本發(fā)明涉及一種鑒定雞細(xì)小病毒的特異引物組合及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

雞細(xì)小病毒(Chincken parvovirus，ChPV)是引起雞腸道疾病重要的病原體之一，可以引起以腹瀉、精神抑郁、體溫調(diào)節(jié)障礙、生長(zhǎng)遲緩、增加飼料消耗等為特征的急性或慢性腸道性疾病、矮小綜合癥、營(yíng)養(yǎng)不良綜合癥。ChPV在雞群中普遍存在，主要侵害雛雞，其中以商品肉雞感染率較高、蛋雞或種雞次之。自2010年以來(lái)，北美、波蘭、匈牙利、克羅地亞、巴西、南韓等國(guó)家相繼暴發(fā)了該病，給養(yǎng)雞業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，但是，在中國(guó)尚未有雞細(xì)小病毒流行病學(xué)調(diào)查的報(bào)道。因此，建立ChPV的快速檢測(cè)方法，是有效防制我國(guó)ChPV的技術(shù)保障。

目前，鑒定病毒的方法主要依靠傳統(tǒng)的病毒分離、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和ELISA等，這些方法通常具有耗時(shí)費(fèi)力且敏感性不高等弊端。巢式PCR，又稱套式PCR，使用2對(duì)PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，巢式PCR的第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似，第二對(duì)引物稱為巢式引物，結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的優(yōu)點(diǎn)在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片段，通過(guò)第二次引物的配對(duì)擴(kuò)增降低錯(cuò)誤的擴(kuò)增，因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常的特異。同時(shí)，由于第一次擴(kuò)增是對(duì)模板進(jìn)行放大，因此巢式PCR要比常規(guī)PCR檢測(cè)的敏感性要高。目前尚未有關(guān)于建立ChPV半巢式PCR檢測(cè)方法的研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種鑒定雞細(xì)小病毒的特異引物組合及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種引物組合，包括引物ChPV-F1和引物ChPV-R；所述引物ChPV-F1和引物ChPV-R的靶序列含有特異DNA分子甲；所述特異DNA分子甲為如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列4所示的DNA分子；

(a2)將序列4經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子。

所述引物ChPV-F1和引物ChPV-R的靶序列具體可為所述特異DNA分子甲。

所述引物ChPV-F1具體為如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；

(b2)將序列1經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物ChPV-R具體為如下(b3)或(b4)：

(b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；

(b4)將序列2經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子。

所述引物組合還包括引物ChPV-F2；所述引物ChPV-F2和所述引物ChPV-R的靶序列含有特異DNA分子乙；所述特異DNA分子乙為如下(c1)或(c2)：

(c1)序列表的序列5所示的DNA分子；

(c2)將序列5經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的DNA分子。

所述引物ChPV-F2和引物ChPV-R的靶序列具體可為所述特異DNA分子乙。

所述引物ChPV-F2具體為如下(d1)或(d2)：

(d1)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；

(d2)將序列3經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子。

以上任一所述引物組合的用途為如下(e1)至(e4)中的任意一種：

(e1)鑒定待測(cè)病毒是否為雞細(xì)小病毒；

(e2)制備用于鑒定待測(cè)病毒是否為雞細(xì)小病毒的試劑盒；

(e3)鑒定待測(cè)樣本是否含有雞細(xì)小病毒；

(e4)制備用于鑒定待測(cè)樣本是否含有雞細(xì)小病毒的試劑盒。

本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述引物組合的應(yīng)用，為如下(e1)至(e4)中的任意一種：

(e1)鑒定待測(cè)病毒是否為雞細(xì)小病毒；

(e2)制備用于鑒定待測(cè)病毒是否為雞細(xì)小病毒的試劑盒；

(e3)鑒定待測(cè)樣本是否含有雞細(xì)小病毒；

(e4)制備用于鑒定待測(cè)樣本是否含有雞細(xì)小病毒的試劑盒。

本發(fā)明還保護(hù)含有以上任一所述所述引物組合的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下(f1)或(f2)：

(f1)鑒定待測(cè)病毒是否為雞細(xì)小病毒；

(f2)鑒定待測(cè)樣本是否含有雞細(xì)小病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定待測(cè)病毒是否為雞細(xì)小病毒的方法，包括如下步驟(g1)一(g3)：

(g1)提取待測(cè)病毒的基因組DNA；

(g2)以步驟(g1)提取的基因組DNA為模板，采用所述引物ChPV-F1和引物ChPV-R進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；

(g3)以步驟(g2)得到的第一輪PCR產(chǎn)物為模板，采用所述引物ChPV-F2和所述引物ChPV-R進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，如果第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有176-196bp的DNA片段、待測(cè)病毒為或候選為雞細(xì)小病毒，如果第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中不含有176-196bp的DNA片段、待測(cè)病毒為或候選為非雞細(xì)小病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定待測(cè)病毒是否為雞細(xì)小病毒的方法，包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)病毒的基因組DNA中是否含有所述特異DNA分子甲，如果所述基因組DNA中含有所述特異DNA分子甲、待測(cè)病毒為或候選為雞細(xì)小病毒，如果所述基因組DNA中不含有所述特異DNA分子甲、待測(cè)病毒為或候選為非雞細(xì)小病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定待測(cè)病毒是否為雞細(xì)小病毒的方法，包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)病毒的基因組DNA中是否含有所述特異DNA分子乙，如果所述基因組DNA中含有所述特異DNA分子乙、待測(cè)病毒為或候選為雞細(xì)小病毒，如果所述基因組DNA中不含有所述特異DNA分子乙、待測(cè)病毒為或候選為非雞細(xì)小病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定待測(cè)樣本是否含有雞細(xì)小病毒的方法，包括如下步驟(h1)一(h3)：

(h1)提取待測(cè)樣本的總DNA；

(h2)以步驟(h1)提取的總DNA為模板，采用所述引物ChPV-F1和引物ChPV-R進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；

(h3)以步驟(h2)得到的第一輪PCR產(chǎn)物為模板，采用所述引物ChPV-F2和所述引物ChPV-R進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，如果第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有176-196bp的DNA片段、待測(cè)樣本含有或疑似含有雞細(xì)小病毒，如果第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中不含有176-196bp的DNA片段、待測(cè)樣本不含有或疑似不含有雞細(xì)小病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定待測(cè)樣本是否含有雞細(xì)小病毒的方法，包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)樣本的總DNA中是否含有所述特異DNA分子甲，如果所述總DNA中含有所述特異DNA分子甲、待測(cè)樣本含有或疑似含有雞細(xì)小病毒，如果所述總DNA中不含有所述特異DNA分子甲、待測(cè)樣本不含有或疑似不含有雞細(xì)小病毒。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定待測(cè)樣本是否含有雞細(xì)小病毒的方法，包括如下步驟:檢測(cè)待測(cè)樣本的總DNA中是否含有所述特異DNA分子乙，如果所述總DNA中含有所述特異DNA分子乙、待測(cè)樣本含有或疑似含有雞細(xì)小病毒，如果所述總DNA中不含有所述特異DNA分子乙、待測(cè)樣本不含有或疑似不含有雞細(xì)小病毒。

以上任一所述176-196bp的DNA片段具體為186bp的DNA片段。

所述DNA片段具體可為如下(i1)或(i2)：

(i1)序列表的序列5所示的DNA分子；

(i2)與序列表的序列5具有97％以上同源性的DNA分子。

以上任一所述待測(cè)病毒具體可為雞細(xì)小病毒、雞新城疫病毒、馬立克病毒、H9亞型禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒或傳染性喉氣管炎病毒。

以上任一所述待測(cè)樣本具體可為雞病料，例如雞喉頭拭子、雞泄殖腔拭子、生鮮雞肉、生鮮雞內(nèi)臟、雞肉加工品、雞內(nèi)臟加工品等。

以上任一所述方法中，所述第一輪PCR擴(kuò)增的退火溫度具體為56.6℃。

以上任一所述方法中，所述第二輪PCR擴(kuò)增的退火溫度具體為54.3℃。

以上任一所述第一輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中，ChPV-F1和ChPV-R的濃度均為10pmol/μL。

以上任一所述第二輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中，ChPV-F2和ChPV-R的濃度均為10pmol/μL。

以上任一所述第一輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系(25μL)具體可為：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL(5.62fg-5.62ng)，ChPV-F1和ChPV-R各1μL，最后用ddH₂O補(bǔ)足至25.0μL。

以上任一所述第二輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系(25μL)具體可為：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL(5.62fg-5.62ng)，ChPV-F2和ChPV-R各1μL，最后用ddH₂O補(bǔ)足至25.0μL。

以上任一所述第一輪PCR的反應(yīng)程序具體可為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性15s，56.6℃退火30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，68℃延伸10min。

以上任一所述第二輪PCR的反應(yīng)程序具體可為：95℃預(yù)變性3min；94℃變性15s，54.3℃退火30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，68℃延伸10min。

本發(fā)明設(shè)計(jì)合成用于檢測(cè)ChPV的3條特異性引物，能成功擴(kuò)增出特異性目的片段，且優(yōu)化后的ChPV半巢式PCR能夠確保一定溫度范圍內(nèi)擴(kuò)增效率的相對(duì)平衡。特異性試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)表明，該ChPV半巢式PCR能夠成功擴(kuò)增出186bp的ChPV特異性片段，相反，對(duì)AIV H9、NDV、MDV、IBV、AILTV等5種病原體不敏感，具有良好的特異性；該ChPV半巢式PCR能檢出5.62fg的ChPV核酸模板，敏感性較高，能夠在臨床上滿足ChPV感染檢測(cè)的要求。

本發(fā)明建立的方法可用于快速檢測(cè)ChPV的感染、監(jiān)控雞群感染ChPV后的排毒情況及臨床上ChPV流行病學(xué)的監(jiān)測(cè)，具有簡(jiǎn)便快速、特異性好、敏感性高等特點(diǎn)，本發(fā)明為ChPV的快速檢測(cè)提供了新方法，對(duì)有效防制該病毒引起的疫病具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例2中半巢式PCR反應(yīng)優(yōu)化對(duì)應(yīng)的電泳圖。

圖2為實(shí)施例3中特異性檢測(cè)對(duì)應(yīng)的電泳圖。

圖3為實(shí)施例4中敏感性檢測(cè)對(duì)應(yīng)的電泳圖。

圖4為實(shí)施例5中臨床樣品檢測(cè)對(duì)應(yīng)的電泳圖。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

雞細(xì)小病毒(chicken parvovirus，縮寫為ChPV)：參考文獻(xiàn)：Day J M，Zsak L.Determination and analysis of the full-length chicken parvovirus genome.[J].Virology，2010，399(1)：59-64.；公眾可以從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。

雞新城疫病毒(NDV)：參考文獻(xiàn)：謝芝勛，謝麗基，劉加波，等.禽流感和新城疫病毒半巢式熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].生物技術(shù)通訊，2008，19(3)：410-413.；公眾可以從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。

馬立克病毒(MDV)：參考文獻(xiàn)：鄧顯文，謝芝勛，謝志勤，等.雞傳染性貧血病毒病LAMP快速可視化檢測(cè)方法的建立[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，32(6)：57-60.；公眾可以從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。

H9亞型禽流感病毒(AIV H9)：參考文獻(xiàn)：謝芝勛，謝麗基，劉加波，等.禽流感和新城疫病毒半巢式熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].生物技術(shù)通訊，2008，19(3)：410-413.；公眾可以從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。

傳染性支氣管炎病毒(IBV)：參考文獻(xiàn)：謝芝勛，謝麗基，劉加波，等.禽流感和新城疫病毒半巢式熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].生物技術(shù)通訊，2008，19(3)：410-413.；公眾可以從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。

傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)：參考文獻(xiàn)：謝芝勛，謝麗基，劉加波，等.禽流感和新城疫病毒半巢式熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].生物技術(shù)通訊，2008，19(3)：410-413.；公眾可以從廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所獲得。

2×PCR Mix：寶生物工程(大連)有限公司。

實(shí)施例1、引物設(shè)計(jì)

進(jìn)行大量序列分析、比對(duì)獲得了用于鑒定雞細(xì)小病毒的若干引物。將各個(gè)引物進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，比較靈敏度、特異性等性能，最終得到用于鑒定雞細(xì)小病毒的一套引物組合。

用于鑒定雞細(xì)小病毒的特異性引物對(duì)由如下三條引物組成(5’→3’)：

ChPV-F1(序列表的序列1)：ATAACGATATCACTCAAGTTTCCAA；

ChPV-F2(序列表的序列2)：GCTGCAATCAGAGCAAGATG；

ChPV-R(序列表的序列3)：GGGTTGGTTAAATGGCAAAG。

實(shí)施例2、半巢式PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

1、提取雞細(xì)小病毒的基因組DNA。

2、取步驟1得到的基因組DNA作為模板，采用實(shí)施例1制備的引物組合進(jìn)行半巢式PCR。

(1)以步驟1得到的基因組DNA作為模板，采用引物ChPV-F1和引物ChPV-R進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增：

第一輪PCR的反應(yīng)體系(25.0μL)：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL(DNA含量為5.62ng)，ChPV-F1和ChPV-R各1μL，最后用ddH₂O補(bǔ)足至25.0μL。第一輪PCR反應(yīng)體系中，ChPV-F1和ChPV-R的濃度均為10pmol/μL。

第一輪PCR的反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；94℃變性15s，退火30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，68℃延伸10min。

分別設(shè)置如下退火溫度：

退火溫度I：52.0℃；

退火溫度II：52.8℃；

退火溫度III：54.3℃；

退火溫度IV：56.6℃；

退火溫度V：59.3℃；

退火溫度VI：61.6℃；

退火溫度VII：63.1℃；

退火溫度VIII：64.0℃。

將第一輪PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳并拍照。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定第一輪PCR的最佳退火溫度為56.6℃。

(2)將步驟(1)退火溫度為56.6℃的第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用ddH₂O稀釋100倍。

(3)以步驟(2)的稀釋液作為模板，采用引物ChPV-F2和引物ChPV-R進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增：

第二輪PCR的反應(yīng)體系(25.0μL)：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL，ChPV-F2和ChPV-R各1μL，最后用ddH₂O補(bǔ)足至25.0μL。第二輪PCR反應(yīng)體系中，ChPV-F2和ChPV-R的濃度均為10pmol/μL。

第二輪PCR的反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；94℃變性15s，退火30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，68℃延伸10min。

分別設(shè)置如下退火溫度：

退火溫度I：52.0℃；

退火溫度II：52.8℃；

退火溫度III：54.3℃；

退火溫度IV：56.6℃；

退火溫度V：59.3℃；

退火溫度VI：61.6℃；

退火溫度VII：63.1℃；

退火溫度VIII：64.0℃。

將半巢式PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳并拍照。

第二輪PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1中，泳道1-8依次對(duì)應(yīng)退火溫度I-VIII時(shí)得到的PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，M對(duì)應(yīng)100bp DNA Marker。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定第二輪PCR最佳退火溫度為54.3℃。

根據(jù)以上結(jié)果，確定半巢式PCR的最佳反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

第一輪：95℃預(yù)變性3min；94℃變性15s，56.6℃退火30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，68℃延伸10min。

第二輪：95℃預(yù)變性3min；94℃變性15s，54.3℃退火30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，68℃延伸10min。

實(shí)施例3、特異性

1、提取待測(cè)樣本的基因組DNA。待測(cè)樣本分別為：雞細(xì)小病毒(ChPV)、馬立克病毒(MDV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)。

2、提取待測(cè)樣本的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。待測(cè)樣本分別為：雞新城疫病毒(NDV)、H9亞型禽流感病毒(AIV H9)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)。

3、分別將步驟1得到的各個(gè)基因組DNA樣本、步驟2得到的各個(gè)eDNA樣本作為模板，采用實(shí)施例1制備的引物組合進(jìn)行半巢式PCR。

(1)以步驟1得到的各個(gè)基因組DNA樣本、步驟2得到的各個(gè)eDNA樣本作為模板，采用引物ChPV-F1和引物ChPV-R進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增：

第一輪PCR的反應(yīng)體系(25.0μL)：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL(DNA或cDNA的含量為5.62ng)，ChPV-F1和ChPV-R各1μL，最后用ddH₂O補(bǔ)足至25.0μL。第一輪PCR反應(yīng)體系中，ChPV-F1和ChPV-R的濃度均為10pmol/μL。設(shè)置用等體積水作為模板的陰性對(duì)照。

第一輪PCR的反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；94℃變性15s，56.6℃退火30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，68℃延伸10min。

(2)將步驟(1)的第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用ddH₂O稀釋100倍。

(3)以步驟(2)的稀釋液作為模板，采用引物ChPV-F2和引物ChPV-R進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增：

第二輪PCR的反應(yīng)體系(25.0μL)：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL，ChPV-F2和ChPV-R各1μL，最后用ddH₂O補(bǔ)足至25.0μL。第二輪PCR反應(yīng)體系中，ChPV-F2和ChPV-R的濃度均為10pmol/μL。

第二輪PCR的反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；94℃變性15s，54.3℃退火30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，68℃延伸10min。

將半巢式PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳并拍照。

結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2中，1為ChPV基因組DNA的半巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2為NDV cDNA的半巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，3為MDV基因組DNA的半巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，4為AIV H9eDNA的半巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，5為IBV eDNA的半巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，6為ILTV基因組DNA的半巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，M對(duì)應(yīng)100bp DNA Marker，N對(duì)應(yīng)陰性對(duì)照的半巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，ChPV擴(kuò)增出186bp的特異性條帶(經(jīng)測(cè)序，如序列表的序列5所示)，而NDV、MDV、AIV H9、IBV、ILTV均無(wú)特異性條帶出現(xiàn)。

實(shí)施例4、敏感性

1、提取雞細(xì)小病毒的基因組DNA。

2、用ddH₂O 10倍梯度稀釋步驟1得到的基因組DNA溶液，得到各個(gè)稀釋液。

3、取步驟2得到的各個(gè)稀釋液作為模板，采用實(shí)施例1制備的引物組合進(jìn)行半巢式PCR。

(1)以步驟2得到的各個(gè)稀釋液作為模板，采用引物ChPV-F1和引物ChPV-R進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增：

第一輪PCR的反應(yīng)體系(25.0μL)：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL，ChPV-F1和ChPV-R各1μL，最后用ddH₂O補(bǔ)足至25.0μL。第一輪PCR反應(yīng)體系中，ChPV-F1和ChPV-R的濃度均為10pmol/μL。設(shè)置用等體積水作為模板的陰性對(duì)照。

由于采用的稀釋液的稀釋度不同，形成如下不同的反應(yīng)體系：

反應(yīng)體系1中，雞細(xì)小病毒DNA的初始含量為5.62ng；

反應(yīng)體系2中，雞細(xì)小病毒DNA的初始含量為562pg；

反應(yīng)體系3中，雞細(xì)小病毒DNA的初始含量為56.2pg；

反應(yīng)體系4中，雞細(xì)小病毒DNA的初始含量為5.62pg；

反應(yīng)體系5中，雞細(xì)小病毒DNA的初始含量為562fg；

反應(yīng)體系6中，雞細(xì)小病毒DNA的初始含量為56.2fg；

反應(yīng)體系7中，雞細(xì)小病毒DNA的初始含量為5.62fg；

反應(yīng)體系8中，雞細(xì)小病毒DNA的初始含量為0.56fg。

第一輪PCR的反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；94℃變性15s，56.6℃退火30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，68℃延伸10min。

(2)將步驟(1)的第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用ddH₂O稀釋100倍。

(3)以步驟(2)的稀釋液作為模板，采用引物ChPV-F2和引物ChPV-R進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增：

第二輪PCR的反應(yīng)體系(25.0μL)：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL，ChPV-F2和ChPV-R各1μL，最后用ddH₂O補(bǔ)足至25.0μL。第二輪PCR反應(yīng)體系中，ChPV-F2和ChPV-R的濃度均為10pmol/μL。

第二輪PCR的反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；94℃變性15s，54.3℃退火30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，68℃延伸10min。

將半巢式PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳并拍照。

結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3中，泳道1-8依次對(duì)應(yīng)采用反應(yīng)體系1-8時(shí)半巢式PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，M對(duì)應(yīng)100bp DNA Marker，N對(duì)應(yīng)陰性對(duì)照的半巢式PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，最低能檢測(cè)到5.62fg的ChPV。

實(shí)施例5、臨床樣品檢測(cè)

待測(cè)樣本為：2014年10月-2016年11月采集的48份雞病料(雞喉頭、泄殖腔雙棉拭子)。

1、提取待測(cè)樣本的總DNA。

2、將步驟1得到的總DNA作為模板，采用實(shí)施例1制備的引物組合進(jìn)行半巢式PCR。

(1)以步驟1得到的總DNA作為模板，采用引物ChPV-F1和引物ChPV-R進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增：

第一輪PCR的反應(yīng)體系(25.0μL)：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL(DNA的含量為5.62ng)，ChPV-F1和ChPV-R各1μL，最后用ddH₂O補(bǔ)足至25.0μL。第一輪PCR反應(yīng)體系中，ChPV-F1和ChPV-R的濃度均為10pmol/μL。

第一輪PCR的反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；94℃變性15s，56.6℃退火30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，68℃延伸10min。

(2)將步驟(1)的第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用ddH₂O稀釋100倍。

(3)以步驟(2)的稀釋液作為模板，采用引物ChPV-F2和引物ChPV-R進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增：

第二輪PCR的反應(yīng)體系(25.0μL)：2×PCR Mix 12.5μL，模板1μL，ChPV-F2和ChPV-R各1μL，最后用ddH₂O補(bǔ)足至25.0μL。第二輪PCR反應(yīng)體系中，ChPV-F2和ChPV-R的濃度均為10pmol/μL。

第二輪PCR的反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3min；94℃變性15s，54.3℃退火30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，68℃延伸10min。

部分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4中，M對(duì)應(yīng)100bp DNA Marker，泳道1-24依次對(duì)應(yīng)48份雞病料中24份的檢測(cè)結(jié)果(泳道1、7、9、16、17和19顯示ChPV陽(yáng)性結(jié)果)。48份雞病料中共檢出8份ChPV陽(yáng)性病料。五次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果一致。將顯示ChPV陽(yáng)性結(jié)果的泳道中的特異條帶回收并測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果與序列5的同源性高達(dá)97％。

<110> 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所

<120> 鑒定雞細(xì)小病毒的特異引物組合及其應(yīng)用

<130> GNCYXMN162087

<160> 5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

ataacgatat cactcaagtt tccaa 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 2

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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gggttggtta aatggcaaag 20

<210> 4

<211> 239

<212> DNA

<213> 雞細(xì)小病毒

<400> 4

ataacgatat cactcaagtt tccaacagga atgccatctc aacagttcat gcagctgcaa 60

ttagagcaag atgcctaaaa ttcacgttta acaattggct aacttcaaat tggggattga 120

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tggatagtct cctaagagat catcccgaat ttaacgggac tttgccctat aatcaaccc 239

<210> 5

<211> 186

<212> DNA

<213> 雞細(xì)小病毒

<400> 5

gctgcaatta gagcaagatg cctaaaattc acgtttaaca attggctaac ttcaaattgg 60

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caaccc 186