糖凝膠電泳檢測：稱量0.7g瓊脂糖加入70mL 1×TAE緩沖液的錐形瓶中，微波爐加熱至瓊脂粉完全溶解且無泡沫，冷卻至50-60℃左右加入7μL核酸染料Gelview，輕輕搖勻避免產(chǎn)生氣泡。待冷卻至不燙手時將膠緩緩倒入膠槽內(nèi)，待瓊脂糖凝膠完全凝固后豎直拔掉梳子，將2μL斑重唇魚DNA樣本與0.5μL 6×DNA loading buffer混合后依次上樣，最后點上6μL DL2000Marker后開始電泳。電泳電壓設(shè)定為120V，電流400mA，時間30min。電泳完畢在凝膠成像系統(tǒng)照相，通過調(diào)節(jié)光圈和曝光時間，選擇合適的濾光片，得到成像清晰、背景較低的照片。
所述的斑重唇魚線粒體基因組的LA-PCR擴增。包括以下幾個步驟：
(1)斑重唇魚線粒體基因組的LA-PCR擴增引物的設(shè)計：以獲得的Cyt b、COI、ND4和16S rRNA四個基因序列片段為模板，在其兩端分別設(shè)計4對LA-PCR引物，用于擴增斑重唇魚線粒體基因組剩余部分序列；
以16S rRNA基因片段為起點、COI基因片段為終點的環(huán)形區(qū)域設(shè)計第一對引物P1，上游引物為5’-GCAACAAGACCAAGTAGAACCCAC-3’，下游引物為5’-CAGGATTGATGATACACCCGCTAG-3’；
以COI基因片段為起點、ND4基因片段為終點的環(huán)形區(qū)域設(shè)計第二對引物P2，上游引物為5’-ATTGGAGCCCCAGACATAGCATTC-3’，下游引物為5’-AGCACAAGGAAGCCTCGGACTTTA-3’；
以ND4基因片段為起點、Cyt b基因片段為終點的環(huán)形區(qū)域設(shè)計第三對引物P3，上游引物為5’-CGCTGCGGTATGGTGATTCGT-3’，下游引物為5’-ATGATGCTCCGTTGGCGTGTA-3’；
以Cyt b基因片段為起點、16S rRNA基因片段為終點的環(huán)形區(qū)域設(shè)計第四對引物P4，上游引物為5’-TGACCTACCAGCACCATCCAACAT-3’，下游引物為5’-GACAGTTAAGCCCTCGTTTAGCCA-3’。
(2)根據(jù)設(shè)計的4對LA-PCR引物擴增斑重唇魚線粒體基因組全序列，使用寶生物工程(大連)有限公司的LA Taq聚合酶；
LA-PCR反應(yīng)：反應(yīng)總體系為50μL，其中10×LA PCR buffer II 5.0μL，Mg2+終濃度為2.0mM，dNTP(2.5mM)8μL，LA Taq聚合酶2units，引物(20μM)各1μL，斑重唇魚基因組DNA 2.5ng(50ng/μL)，加滅菌水至終體積50μL。
LA-PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min，然后是30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30s，57℃(P1)、60℃(P2)、58℃(P3)、59℃(P4)退火30s，72℃延伸4(P1)、6(P2)、3(P3)、5(P4)min，最后72℃再延伸10min。
4對LA-PCR引物擴增分別獲得目的序列片段長度分別為4kb、6kb、3.1kb和4.5kb。
(3)采用引物步移法，分別以擴增的4個大片段序列為模板，每隔大約500bp左右，設(shè)計一條測序引物對其進行分段擴增，28條測序引物序列信息如下：
以16S rRNA基因片段為起點、COI基因片段為終點的環(huán)形區(qū)域6條測序引物為：
5’-TCAACGAACCAAGTTACCCT-3’
5’-TACGGGCTTCTACAACCTAT-3’
5’-GCCCCTTCGCACTATTTTTC-3’
5’-GGAACCACTTTGACTTTTGC-3’
5’-CCACCTTACACTGCTTGCCC-3’
5’-GTGAAAATCTTCTAGCCCCT-3’
以COI基因片段為起點、ND4基因片段為終點的環(huán)形區(qū)域10條測序引物為：
5’-CGGCAAAAAAGAACCATTCG-3’
5’-GCCTATGCCCTATGAAACAC-3’
5’-GTGAACTATTTTACCAGCCG-3’
5’-AAAGATTGGTGCCTCCCGAC-3’
5’-CCGTGATTATTGGAATGCGA-3’
5’-CGTGACATTATCCGAGAAGG-3’
5’-CCACTTTACATCTGACCACC-3’
5’-AGGGAGTTAGTCCAAAGCAA-3’
5’-CACCCCTCTTTTAGTGCTCT-3’
5’-TAGCAGCGGTCCTACTAAAG-3’
以ND4基因片段為起點、Cyt b基因片段為終點的環(huán)形區(qū)域5條測序引物為：
5’-CACCTCCCTCCTCGTAGTTT-3’
5’-TCGGGTAGGGGACATTGGAT-3’
5’-GTAAGATGGGAGGCTTGTTT-3’
5’-GGCTTCTTTCCCTCAACTAT-3’
5’-GCAAAGACTACCAACATTCC-3’
以Cyt b基因片段為起點、16S rRNA基因片段為終點的環(huán)形區(qū)域7條測序引物為：
5’-TTGGATTGAACTCGGACGCA-3’
5’-AAGCATCGGTCTTGTAATCC-3’
5’-CCAAAGCCAGGATTCTGAAC-3’
5’-GGCTCAAATACTGACTAAGG-3’
5’-GCTCTAACCCGACTTACACA-3’
5’-CCCGTCTAACCTCACCACTT-3’
5’-GTATGGGAGACAGAAAAGGT-3’。
通過本實施例提供的方法，獲得的斑重唇魚線粒體基因組結(jié)構(gòu)如下：
斑重唇魚線粒體基因組全序列序列表如下：
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋大學(xué)
<120> 一種斑重唇魚線粒體基因組全序列擴增方法
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Cyt b：上游引物
<400> 1
GACTTGAAAAACCACCGTTG 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Cyt b：下游引物
<400> 2
CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC 23
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> COI：上游引物
<400> 3
TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> COI：下游引物
<400> 4
TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA 26
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> ND4：上游引物
<400> 5
GCKTTTTCTGCKTGTGARGC 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> ND4：下游引物
<400> 6
CAAGAGTTTTTGGTTCCTAA 20
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> 16S rRNA：上游引物
<400> 7
CGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCT 25
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> 16S rRNA：下游引物
<400> 8
CCGGTCTGAACTCAGATCACGT 22