本發(fā)明涉及的是一種紫外熒光分子探針3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺的合成及其對亞硝酸根的檢測，屬于有機發(fā)光材料領域。

背景技術：

亞硝酸鹽主要指亞硝酸鈉（nano2）和亞硝酸鉀(kno2)，為白色或微黃色結晶或顆粒狀粉末，稱為工業(yè)食鹽。由于對肉質食品有護色、抑菌、增強肉質風味的作用，因此亞硝酸鹽被當作發(fā)色劑、防腐劑而應用于肉類制品中，但是亞硝酸鹽具有較強的氧化性，大量攝入可使血紅蛋白（fe^2＋）變成高鐵血紅蛋白（fe^3＋），失去輸氧能力，導致組織缺氧，并對周圍血管有擴張作用；另外硝酸鹽是高致癌n-亞硝基化合物產生的重要前體物質，n-亞硝基化合物包括亞硝胺和亞硝酰胺，前者在體內經酶激活后成為致癌物，后者不需任何代謝激活即能在胃中直接誘發(fā)腫瘤。同時，no2^-的過量攝入會引起諸如流產，嬰兒高鐵血紅蛋白癥，新生兒中樞神經缺陷，食道癌等諸多疾病，是威脅人類健康的重大隱患。目前，格里斯試劑（griess）比色法和2,3-二氨基萘試劑熒光法是檢測亞硝酸根離子最常用的兩種方法。但是這兩種方法檢測亞硝酸根離子時，都需要多種試劑組合，其中格里斯方法的試劑是由對氨基苯磺酰胺水溶液和萘乙二胺的磷酸溶液混合制得，需要避光冷藏儲存，半小時內用完，并且試劑儲存困難，檢測步驟繁瑣、復雜，耗時長。因此建立一種簡便、高靈敏度檢測亞硝酸根的方法對于保障人體生命安全具有重要的應用價值。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明內容

鑒于上述，本發(fā)明的目的是一種紫外熒光分子探針3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺的合成。

本發(fā)明的另一目的是該紫外熒光分子探針對亞硝酸根的檢測。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)：

一種紫外熒光分子探針3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺合成

a．將20ml甲苯、25ml乙醇、6ml超純水加入到150ml的圓底燒瓶中混合搖勻，將混合溶劑在-70攝氏度的液氮中冷凍，抽真空至真空度0.08mpa，將圓底燒瓶放在室溫下，置換氬氣，解凍，溶劑溶解后再次放入液氮中冷凍，抽真空，置換氬氣，上述步驟再重復一次，將溶劑中的溶解氧除凈，溶液保存在氬氣氛圍下，作為下一步反應的溶劑；

b．向帶有回流冷凝管裝置250ml的兩口圓底燒瓶中加入3-溴-4-氨基-n-丙基-1,8-萘二甲酸亞胺，碳酸鉀，3-（n,n-二甲基氨基）苯基硼酸鹽酸鹽，在催化劑四三苯基膦鈀條件下，密封接口處，氬氣保護，將上述除凈氧的溶劑用注射器注入燒瓶，90攝氏度回流36h，反應結束后，將體系冷卻至室溫，減壓濃縮溶劑得到粗產品，粗產品通過硅膠柱柱層析，層析液二氯甲烷和甲醇體積比為50:1，洗脫，分離得到紫外熒光分子探針——3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺。

紫外熒光分子探針3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺的合成結構式如下：

紫外熒光分子探針3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺的理化性質：

3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺（c24h25n3o2）是易溶于水的黃色固體，其分子量為387.1947，熔點為158-166攝氏度。

紫外熒光分子探針測定亞硝酸根的機理。

在酸性條件下，亞硝酸根進攻3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺的氨基位點，發(fā)生消去反應，消去水分子，生成11-正丁基-2-二甲氨基-10h-苯基甲酰[c]異喹啉[4,5-gh]鄰二氮萘-10,12(11h)-二酮。探針的熒光發(fā)射產生波長產生60nm的斯托克斯位移，通過體系熒光信號的改變與亞硝酸根離子濃度間的線性關系，實現(xiàn)對實際樣品中的亞硝酸根的快速定性定量檢測。同時，3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺與no2^﹣作用后，生成了11-正丁基-2-二甲氨基-10h-苯基甲酰[c]異喹啉[4,5-gh]鄰二氮萘-10,12(11h)-二酮，其顏色變?yōu)樽仙f明3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺探針可以通過顏色變化對no2^﹣實現(xiàn)定性的識別。

本發(fā)明的優(yōu)點和產生的有益效果：

本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術的不足之處。利用3-溴-4-氨基-n-丙基-1,8-萘二甲酸亞胺，碳酸鉀，3-（n,n-二甲基氨基）苯基硼酸鹽酸鹽合成了紫外熒光分子探針3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺。探針與亞硝酸根反應后生成11-正丁基-2-二甲氨基-10h-苯基甲酰[c]異喹啉[4,5-gh]鄰二氮萘-10,12(11h)-二酮，其紫外吸收最大波長為550nm處，最強熒光發(fā)射在600nm處。本發(fā)明用于各類水和肉類樣品的亞硝酸根的含量測定，可以檢測出水和肉類樣品中的亞硝酸根的含量，最低檢測限分別為390nm和52nm，探針響應速度快，1分鐘內可達響應平衡，對于保障人體健康產生積極的作用。本發(fā)明合成的紫外熒光分子探針3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺光學性質穩(wěn)定，儲存時間長，特異性好，靈敏度高，響應迅速，是一種快捷的檢測亞硝酸根的方法。

附圖說明

圖1為所合成的3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺的¹h譜。

圖2為所合成的3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺的¹³c譜。

圖3為所合成的3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺的高分辨質譜圖。譜圖中388.2016[m+h⁺]為3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺的分子離子峰。

圖4為3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺與亞硝酸根反應后產物的高分辨質譜圖，譜圖中399.1814[m+h⁺]為11-正丁基-2-二甲氨基-10h-苯基甲酰[c]異喹啉[4,5-gh]鄰二氮萘-10,12(11h)-二酮的分子離子峰。

圖5為3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺的紫外吸收光譜

圖6為11-正丁基-2-二甲氨基-10h-苯基甲酰[c]異喹啉[4,5-gh]鄰二氮萘-10,12(11h)-二酮的紫外吸收光譜(b)

測試體系為20μm3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺，20μmnano2，1mol/lhcl。

圖7為3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺的熒光發(fā)射光譜

圖8為11-正丁基-2-二甲氨基-10h-苯基甲酰[c]異喹啉[4,5-gh]鄰二氮萘-10,12(11h)-二酮的熒光發(fā)射光譜

測試體系為20μm3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺，20μmnano2，1mol/lhcl。

圖9為3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺與no2^﹣在不同作用時間下的熒光強度變化

測試體系為20μm3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺，20μmnano2，1mol/lhcl。

圖10為3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺與各種被分析物作用的紫外吸收光譜

圖11為3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺與各種被分析物作用的熒光發(fā)射光譜

測試體系為20μm3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺，20μmnano2，1mol/lhcl。

圖12為3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺與不同濃度的no2^﹣作用后的紫外-可見吸收光譜變化

圖13為3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺與不同濃度的no2^﹣作用后的紫外最大吸收強度與no2^﹣濃度的線性關系

測試體系為20μm3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺，20μmnano2，1mol/lhcl，no2^﹣:0,2.0,4.0,6.0,8.0,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,35,40μm。

圖14為3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺與不同濃度的no2^﹣作用后的熒光發(fā)射光譜變化

圖15為3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺與不同濃度的no2^﹣作用后的最大熒光強度與no2^﹣濃度的線性關系

測試體系為20μm3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺，20μmnano2，1mol/lhcl，no2^﹣:0,2.0,4.0,6.0,8.0,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,35,40μm。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例及實驗例對本發(fā)明技術方案再做進一步說明：

實施例1

將20ml甲苯、25ml乙醇、6ml超純水加入到150ml的圓底燒瓶中混合搖勻，將混合溶劑在-70攝氏度的液氮中冷凍，抽真空至真空度0.08ppm，將圓底燒瓶放在室溫下，置換氬氣，解凍，溶劑溶解后再次放入液氮中冷凍，抽真空，置換氬氣，上述步驟再重復一次，將溶劑中的溶解氧除凈，溶液保存在氬氣氛圍下，作為下一步反應的溶劑；

向帶有回流冷凝管裝置250ml的兩口圓底燒瓶中加入0.2805g3-溴-4-氨基-n-丙基-1,8-萘二甲酸亞胺，0.7015g碳酸鉀，0.5081g3-（n,n-二甲基氨基）苯基硼酸鹽酸鹽，在5%四三苯基膦鈀催化下，密封接口處，氬氣保護，將上述除凈氧的溶劑用注射器注入燒瓶，90攝氏度回流36h，反應結束后，將體系冷卻至室溫，減壓濃縮溶劑得到粗產品，粗產品通過硅膠柱柱層析，層析液二氯甲烷和甲醇體積比為50:1，洗脫，分離得到紫外熒光分子探針——3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺，產率為75%，該分子化學性質穩(wěn)定，可長期儲存不變質。

將探針3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺，溶于1mol/l的鹽酸溶液，向其中加入不同含有亞硝酸根的樣品，1分鐘后，觀察其顏色變化，同時用紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜，記錄其吸收和發(fā)射光譜的變化，通過顏色和光譜性質的改變測定亞硝酸根的含量。

探針合成后用核磁共振波譜儀對產物進行測試，得到其氫譜圖1，證明有25個氫原子，其化學位移數(shù)據為：

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ=8.59,8.57,8.45,8.17,8.15,7.67,7.65,7.63,7.38,7.36,7.36,7.34,7.26,6.83,6.81,6.79,6.79,6.78,6.77,6.77,5.21,4.19,4.17,4.16,3.00,1.74,1.73,1.72,1.71,1.70,1.70,1.69,1.68,1.47,1.45,1.43,1.41,1.25,0.98,0.96,0.95.

得到其碳譜圖2，證明有24個碳原子其化學位移數(shù)據為：

¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ=166.15,165.72,152.74,147.45,140.08,136.47,132.50,131.45,130.48,128.64,126.63,124.98,124.62,121.83,118.45,114.60,113.48,113.10,78.83,78.51,78.19,42.01,41.52,31.82,21.92,15.39.

高分辨質譜圖3顯示其分子量為esi-msm/z(m+h⁺)=388.2016。

以上表征證明了化合物3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺合成成功。

下面，本發(fā)明通過高分辨質譜、紫外吸收光譜、熒光發(fā)射光譜實驗對紫外熒光分子探針3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺對亞硝酸根的檢測性能進行了試驗。

1.高分辨質譜試驗

合成成功后，首先本發(fā)明研究了3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺分子與亞硝酸根的作用機理。

向3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺中加入20μm的no2^﹣，室溫條件下孵化1min(hcl:1mol/l)后，在m/z:399.1816處出現(xiàn)11-正丁基-2-二甲氨基-10h-苯基甲酰[c]異喹啉[4,5-gh]鄰二氮萘-10,12(11h)-二酮的分子離子峰（圖4），分子離子峰的出現(xiàn)證明了11-正丁基-2-二甲氨基-10h-苯基甲酰[c]異喹啉[4,5-gh]鄰二氮萘-10,12(11h)-二酮的形成，這與推測的反應機理的是一致。

2.紫外熒光試驗

測定3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺與11-正丁基-2-二甲氨基-10h-苯基甲酰[c]異喹啉[4,5-gh]鄰二氮萘-10,12(11h)-二酮的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。

在酸性條件下測定（hcl:1mol/l）3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺與no2^﹣作用前后的紫外和熒光性質變化，首先本發(fā)明測定了3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺和11-正丁基-2-二甲氨基-10h-苯基甲酰[c]異喹啉[4,5-gh]鄰二氮萘-10,12(11h)-二酮的紫外-可見吸收光譜，如圖5所示，在酸性條件下，3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺在445nm處有強烈的紫外吸收。而3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺與no2^﹣作用生成11-正丁基-2-二甲氨基-10h-苯基甲酰[c]異喹啉[4,5-gh]鄰二氮萘-10,12(11h)-二酮后，圖6顯示3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺在445nm處的紫外吸收降低，同時在360nm和550nm處出現(xiàn)新的紫外吸收峰。確定了該條件下3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺和11-正丁基-2-二甲氨基-10h-苯基甲酰[c]異喹啉[4,5-gh]鄰二氮萘-10,12(11h)-二酮的紫外-可見吸收光譜后，本發(fā)明測定了3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺和11-正丁基-2-二甲氨基-10h-苯基甲酰[c]異喹啉[4,5-gh]鄰二氮萘-10,12(11h)-二酮的熒光發(fā)射光譜，圖7顯示3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺在540nm處有強烈的熒光發(fā)射，而從圖8可以看出11-正丁基-2-二甲氨基-10h-苯基甲酰[c]異喹啉[4,5-gh]鄰二氮萘-10,12(11h)-二酮在600nm處有強烈的熒光發(fā)射。

3.響應時間實驗

確定了3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺和11-正丁基-2-二甲氨基-10h-苯基甲酰[c]異喹啉[4,5-gh]鄰二氮萘-10,12(11h)-二酮的吸收和發(fā)射光譜性質后，本發(fā)明對3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺與no2^﹣的作用時間進行了研究。圖9表明，3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺可以在60s內與no2^-達到反應平衡，其600nm處的熒光增強達到最大值（λex=570nm）。

4.選擇性實驗

為了研究3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺探針對no2^﹣的識別能力，本發(fā)明將3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺分別與被分析物so4^2﹣，no3^﹣，hpo4^﹣，ac^﹣，clo4^﹣，br^﹣，n3^﹣，cl^﹣，co3^2﹣，hco3^﹣，so3^2﹣，k^＋，al^3＋，mn^2＋，zn^2＋，fe^3＋，fe^2＋，mg^2＋，ca^2＋，cu^2＋，na^＋，co^2＋孵化1min，孵化完成后，用紫外-可見分光光度計記錄紫外吸收光譜，用熒光分光光度計記錄3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺在570nm激發(fā)波長下在600nm的熒光發(fā)射光譜。如圖10所示，當3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺與no2^﹣作用時，其紫外吸收光譜在370nm和550nm處出現(xiàn)新的吸收峰，熒光發(fā)射光譜在600nm處出現(xiàn)發(fā)射峰（圖11λex=570nm），而與其他被分析物作用后，其紫外和熒光光譜均無變化。這一結果證明，3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺可以對no2^-實現(xiàn)特異性的識別。

5.濃度滴定實驗

考察了3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺的響應時間和選擇性以后，本發(fā)明研究了3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺對于no2^﹣的定量檢測能力。本發(fā)明分別用紫外吸收和熒光發(fā)射光譜對其定量性能進行了考察。向不同體積的1mmol/lnano2中分別加入2.0μl3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺(10mm)，用1mol/l的hcl定容至1ml,，孵化1min。孵化完成后，用紫外-可見分光光度計記錄3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺及其與亞硝酸鈉反應后的產物11-正丁基-2-二甲氨基-10h-苯基甲酰[c]異喹啉[4,5-gh]鄰二氮萘-10,12(11h)-二酮的紫外吸收光譜，用熒光分光光度計記錄3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺在570nm激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜。由圖12可以看出，隨著no2^﹣濃度的增加，3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺在445nm處的紫外吸收降低，在370nm和550nm處出現(xiàn)新的紫外吸收峰，并且逐漸增強，此外，550nm處的吸收強度與no2^﹣(0-30μmol/l)的濃度呈現(xiàn)出了良好的線性關系（回歸方程y=0.01+0.011×[no2^﹣],r=0.992），檢出限(lod,s/n=3)可以達到0.39μm(σ=0.00144)（圖13）。

同時，如圖14所示，其熒光發(fā)射光譜也展現(xiàn)出了相同的趨勢，隨著no2^﹣的加入，3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺分子在540nm處的熒光發(fā)射降低，其600nm處的熒光發(fā)射逐漸增強，并且與no2^﹣(0-30μmol/l)的濃度呈現(xiàn)出了良好的線性關系（回歸方程y=69.65+10.91×[no2^﹣],r=0.993），檢出限(lod,s/n=3)可以達到52nm(σ=0.19)（圖15）。這一結果表明，3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺可以在紫外-可見吸收和熒光發(fā)射兩種模式下對no2^﹣進行定量分析。

6.黃河水、自來水、豬肉、雞肉中亞硝酸根的含量測定實驗

在系統(tǒng)的研究了3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺的光學性質以后，本發(fā)明將其應用于實際樣品中no2^﹣的含量測定。為此，本發(fā)明直接測定了黃河水樣中no2^﹣的含量，并且采用加標回收的方法測定了自來水樣和肉類樣品中no2^﹣的含量。實驗測得的四種不同實際樣品中no2^﹣的含量與傳統(tǒng)的griess方法測定的結果相近（見表1,2）。

表1，表2證明了3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺可以應用于實際樣品中no2^﹣的定量測試。具體方法為：

a.樣品處理

黃河水樣取自黃河蘭州段，所取得水樣用0.45μm的微孔濾膜過濾；

自來水樣取自實驗室用水，向50ml的自來水樣中加入250μlnano2(10mm)，用0.45μm的微孔濾膜過濾；精確稱取2.3806g的豬肉，攪碎，用超純水定容至80ml，超聲15min后，75^oc下加熱5min，冷卻至室溫，取出45ml，用超純水定容至50ml，離心(800r,5min)，用0.45μm的微孔濾膜過濾后備用；精確稱取2.3596g的豬肉，攪碎，加入500μlnano2(10mm)，用超純水定容至80ml，超聲15min后，75^oc下加熱5min，冷卻至室溫，取出45ml，用超純水定容至50ml，離心(800r,5min）,用0.45μm的微孔濾膜過濾后備用；精確稱取2.3432g的雞肉，攪碎，用超純水定容至80ml，超聲15min后，75^oc下加熱5min，冷卻至室溫，取出45ml，用超純水定容至50ml，離心(800r,5min)，用0.45μm的微孔濾膜過濾后備用；精確稱取2.3571g的雞肉，攪碎，加入500μlnano2(10mm)，用超純水定容至80ml，超聲15min后，75^oc下加熱5min，冷卻至室溫，取出45ml，用超純水定容至50ml，離心(800r,5min)，用0.45μm的微孔濾膜過濾后備用。

b.本發(fā)明與griess法測定實際樣品中no2^﹣含量的比照：

griess試劑配制：

稱取50mg對氨基苯磺酰胺，用超純水定容至50ml得1%的對氨基苯磺酰胺；稱取500mg萘乙二胺，用5%的磷酸定容至50ml得到1%的萘乙二胺。將1%對氨基苯磺酰胺與1%萘乙二胺按照體積比1:1混合，得到griess試劑，避光冷藏儲存，半小時內用完。

標準曲線建立，向100μl的griess試劑中，分別加入(0,15,30,75,150,225,300.0μl)的nano2(1mm)，用超純水定容至1ml，搖勻，室溫孵化30min后，記錄其在波長為548nm處的吸光度數(shù)值。并根據濃度與吸光度的關系繪制標準曲線。

建立曲線后，取2.9ml上述處理好的實際樣品，加入100μl的griess試劑，搖勻，室溫孵化30min，記錄其在波長為548nm處的吸光度數(shù)值。根據標準曲線計算實際樣品中的亞硝酸根含量。

本發(fā)明用紫外吸收光譜法和熒光發(fā)射光譜法測定實際樣品中no2^﹣含量

紫外法測定實際樣品中no2^﹣含量

取2.9ml上述處理好的實際樣品，分別加入2μl的3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺，搖勻，室溫孵化1min，用紫外-可見分光光度計記錄其紫外吸收光譜。

熒光法測定實際樣品中no2^﹣含量

取2.9ml上述處理好的實際樣品，分別加入2μl的3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺，搖勻，室溫孵化1min，用熒光分光光度計記錄570nm的激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜。

測試結果表明黃河水中的亞硝酸根含量為：

表1.黃河水樣中的no2^﹣含量測定

測試結果表明自來水、豬肉、雞肉中的亞硝酸根含量分別為：

通過對紫外熒光分子探針3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺及其與亞硝酸反應生成的產物11-正丁基-2-二甲氨基-10h-苯基甲酰[c]異喹啉[4,5-gh]鄰二氮萘-10,12(11h)-二酮的光學性質研究，證明了本發(fā)明合成的紫外熒光分子探針3-二甲氨基苯基-4-氨基-n-丁基-1,8-萘二甲酸亞胺可以通過紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的分析方式實現(xiàn)對no2^﹣的測定，相比傳統(tǒng)的griess方法，本發(fā)明光學性質穩(wěn)定，特異性好，靈敏度高，響應迅速，僅需一步即可以完成對亞硝酸根的檢測，探針更易于保存，操作更加簡單，是一種快捷的檢測亞硝酸根的簡便方法。