本發(fā)明涉及一種中藥提取物，具體涉及一種從枸杞中提取分離得到的具有抗氧化活性的精制多糖及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

枸杞系落葉灌木，果實(shí)枸杞子味甘、性平，有滋腎補(bǔ)髓、養(yǎng)肝明目和祛風(fēng)的作用，是傳統(tǒng)滋補(bǔ)中藥。枸杞多糖(LBP,Lycium Bar-barum Polysaccharides)是枸杞中重要的有效成分，是研究最多的化學(xué)成分之一，具有很好的醫(yī)藥和保健價(jià)值。醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)表明，枸杞多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、降血糖、抗腫瘤等作用。近年來，枸杞多糖已經(jīng)在臨床和保健食品方面有很大應(yīng)用。

抗氧化是枸杞多糖的一大藥理作用，且枸杞多糖的諸多藥效都與抗氧化相關(guān)。已有研究表明，枸杞多糖在心血管系統(tǒng)、肝臟、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等方面具有相應(yīng)的抗氧化作用。因其作用多樣性，枸杞多糖的抗氧化在當(dāng)今研究中亦非常熱門，例如ABTS法測抗氧化、羥基自由基清除率測定、DPPH自由基清除活性測驗(yàn)等。其中羥基自由基是一種重要的活性氧，其具有極強(qiáng)的得電子能力也就是氧化能力，而多糖顯著的抗氧化能力也吸引著很多人研究其對羥基自由基的清除率，目前已有一些專利報(bào)道表明了粗多糖對羥基自由基有明顯的清除效果。

但是關(guān)于枸杞多糖的進(jìn)一步純化和精制未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過大量實(shí)驗(yàn)篩選出枸杞精制多糖的制備方法。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種具有抗氧化活性的枸杞精制多糖的制備方法，包括以下步驟：

(1)枸杞精制多糖的提取粗制：

取枸杞加無水乙醇回流進(jìn)行脫脂，過濾，取脫脂后濾渣，加入超純水回流提取，取回流提取液，濃縮，濃縮液加乙醇，靜置過夜；分離得沉淀物，干燥，得粗多糖；

(2)枸杞精制多糖的脫色脫蛋白：

取步驟(1)制備好的粗多糖，加入體積比為1：1的丙酮-石油醚混合液，在55～65℃回流脫色1～2h，然后過濾得沉淀，烘干，得到脫色的枸杞粗多糖；

取脫色的枸杞粗多糖，加水稀釋成糖液置于分液漏斗中，加入三氯甲烷和正丁醇的混合溶液，反復(fù)震搖，然后離心收集上層糖液；重復(fù)操作以上步驟直至分液漏斗下層無明顯沉淀析出，然后烘干得脫色脫蛋白枸杞精制多糖；

(3)枸杞精制多糖的分離純化：

取步驟(2)脫色脫蛋白枸杞精制多糖溶于蒸餾水中，加樣于Cellulose DE－52色譜柱中，先后依次用蒸餾水、0.25mol/LNaCl、2mol/LNaCl和蒸餾水洗脫，流速為2mL/min，分步收集洗脫液，將收集的洗脫液濃縮后置于透析袋中，放置冰箱里透析，然后取透析袋中多糖，濃縮，凍干，保存；

(4)枸杞精制多糖的酶解：

取步驟(3)得到的多糖，加入α-淀粉酶，加熱酶解，得到酶解多糖；

(5)枸杞精制多糖的再分離純化：

取步驟(4)得到的酶解多糖，上樣于Sephadex G－100凝膠色譜柱，用蒸餾水洗脫，分段收集洗脫液，并用苯酚-硫酸法跟蹤檢測每份洗脫液的糖含量，用酶標(biāo)儀檢測595nm處吸收值，最后根據(jù)吸收值繪制總洗脫曲線，收集合并多糖洗脫液，濃縮，凍干，得具有抗氧化活性的枸杞精制多糖。

作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗氧化活性的枸杞精制多糖的制備方法，

步驟(2)枸杞精制多糖的脫色脫蛋白：

取步驟(1)制備好的粗多糖，按重量體積比1：10加入體積比為1：1的丙酮-石油醚混合液，在55℃回流脫色1.5h，然后過濾得沉淀，烘干，得到脫色的枸杞粗多糖；

取脫色的枸杞粗多糖，加水配制2％濃度的糖液于分液漏斗中，加入糖液1/5體積的三氯甲烷和糖液1/25體積的正丁醇，反復(fù)震搖10min，然后于高速離心機(jī)中，以4℃，3500RPM離心15min；收集上層糖液，需要反復(fù)10～15次，直至分液漏斗下層無明顯沉淀析出，烘干得脫色脫蛋白枸杞精制多糖。

作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗氧化活性的枸杞精制多糖的制備方法，步驟(3)枸杞精制多糖的分離純化：

取步驟(2)脫色脫蛋白枸杞精制多糖溶于蒸餾水中，加樣于Cellulose DE－52色譜柱中，先后依次用蒸餾水、0.25mol/LNaCl、2mol/LNaCl和蒸餾水洗脫，流速為2mL/min，收集0.25mol/LNaCl洗脫下來的酸性多糖，將酸性多糖洗脫液濃縮后置于透析袋中，放置于4℃冰箱里透析72h，然后取透析袋中多糖，濃縮，凍干。

作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗氧化活性的枸杞精制多糖的制備方法，步驟(4)枸杞精制多糖的酶解：

取步驟(3)得到的多糖，加入α-淀粉酶溶液，先加熱至在50℃水解1.5小時(shí)，然后升溫至80℃水解20～30min，得到酶解多糖。

本發(fā)明制備得到的具有抗氧化活性的枸杞精制多糖在制備抗氧化保健品或藥品中的應(yīng)用。

可將本發(fā)明提供的枸杞精制多糖和藥學(xué)上可接受的載體制備成顆粒劑、片劑、膠囊劑、丸劑或口服液等制劑。

有益效果：本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)篩選出最佳的枸杞精制多糖的制備工藝，方法包含枸杞多糖的提取粗制、枸杞多糖的脫色脫蛋白、枸杞多糖的分離純化、枸杞多糖的酶解、枸杞多糖的再分離純化等步驟，制備得到的枸杞多糖經(jīng)過ABTS法測抗氧化、羥基自由基清除率測定、DPPH自由基清除活性等測驗(yàn)表明，本發(fā)明制備得到的枸杞精制多糖具有很好的抗氧化活性，尤其對羥基自由基清除有顯著效果。

附圖說明

圖1為各實(shí)驗(yàn)組ABTS法測總抗氧化曲線圖；

圖2為各實(shí)驗(yàn)組羥基自由基清除率曲線圖；

圖3為各實(shí)驗(yàn)組DPPH自由基清除率曲線圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例1

一種具有抗氧化活性的枸杞精制多糖的制備方法，包括以下步驟：

(1)將枸杞以每100g加入300ml體積濃度80％乙醇回流水浴(80℃)2h，過濾取濾渣，重復(fù)2次。而后向?yàn)V渣中以每100g加入1000ml超純水回流水浴(100℃)2h，過濾取濾液，重復(fù)1次，并合并濾液。將濾液濃縮至總體積的五分之一，用乙醇醇沉并靜置過夜，取沉淀物，而后用乙醇、丙酮充分脫水，最后置于烘箱中干燥若干小時(shí)得粗多糖。

(2)枸杞多糖的脫色：

取步驟(1)制備好的粗多糖，按比例1：10(W：V)加入丙酮-石油醚(以1：1體積比混合)混合液，于55℃回流脫色1.5h，過濾得沉淀，于真空干燥箱內(nèi)烘干，得到脫色的枸杞粗多糖。

枸杞多糖的脫蛋白：

取脫色的枸杞粗多糖，加水配制2％濃度的糖液于分液漏斗中，加入1/5體積的三氯甲烷，1/25體積的正丁醇，反復(fù)震搖10min，然后于高速離心機(jī)中，以4℃，3500RPM離心15min。收集上層糖液，反復(fù)14次以上，直至下層無明顯沉淀析出。用BCA法測蛋白質(zhì)含量，與原液進(jìn)行比較。

(3)枸杞多糖的分離純化：

取脫蛋白枸杞粗多糖粉末溶于蒸餾水中，硫酸-苯酚法測量其糖含量，根據(jù)柱體積計(jì)算上樣量。然后加樣于Cellulose DE－52色譜柱中，洗脫液先后依次為蒸餾水、0.25mol/LNaCl、2mol/LNaCl、蒸餾水，流速為2mL/min，分步收集洗脫液，每管約收集洗脫液10mL，用苯酚-硫酸法跟蹤檢測每一管的糖含量，用酶標(biāo)儀檢測595nm處吸收值，最后根據(jù)吸收值繪制總洗脫曲線，收集0.25mol/LNaCl洗脫下來的酸性多糖，將收集的洗脫液濃縮至適當(dāng)體積并置于透析袋中放置在4℃冰箱里透析72h，每天換水三次，濃縮，凍干保存。

(4)枸杞多糖的酶解：

取步驟(3)得到的多糖，分別加入α-淀粉酶溶液溶液，然后先加熱至在50℃水解1.5小時(shí)，然后升溫至80℃水解30min，分別得到α-淀粉酶的酶解多糖。

α-淀粉酶溶液的制備：稱取10mgα-淀粉酶溶解于10ml 0.2M PH6.9PBS緩沖液(PBS制備：0.312g磷酸二氫鈉溶于10ml水中得A液，0.12g磷酸氫二鈉溶于10ml水中得B液，A液4.5ml+B液5.5ml混勻)；

(5)枸杞多糖的再分離純化：

分別取α-淀粉酶酶解多糖，用硫酸苯酚法測其糖含量，計(jì)算其上樣量后，上樣于Sephadex G－100凝膠色譜柱，將洗脫液蒸餾水置于超聲波清洗機(jī)中脫氣，然后用其洗脫，流速為0.5mL/min，分步收集洗脫液，每管約收集2mL，用苯酚-硫酸法跟蹤檢測每一管的糖含量，用酶標(biāo)儀檢測595nm處吸收值，最后根據(jù)吸收值繪制總洗脫曲線，收集合并多糖洗脫液，濃縮，凍干，得具有抗氧化活性的枸杞精制多糖。

實(shí)施例2ABTS法測總抗氧化

總抗氧化能力檢驗(yàn)試劑盒(ABTS法)中一共包括三種試劑-ABTS溶液、氧化劑溶液和Trolox溶液(10mM),其中ABTS溶液和氧化劑溶液分別為1ml，Trolox溶液(10mM)為0.5ml。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

(1)ABTS工作液的配制：通過參考說明書，根據(jù)待測樣品的數(shù)量，各取ABTS溶液和氧化劑溶液100μl混合均勻即為ABTS工作母液(綠色)室溫存放12-16h后即可使用，此時(shí)還不能直接使用，需要用PBS稀釋一定的倍數(shù)，使得ABTS工作液的吸光度減去PBS的空白吸光度后A734在0.65-0.75之間，通過實(shí)驗(yàn)，稀釋35倍后吸光度在適合范圍之內(nèi)，此時(shí)的ABTS溶液即可作為工作液來使用；

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：用PBS將原Trolox溶液(10mM)分別稀釋成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM；

(3)樣品準(zhǔn)備:

精密稱取待測樣品：實(shí)施例1得到的精制多糖(α+C)和實(shí)施例1步驟(1)制備得到的枸杞粗多糖(C)溶解于適量超純水中，再稀釋至所需濃度。

基本步驟：

(1)使用96孔板，在每個(gè)檢測孔中加200μl ABTS工作液；

(2)空白對照孔中加入10μl PBS，標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測孔中依次加入不同濃度的Trolox溶液10μl，樣品檢測孔中依次加入不同濃度的樣品溶液，加完樣后輕輕搖勻；

(3)室溫放置2-6min后測定A734，平行測定兩次取平均值

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，本發(fā)明精制多糖均在極少量含量下具備抗氧化能力，且隨濃度提高，清除率提高。

實(shí)施例3羥基自由基清除率測定：

在反應(yīng)體系中分別加入100μl9mM硫酸亞鐵溶液、100μl9mM水楊酸-乙醇溶液和100μl待測樣品溶液(實(shí)施例1得到的精制多糖α+C和實(shí)施例1步驟(1)制備得到的枸杞粗多糖C)，最后加入8.8mM雙氧水啟動(dòng)反應(yīng)，混合均勻后于37℃水浴60min，水浴完取出于510nm處測得吸光度A，空白孔中將待測樣品改成水，其他條件都不變，510nm處測吸光度A0，由于多糖本身也具有吸光度，所以在實(shí)驗(yàn)過程中檢測了每個(gè)樣品相應(yīng)的對照孔，在孔內(nèi)分別加入不同濃度的樣品以及8.8mM H₂O₂、9mM的硫酸亞鐵、9mM水楊酸-乙醇溶液等體積的超純水作為對照，測得510nm處的吸光度Ax。

樣品對羥基自由基的清除率用以下公式表示：R(％)＝[1-(A-Ax)/A0]*100％

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，檢測得出本發(fā)明制備得到的精制多糖與粗多糖相比自由基清除率效果大大提高，其抗氧化活性大大提高，在含量很低的情況下即可達(dá)到100％的清除率，顯示出了非常好的抗氧化活性。

實(shí)施例4DPPH自由基清除活性試驗(yàn)：

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

(1)0.4mMDPPH溶液配制：精密稱取0.0158gDPPH粉末于100ml容量瓶中，加入95％乙醇至容量瓶刻度，充分溶解，溶解完全之后分裝到離心管中，并用鋁箔紙包裝密封好，放于4℃冰箱中避光保存，待用；

(2)待測樣品溶液的配制：精密稱取待測樣品(實(shí)施例1得到的精制多糖α+C)溶解于適量超純水中，再稀釋至所需濃度。

加樣表

DPPH組、樣品組、空白組所測得的吸光度分別表示為A1、A2、A0

樣品對DPPH自由基的清除率用以下公式表示：R(％)＝[1-(A2-A0)/A1]*100％

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，本發(fā)明精制多糖對于DPPH自由基有很好的清除作用。

以上實(shí)施方式只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人了解本發(fā)明內(nèi)容并加以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所做的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。