本發(fā)明本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫學(xué)、基因工程領(lǐng)域，涉及一種全人源化抗狂犬病毒的中和性抗體。

背景技術(shù)：

狂犬病被動(dòng)免疫制劑能夠中和傷口局部的狂犬病毒，阻止病毒擴(kuò)散并侵入神經(jīng)系統(tǒng)，其半衰期長(zhǎng)達(dá)14～21天，能夠有效發(fā)揮治療或緊急預(yù)防狂犬病的作用。

最早應(yīng)用狂犬病被動(dòng)免疫制劑治愈患者的例子可以追溯到1891年，但是在幾十年后人類才生產(chǎn)出第一個(gè)商品化的人用抗狂犬病免疫血清。這種人用抗狂犬病免疫血清來(lái)源于馬，由于為異源性血清，使用后不良反應(yīng)可高達(dá)40％以上。目前市場(chǎng)上主要產(chǎn)品還是馬源抗狂犬病血清球蛋白(ERIG)，雖然為降低ERIG不良反應(yīng)改進(jìn)了生產(chǎn)工藝，但是其仍存在明顯的副反應(yīng)，且對(duì)某些疫苗的抗體反應(yīng)有抑制作用。針對(duì)這一問(wèn)題，美國(guó)免疫實(shí)踐咨詢委員會(huì)(ACIP)建議選用人源抗狂犬病血清球蛋白(HRIG)。由于HRIG來(lái)源于人而受到極大的限制，且存在潛在的病原污染風(fēng)險(xiǎn)，臨床應(yīng)用也受到了極大地限制。事實(shí)上在狂犬病毒流行地區(qū)尤其是狂犬病高發(fā)的發(fā)展中國(guó)家，無(wú)論是HRIG還是ERIG均遠(yuǎn)遠(yuǎn)無(wú)法滿足市場(chǎng)需求，因此尋找可靠的RIG替代品是目前研究的首要目標(biāo)。

應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)開(kāi)發(fā)抗狂犬病病毒特異性的單克隆抗體(monoclonal antibodies，mAbs)防治狂犬病可以克服多抗血清的諸多弊端，應(yīng)用前景廣闊。1978年首次通過(guò)B淋巴細(xì)胞雜交瘤單克隆抗體技術(shù)獲得了能夠保護(hù)動(dòng)物抵抗致死性狂犬病毒攻擊的抗狂犬病毒mAbs，此后多種抗狂犬病毒mAbs相繼問(wèn)世。2007年，Muhamuda等獲得了中和滴度及蛋白活性高于市場(chǎng)上的ERIG2000倍的鼠源性抗狂犬病毒mAbs，有望進(jìn)一步研究以應(yīng)用于人群暴露后預(yù)防。目前有部分抗狂犬病病毒特異性的mAbs進(jìn)入臨床研究階段的報(bào)道，但至今仍沒(méi)有藥物被批準(zhǔn)上市。

隨著抗體技術(shù)的發(fā)展，制備抗體的方法已由多克隆抗體技術(shù)和單克隆抗體技術(shù)，發(fā)展為基因工程抗體技術(shù)?；蚬こ炭贵w以其對(duì)人體毒副作用小、人源化和高度特異性，越來(lái)越顯示其優(yōu)勢(shì)。針對(duì)狂犬病毒糖蛋白的單克隆抗體Mab57是目前研究最為深入的人源雜交瘤單克隆抗體。但早期的基因工程抗體也存在不可忽視的缺點(diǎn)，如基因取自雜交瘤細(xì)胞，生產(chǎn)抗體的流程復(fù)雜，嵌合抗體和人源化抗體不能完全解決HAMA反應(yīng)，難以對(duì)抗體進(jìn)行改造獲得高親和力抗體等。Mab57因而一直未能完成臨床前研究。隨著人源抗體的技術(shù)的開(kāi)發(fā)，如噬菌體展示、核糖體展示、酵母展示或是使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)生的具有人免疫球蛋白基因的小鼠均能獲得高親和力人源抗體。

近些年，越來(lái)越多的研究者在基因工程抗體的研究中通過(guò)從人B細(xì)胞中篩選抗體的方法，獲得全人源的單克隆抗體。由于這些抗體是在人體內(nèi)自然產(chǎn)生的，在安全性、有效性和與人類疾病的相關(guān)性都體現(xiàn)了巨大的優(yōu)勢(shì)。噬菌體抗體庫(kù)、B細(xì)胞永生化和單細(xì)胞克隆表達(dá)是3種目前常用的從B細(xì)胞中獲得全人源單克隆抗體的方法。隨著研究的繼續(xù)和深入，各種新型抗狂犬被動(dòng)免疫制劑的商品化生產(chǎn)將成為可能，人源或全人源單克隆抗體有望很快用于臨床治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一，提供一種全人源的抗狂犬病毒的單克隆抗體。

本發(fā)明的目的之二，提供一種治療狂犬病的藥物組合物和手段。

本發(fā)明的目的之三，提供一種檢測(cè)狂犬病毒的工具和手段。

本發(fā)明目的之四，提供一種診斷狂犬病的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種抗狂犬病毒的單克隆抗體TRN079，其特征在于，所述單克隆抗體包括輕鏈CDR1-3和重鏈CDR1-3氨基酸序列；

所述輕鏈CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述輕鏈CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述輕鏈CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述重鏈CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述重鏈CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；

所述重鏈CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

進(jìn)一步，所述抗體輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

進(jìn)一步，所述抗體重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

進(jìn)一步，所述抗體分子選自具有全長(zhǎng)重鏈和輕鏈的完整抗體分子或其片段。

本發(fā)明提供了一種上述單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：

(1)獲得具有編碼上述抗體的DNA分子；

(2)將步驟(1)所述的DNA分子與表達(dá)載體相連，構(gòu)建重組表達(dá)載體；

(3)將步驟(2)的重組表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后，表達(dá)，純化，即得。

本發(fā)明中抗體分子可僅包含重鏈或輕鏈多肽，在這種情況下，僅需將重鏈或輕鏈多肽編碼序列用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。對(duì)于產(chǎn)生包含重鏈和輕鏈的產(chǎn)物，可使用兩種載體(編碼輕鏈多肽的第一載體以及編碼重鏈多肽的第二載體)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系?；蛘?，可使用單一載體，載體包括編碼重鏈和輕鏈多肽的序列。

本發(fā)明提供了一種分離的DNA序列，所述DNA序列編碼上述所述的抗體的重鏈和/或輕鏈。

本發(fā)明提供了一種克隆或表達(dá)載體，所述克隆或表達(dá)載體包含一種或多種DNA序列，所述DNA序列編碼上述所述的抗體的重鏈和/或輕鏈。

本發(fā)明提供了上述單克隆抗體在制備用于檢測(cè)狂犬病毒的工具中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述工具包括試劑盒、試紙、芯片等。其中，所述芯片包括蛋白質(zhì)芯片；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的上述單克隆抗體；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括上述單克隆抗體。

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)狂犬病毒的工具，所述工具包含上面所述的單克隆抗體。

本發(fā)明提供了上面所述的單克隆抗體在制備治療和/或預(yù)防狂犬病的藥物組合物中的用途。

本發(fā)明提供了一種制備上述抗體的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)分離狂犬病毒陽(yáng)性患者血清的靜脈血中的單個(gè)核細(xì)胞，之后利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞分選，分選出單個(gè)記憶性B細(xì)胞；

(2)利用單細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增步驟(1)獲得的單個(gè)B細(xì)胞中的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的核苷酸片段；

(3)將步驟(2)獲得的抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的核苷酸片段融合到含有人類抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中構(gòu)建重組表達(dá)載體；

(4)將步驟(3)的重組表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞后表達(dá)、純化，獲得具有結(jié)合活性和中和活性的本發(fā)明的全人源抗狂犬病毒的單克隆中和抗體。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)狂犬病毒的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)獲取樣品；

(2)將步驟(1)獲得的樣品處理后與權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的抗體反應(yīng)；

(3)檢測(cè)樣品與抗體的中和效應(yīng)。

本發(fā)明中“單克隆抗體”指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的過(guò)程中可能產(chǎn)生的可能變體外，此類變體一般以極小量存在。此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過(guò)包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過(guò)程得到的。

克隆抗體在本發(fā)明中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性。

“完整抗體”在本發(fā)明中指包含兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)及Fc區(qū)的抗體。優(yōu)選的是，完整抗體具有功能性Fc區(qū)。

“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)²和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。

本發(fā)明還包括將上述抗體的氨基酸序列通過(guò)對(duì)氨基酸殘基的添加、刪除、修改形成所得到的包括人源與非人源抗體，并具有與TRN079抗體相同功能或改造及優(yōu)化的一切抗體。

本發(fā)明的CDR可包括變體，例如當(dāng)將本文中所公開(kāi)的CDR回復(fù)突變?yōu)椴煌目蚣軈^(qū)時(shí)。通常，個(gè)體變體CDR與本文所述序列的氨基酸同一性為至少70％或80％，更典型地具有優(yōu)選至少75％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和幾乎100％的漸增的同一性。

通常，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。

可利用取代、缺失、插入或其任意組合來(lái)實(shí)現(xiàn)最終的衍生物或變體。通常，這些變化在幾個(gè)氨基酸上進(jìn)行以使分子的改變最小化，特別是抗原結(jié)合蛋白的免疫原性和特異性。然而，在某些情況下可以容忍更大的變化。氨基酸取代通常是單個(gè)堿基的；插入通常將為大約一個(gè)至大約二十個(gè)氨基酸殘基的數(shù)量級(jí)，雖然可能容忍顯著更大的插入。缺失的范圍為大約一個(gè)至大約二十個(gè)氨基酸殘基，雖然在一些情況下，缺失可以大得多。

通常，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。

在本發(fā)明中，“框架”指除去被定義為CDR的那些區(qū)域之外的抗體可變結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。每個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域框架可被進(jìn)一步細(xì)分為由CDR分隔的連續(xù)區(qū)域(FRl、FR2、FR3和FR4)。

本發(fā)明的抗體包括在單克隆抗體TRN079或其CDR移植的抗體片段上利用單點(diǎn)突變或多點(diǎn)組合突變對(duì)抗體恒定區(qū)/CDR區(qū)部分氨基酸/進(jìn)行改造及優(yōu)化后的抗體片段或scFv抗體。

本發(fā)明提供了一種全新的全人源的抗狂犬病毒單克隆抗體，該抗體特異性強(qiáng)、中和效果好、無(wú)免疫原性。

附圖說(shuō)明

圖1顯示淋巴細(xì)胞分離單個(gè)的B細(xì)胞的分選結(jié)果；

圖2顯示利用SDS-PAGE鑒定表達(dá)純化后的TRN079抗體；

圖3顯示利用ELISA檢測(cè)TRN079抗體的結(jié)合活性。

具體的實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1淋巴細(xì)胞分離與單個(gè)記憶性B細(xì)胞分選

一、材料：

1.試劑：狂犬病疫苗(諾華，批號(hào)：1928)。Ficoll淋巴細(xì)胞分離液為Cedarlane公司產(chǎn)品。CD3-APC、CD14-APC、CD16-PE、CD20-APC、CD27-PE、IgD-FITC等均為Invirogen公司產(chǎn)品等。

二、方法結(jié)果

1.狂犬病疫苗的志愿者免疫

選擇2例接種狂犬病疫苗的25歲健康志愿者，第7、21d時(shí)分別加強(qiáng)接種一次，28dIgG定量檢測(cè)為陽(yáng)性結(jié)果；抽取其外周血100mL，抗凝。

2.淋巴細(xì)胞分離與單個(gè)記憶性B細(xì)胞分選

將100mL血樣用Ficoll分離，吸取單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)層懸液，用PBS洗滌3次，吸棄上清。設(shè)置單染管：加AqVd-AmCyan、CD3-PE-Cy5、IgD-PE、CD14-FITC、CD20-APC、CD4-APC-H7，進(jìn)行補(bǔ)償調(diào)節(jié)，樣本管中加入AqVd-AmCyan、CD3-PE-Cy5、CD16-PE-Cy5、CD235a-PE-Cy5、CD14-FITC、IgD-PE、CD20-APC、CD27-APC-H7，室溫避光靜置30min，用PBS洗滌2次后加入500μL PBS吹打混勻。樣本置流式細(xì)胞儀上，依次選取P1(淋巴細(xì)胞門(mén)SSC-A/FSC-A)→P2(去粘連SSC-W/SSC-H)→P3(去粘連FSC-W/FSC-H)→P4(活細(xì)胞AqVd-AmCyan-)→P5(CD3-/CD14-/CD16-/CD235a-)→P6(IgD-/CD20+)→P7(IgD-/CD27ALL)。選擇P7門(mén)的細(xì)胞，將96孔PCR板(每孔20uL單細(xì)胞裂解液)置于收集倉(cāng)內(nèi)，設(shè)置分選single cell模式，每個(gè)孔分選單個(gè)的B細(xì)胞于PCR板孔中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，分選出目標(biāo)所需的單個(gè)的B細(xì)胞。

實(shí)施例2單B細(xì)胞RT-PCR分離抗體可變區(qū)基因

一、材料

1.試劑：引物(Invitrogen合成)，Superscript III反轉(zhuǎn)錄酶、HotStarTaq Plus酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)等。

二、方法結(jié)果

1.單B細(xì)胞RT-PCR(合成cDNA第一條鏈)

將含有單個(gè)B細(xì)胞的96孔板加入0.5uM的各亞型重鏈與輕鏈的恒定區(qū)引物與Superscript III反轉(zhuǎn)錄酶，37℃孵育1小時(shí)；按以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃15min；95℃1min，55℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃5min。產(chǎn)物cDNA-20℃保存。

2.Nest-PCR(分離抗體基因)

每個(gè)單細(xì)胞分別擴(kuò)增重鏈、輕鏈序列。50uL體系中含有5uL的RT反應(yīng)產(chǎn)物，HotStarTaq Plus酶，dNTPs，及0.5uM的各亞型重鏈與輕鏈抗體的特異性引物，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5min，然后進(jìn)行35個(gè)PCR循環(huán)：95℃×30s，55℃×60s，72℃×90s，最后用72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

實(shí)施例3PCR產(chǎn)物克隆鑒定和抗體表達(dá)

一、材料

1.試劑：瓊脂糖、Tris，LB、氨芐青霉素，PolyFect(Qiagen,Valencia,CA)，F(xiàn)CS、DMEM、PBS等。

2.載體：pcDNA3.3載體

3.菌株：大腸桿菌DH5α

二、方法結(jié)果

1.PCR產(chǎn)物純化克隆鑒定

取2μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段約400bp。將凝膠電泳鑒定為陽(yáng)性，且重鏈與輕鏈可匹配成對(duì)的抗體可變區(qū)基因PCR產(chǎn)物利用TA克隆的方法連接到pcDNA3.3載體上(已經(jīng)改造并含有抗體leader與恒定區(qū))，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌中，在含有氨芐青霉素的平板上37℃培養(yǎng)過(guò)夜，隨即挑取10個(gè)單菌落用特異性引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min40s，28個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸5min。取5μLPCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，在陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中鑒定出了含有抗體重鏈或輕鏈基因的轉(zhuǎn)化子。

2.抗體表達(dá)

將表達(dá)陽(yáng)性抗體重鏈和輕鏈基因的質(zhì)粒在大腸桿菌DH5α中大量擴(kuò)增，進(jìn)行重組質(zhì)?？焖偬崛　Ｔ赥75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中用轉(zhuǎn)染試劑PolyFect共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，具體操作參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)染后6-8小時(shí)換含有2％FCS新鮮培養(yǎng)基，并在37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，收集細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)施例4表達(dá)抗體的篩選檢測(cè)

一、材料

1.疫苗：狂犬疫苗(諾華公司，瑞士)

2.試劑：IgG抗體，BSA，PBST，硫酸鈉，丙酮等。

3.病毒：TCID₅₀狂犬病毒(CVS株)。

二、方法

1.表達(dá)產(chǎn)物的篩選(ELISA)

以狂犬疫苗為抗原，并用包被液將抗原10倍稀釋后包被96孔ELISA板，每孔100μL 4℃過(guò)夜包被，PBST洗滌3次，每孔加150μL5％BSA常溫封閉2個(gè)小時(shí)，再次用PBST洗滌。加入100μL的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染上清作為一抗常溫孵育2個(gè)小時(shí)，用HRP標(biāo)記的羊抗人IgG(1:2000稀釋)作為二抗常溫孵育1個(gè)小時(shí)，加入底物顯色液100μL/孔，常溫避光放置5min后，用2M硫酸鈉中止反應(yīng)，用450nm/630nm波長(zhǎng)進(jìn)行比色。OD₄₅₀＞0.1且實(shí)驗(yàn)孔OD₄₅₀＞2倍陰性對(duì)照孔OD₄₅₀即判定陽(yáng)性。

2.快速熒光灶抑制(RFFIT)檢測(cè)

將ELISA篩選到的有結(jié)合活性的抗體，用WHO推薦的快速熒光灶抑制實(shí)驗(yàn)法(RFFIT)檢測(cè)抗體與狂犬病毒的中和活性，陽(yáng)性對(duì)照為商業(yè)化抗狂犬病毒血清標(biāo)準(zhǔn)品(240IU/mL)。將系列稀釋的抗體及抗病毒血清標(biāo)準(zhǔn)品與100TCID₅₀狂犬病毒(CVS株)于96孔培養(yǎng)板中混均，37℃孵育1小時(shí)，然后加入BSR細(xì)胞，放37℃培養(yǎng)24小時(shí)，于48小時(shí)進(jìn)行染色觀察。PBS洗兩次，加入80％丙酮，4℃孵育15min后，PBS洗一次晾干后，每孔加入100μLFITC標(biāo)記的抗體。37℃孵育1h，PBS洗2次，熒光顯微鏡藍(lán)色激光激發(fā)觀察。根據(jù)Reed&Muench法計(jì)算抗體保護(hù)效價(jià)(單位為IU/ml)。

三、結(jié)果

抗體TRN079(3.8mg/ml)的保護(hù)效價(jià)約為2400IU/ml，表明表達(dá)的重組抗體TRN079具有高純度的狂犬病毒中和活性。

實(shí)施例5抗體大量表達(dá)與純化

一、材料

1.試劑：PolyFect(Qiagen)，F(xiàn)CS、DMEM、PBS，Protein-A親和層析柱(Amersham)，SDS-PAGE電泳試劑盒(Invitrogen)，低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，溴酚藍(lán)，考馬斯亮藍(lán)R250。

二、方法結(jié)果

1.抗體大量表達(dá)與純化

將TRN079抗體重鏈與輕鏈的表達(dá)載體用PolyFect(Qiagen)轉(zhuǎn)染試劑盒共轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)于175cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6-8小時(shí)換含有2％FCS新鮮培養(yǎng)基，并在37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。收集轉(zhuǎn)染上清，4000rpm離心1小時(shí)，采用Amersham公司的Protein-A親和層析柱直接純化表達(dá)上清。

2.SDS-PAGE檢驗(yàn)

利用SDS-PAGE檢驗(yàn)抗體TRN079的表達(dá)及純化情況。

三、結(jié)果

SDS-PAGE結(jié)果如圖2所示，解鏈后的抗體輕、重鏈清晰可見(jiàn)。

實(shí)施例6TRN079抗體的活性檢驗(yàn)

一、材料

1.試劑：IgG抗體，BSA，Biacore偶聯(lián)試劑盒等。

2.動(dòng)物：昆明小鼠(10-12g)

3.載體：載體pcDN A3.1

二、方法結(jié)果

1.ELISA測(cè)定結(jié)合活性

用前文提到的相同的ELISA方法對(duì)表達(dá)純化的抗體的結(jié)合活性進(jìn)行檢測(cè)：以狂犬疫苗為抗原，并用包被液將抗原10倍稀釋后包被ELISA 96孔板，每孔100uL 4℃過(guò)夜包被，并用封閉液常溫封閉2個(gè)小時(shí)。將起始濃度為100,ug/mlTRN079抗體上清稀釋10倍后作為一抗進(jìn)行系列稀釋，加一抗常溫孵育2個(gè)小時(shí)，同時(shí)用未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清作為陰性抗體對(duì)照，用HRP標(biāo)記的羊抗人IgG(1:2000稀釋)作為二抗常溫孵育1個(gè)小時(shí)，加入底物顯色液100μl/孔，常溫避光放置5min后，用2M硫酸鈉中止反應(yīng)，用450nm/630nm波長(zhǎng)進(jìn)行比色。

結(jié)果如圖3所示，表明把表達(dá)純化的抗體TRN079進(jìn)行大于50，000倍稀釋后(抗體濃度約為：0.0024μg/ml)，TRN079抗體依然可以與抗原有結(jié)合。

2.小鼠體內(nèi)中和試驗(yàn)

用WHO推薦的小鼠中和試驗(yàn)(MNT)檢測(cè)純化抗體與狂犬病毒的抗感染能力，陽(yáng)性對(duì)照為商業(yè)化抗狂犬病毒血清標(biāo)準(zhǔn)品(240IU/mL)。將系列稀釋抗體(TRN079)及抗病毒血清標(biāo)準(zhǔn)品與等體積中和毒(100LD50/mL)37℃中和1小時(shí)后，顱內(nèi)注射10-12g昆明幼鼠，0.03mL/只，每個(gè)抗體稀釋度攻擊6只，共注射8個(gè)稀釋度。逐日觀察并于第4天后記錄小鼠發(fā)病及死亡數(shù)至第14天。在攻擊后4天內(nèi)死亡的小鼠為非特異性死亡，應(yīng)剔除不計(jì)。根據(jù)Reed&Muench法計(jì)算樣品的效價(jià)。

結(jié)果表明抗體TRN079(3.8mg/ml)其保護(hù)效價(jià)約為2400IU/ml，說(shuō)明表達(dá)的重組抗體TRN079是高純度的具有狂犬病毒中和活性的全人源單克隆抗體。

3.TRN079抗體親和力測(cè)定

先進(jìn)行CM5芯片偶聯(lián)捕獲分子，再活化芯片的葡聚糖表面，以進(jìn)樣時(shí)間確定偶聯(lián)量。最后利用CM5芯片捕獲分子捕獲配體：將制備的全人源抗狂犬病病毒中和抗體作為配體，以計(jì)算得到的信號(hào)值確定單抗的進(jìn)樣濃度及接觸時(shí)間。單抗與狂犬病病毒G蛋白(抗原)結(jié)合的親和力和動(dòng)力學(xué)分析：狂犬病病毒G蛋白用HBS-EP緩沖液稀釋作為分析物，分析物以逐漸增高的濃度依次流過(guò)芯片，分別得到信號(hào)曲線。每個(gè)濃度作為1個(gè)循環(huán)，完成1次循環(huán)后用10mmol/L的甘氨酸－鹽酸再生芯片以回復(fù)到原始未結(jié)合抗原的狀態(tài)。用BiaCore X-100System軟件進(jìn)行分析。

結(jié)果顯示，TRN079抗體的親和力可達(dá)10^-8mol數(shù)量級(jí)。

上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣州泰諾迪生物科技有限公司 暨南大學(xué)

珠海泰諾麥博生物技術(shù)有限公司

<120> 全人源化抗狂犬病毒的中和性抗體

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> 人源

<400> 1

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Phe Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Gln Gly Ile Arg Asn Asp

1 5

<210> 3

<211> 3

<212> PRT

<213> 人源

<400> 3

Ala Ala Ser

1

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人源

<400> 4

Gln Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 5

<211> 119

<212> PRT

<213> 人源

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Phe Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Tyr Glu Gly Ser Thr Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Ala

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Ile Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人源

<400> 6

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人源

<400> 7

Ile Ser Tyr Glu Gly Ser Thr Lys

1 5

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人源

<400> 8

Ala Lys Gly Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10